Summary
Este estudo diz respeito ao desenvolvimento e padronização de um protocolo metodológico valioso para determinar toxicidade a longo prazo (14 dias) letal exercida por substâncias químicas, efluentes industriais ou esgotos e líquidos amostras ambientais sobre o crustáceo de água salgada,
Abstract
Nossas atividades de pesquisa sobre a utilização de métodos biológicos para a avaliação da qualidade ambiental, com particular referência à água salgada / água salobra e sedimentos. A escolha dos indicadores biológicos devem ser baseadas em conhecimentos científicos confiáveis e, possivelmente, sobre a disponibilidade de procedimentos padronizados. Neste artigo, apresentamos um protocolo padronizado que utilizou o crustáceo marinho Artemia para avaliar a toxicidade de produtos químicos e / ou marinhos matrizes ambientais. Os cientistas propõem que o camarão (Artemia) é um candidato adequado para o desenvolvimento de um bioensaio padrão para utilização em todo o mundo. Uma série de artigos têm sido publicados sobre os efeitos tóxicos de vários produtos químicos e substâncias tóxicas sobre Artemia salina (Artemia). A principal vantagem do presente crustáceo para estudos de toxicidade é a disponibilidade geral dos cistos secos; estes podem ser imediatamente utilizado no teste e de difícil cultivo não é exigido
Protocol
1. Método Padrão
O nosso teste envolve a exposição larvas de Artemia a um intervalo de concentrações da substância ou uma amostra de ensaio para a finalidade de determinar os níveis de concentração ou diluição que poderiam causar a morte de 50% dos organismos (CL 50) expostos ao longo de 14 dias e que satisfaça as condições definidas por este método. Se necessário e possível, a seguinte pode também ser determinada: a) o nível de concentração que causa a morte de 20% dos organismos expostos (LC 20), b) o nível de concentração mais elevada analisados que não determina uma maior taxa de mortalidade do que a do o controlo negativo (NOEC); a concentração mais baixa testada que determina, após 14 dias, uma maior taxa de mortalidade do que a do controle negativo (LOEC).
2. Testing Materials
2.1 ovos de Artemia
Para realizar testes, Artemia franciscana 5. Ovos ou cistos certificados utilizados para apoiar os testes estão disponíveis comercialmente, por exemplo, da Divisão de Pesquisa de Qualidade, EUA Agência de Proteção Ambiental, Cincinnati OH 45268, EUA ou do Laboratório de Pesquisas Biológicas da poluição aquática, Universidade de Ghent, na Bélgica.
2,2 diluição Água
Água salgada sintética pode ser usado como água de diluição, preparada por dissolução de reconhecidos reagentes de qualidade analítica ou uma formulação comercialmente disponível em água destilada ou desionizada. Misturas de sal para a criação do ideal de água salgada estão comercialmente disponíveis, por exemplo, as misturas Instant Ocean. Recomenda-se uma água de diluição, com uma salinidade igual a 35 (± 2) PSU, bem como uma concentração de oxigénio dissolvido superior a 80% do valor de saturação e uma temperatura de 25 (± 2) egraus; C. Após arejamento durante 48 horas e de filtração em filtros com uma porosidade de pelo menos 0,45, a diluição pode ser armazenado durante um máximo de 30 dias no escuro a uma temperatura de 0-4 ° C.
2,3 cultura de algas
Recomenda-se que os organismos de teste são alimentam de microalgas Dunaliella tertiolecta, que crescem exponencialmente e atingir densidades de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 células / ml. Testes em amostras ambientais requer culturas com densidades superiores a 2.0x10 6 células / ml 6. Sugere-se que Dunaliella tertiolecta cresce em meio de cultura contendo água do mar (30 (± 2) PSU e 20 (± 1) ° C) com a adição de nutrientes essenciais, minerais e vitaminas. Algumas indicações sobre a composição do meio de algas e preparação são apresentados no Apêndice. A densidade de células inicial é sugerido para ser de aproximadamente 10 5 células / ml. A cultura de algas é mantida numatermostato ambiente a 20 (± 1) ° C, iluminada com lâmpadas fluorescentes 3000 (± 300) lx, com um rácio de fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão.
Espécies de fitoplâncton Outros também poderia ser utilizado para a alimentação mas seria necessário fazer estudos comparativos com estas espécies de fitoplâncton para encontrar os "equivalentes" espécies a Dunaliella tertiolecta, porque as condições experimentais (por exemplo, densidades celulares iniciais, de iluminação com luz, temperatura, composição do meios de cultura e tempo de exposição) varia entre as espécies do fitoplâncton. Além da tolerância do microalgas para diferentes poluentes precisa ser considerado, porque os efeitos de poluentes sobre o crescimento e desenvolvimento de impacto fitoplâncton também para a Artemia.
2,4 substância de referência
A substância de referência no presente ensaio é dodecil sulfato de sódio.
2,5 de vidro para laboratório
- Recipientes de teste, incluindo 100 ml provetas de vidro de borossilicato (18 para executar os testes e 18 para a transferência de soluções).
- Um balão (por exemplo, frasco de 500 ml) para preparar a solução padrão.
- Seis frascos (por exemplo, 200 frascos ml) para preparar as soluções de teste.
- De vidro ou poliestireno 5 cm de diâmetro pratos de Petri com tampas removíveis para ser usado para activar os cistos e transferindo Artemia a partir do prato incubação para os recipientes de teste.
- Pipetas de vidro Pasteur (com pontas arredondadas por chama) para a transferência de náuplios.
- Vidro cânulas ou Pasteur 3 ml descartáveis pipetas de plástico (a ser cortado) para a transferência de Artemia.
- Micropipetas e pipetas graduadas para preparar as soluções de teste.
- Seis cilindros graduadas (por exemplo, 50 cilindros ml) para a transferência de soluções de teste a partir dos frascos para tele testando recipientes.
3. Ativação de cisto
3,1. Placas de Petri contendo cistos + de derramar água
Para gerar organismos de teste, 20 mg de cistos são colocados em uma placa de Petri contendo 12 ml de água de diluição 48 horas antes do teste.
3,2. De incubação na luz e no escuro
O prato Petri é mantida a 25 (± 2) ° C e à 4000 (± 1000) lux (lúmens por metro quadrado) a intensidade da luz durante uma hora.
3,3. Substituição do meio usando o microscópio
Após 24 horas, a incubação de larvas são transferidos para uma placa de Petri de novo cheio com água artificial. A transferência é realizada utilizando o microscópio, ou seja, usando uma fonte de luz de modo que a incubação de larvas, phototropic migram para o feixe de luz. Uma pipeta de Pasteur de vidro é usado para fazer a transferência, assegurando que apenas o nascente larvas are transferido e não os quistos ou as larvas ainda em membranas.
3,4. A incubação no escuro
O prato contendo as larvas é colocado numa câmara termostática escuro durante 24 horas a 25 (± 2) ° C.
4. Preparação das soluções de teste
4,1. Pesando a substância + transferir para o balão
Recomenda-se que a solução padrão para a substância de teste é preparado por dissolução de 0,5 g da substância em um balão de 500 ml. O balão é cheio com água desionizada ou destilada ea solução é agitada até que a substância de teste é completamente dissolvido. Soluções têm de ser preparadas no momento da utilização, salvo se não se sabe se a substância é estável em solução. Nesse caso, a solução padrão podem ser preparados até dois dias antes do teste.
4,2. Preparação do controlo negativo, adicionando a água de diluição e algas with a 10 ml de pipeta
O controlo negativo é preparada em um balão (por exemplo, o volume de 200 ml) por adição de uma alíquota da suspensão de algas para a água de diluição de modo que uma densidade de 10 5 células / ml é obtido.
4,3. Preparar as soluções de testes: a adição de água de diluição, as algas e uma solução padrão
Sugere-se que as soluções de teste são preparados em cinco balões de 200 ml por adição da solução padrão para a água de diluição nas quantidades especificadas de modo a que as concentrações desejadas para teste é obtido. Para alimentar os organismos, alíquotas de uma suspensão de microalgas Dunaliella tertiolecta pode ser utilizado e adicionado a atingir uma densidade de 10 5 células / ml quando as soluções de ensaio são preparados. A seguinte ordem de adição é recomendada: água de diluição, a suspensão de algas e solução padrão. Após a preparação das soluções de teste, eles têm de ser utilizados no ensaio o mais rapidamente possível.
4,4. Transferir a partir de soluções o balão para os recipientes de teste, em seguida, para as placas de Petri
Quantidades iguais (50 ml) das soluções de ensaio são introduzidos nos recipientes de ensaio, utilizando o cilindro graduado. Três réplicas para cada concentração são feitas. Para cada série de testes, um recipiente de controle é preparado com uma quantidade de água de diluição igual ao volume das soluções de ensaio. Volumes iguais (cerca de 12 ml) de as soluções de ensaio são introduzidos nas placas de Petri. Para cada série de testes, um prato de Petri de controlo é usado.
5. Preparação para Testes
5,1. Náuplios na fase II-III
Quarenta e oito horas após a activação do cisto, os náuplios atingir a II-III fase larval e são, em seguida, utilizável para o teste.
5,2. Náuplios ser transferido para as placas de Petri, usando o microscópio
A placa de Petri utilizado para cisto activação é levada para fora da câmara termostática. Uma pequena quantidade de larvas são transferidas para as placas de Petri contendo o controlo e as soluções de teste. Esta tarefa é para ser realizado com o microscópio utilizando uma pipeta de diâmetro suficientemente larga de modo que os organismos não ficar danificado. Nesta fase do ensaio, a transferência pode ser realizada com uma pipeta de Pasteur de vidro (com ponta arredondada à chama) e uma fonte de luz posicionada lateralmente que encoraja a Artemia a agregação.
5,3. Náuplios transferência a partir das placas de Petri em recipientes de teste com o microscópio
Dez larvas são transferidas a partir dos pratos de Petri de ensaio soluções para os recipientes de teste. Também esta operação tem que ser executada, utilizando a pipeta de Pasteur e microscópio. Recomenda-se que um volume não superior a 1 mL é transferido durante a passagem das larvas para não afectar o volume global de sistema de teste.
e_step "> 5.4 Os recipientes cheios cobertos com parafilmeAs provetas de ensaio são cobertos com parafilme (deixando um espaço para a passagem de ar), e mantido a uma temperatura de 25 (± 2) ° C durante toda a duração do teste e com uma iluminação de 900 (± 100) lx com um fotoperíodo proporção de 14 horas de luz e 10 horas de escuridão.
6. Substituindo o suplemento Médio e Alimentação
6,1. Controle da taxa de sobrevivência
Dois dias após o teste foi iniciado, e, em seguida, após dias 5, 7, 9 e 12, a Artemia é observada ao microscópio a fim de verificar a taxa de sobrevivência e para substituir o meio eo suplemento alimentar.
Número de organismos vivos é contado em cada contêiner de teste. Após a observação ao microscópio e estimulação mecânica leve (por exemplo, tocar as larvas com uma pipeta Pasteur de vidro) organismos que não apresentam algum movimento por cerca de 10 segundos deve ser considerado morto.
6,2. Preparação de uma solução de teste exibindo amostragem algas com uma pipeta de 10 ml e amostragem da substância a ser testada com uma micropipeta. Transferir a partir de soluções o balão com os recipientes de teste
Embora o teste, as soluções de teste devem ser periodicamente substituído, e preparado no mesmo dia em que eles são para ser usado. As soluções de ensaio são feitos a partir da solução padrão previamente preparada.
6,3. Transferência de Artemia, utilizando uma pipeta de Pasteur de corte, a partir dos recipientes de teste antigos para os três recipientes novos
A transferência de Artemia é realizada usando uma pipeta com um diâmetro suficientemente larga de modo a não danificar os organismos. Durante esta fase, de 3 ml de plástico pipeta de Pasteur (a ser cortado) pode ser utilizado.
6,4. As larvas num copo contendo quer Artemia vivo ou morto
Após 1 4 dias de exposição no final do teste, o número de sobreviventes larvas é contado e registado na folha de cálculo. LC 50 e / ou LC 20, NOEC e LOEC menos 14 dias, são calculados e registrados, bem como limites de confiança de 95% no caso de métodos apropriados, e de cálculo.
7. Os resultados representativos
No final do ensaio (14 dias), calcular a percentagem de mortalidade para cada concentração, de acordo com a seguinte fórmula:
(M s / N) * 100
Onde:
M s é o número médio de indivíduos morreram na amostra analisada
N é o número total de indivíduos expostos
Tabela 1 relata um exemplo de dados de um ensaio de (14d) com Artemia expostos a dodecil sulfato de sódio.
| Concentrações (mg / l) | "> Número de pessoas morreram em cada réplicaMortalidade (%) | |||
| Eu | II | III | ||
| Controle negativo | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Além disso, determinar oLC valor 50 por um lote Gaussian gráfica logarítmica ou utilizando métodos estatísticos adequados (por exemplo Spearman-Karber ou Método Probit). O cálculo da LC 50 para os dados da tabela 1 é 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Se a concentração máxima testada causou uma menor taxa de mortalidade de 50%, você não deve continuar para o cálculo do 50 LC valor que seria, então, não confiáveis ou até mesmo não-computável. Neste caso, no entanto, seria apropriado para repetir o ensaio, alargando a gama de concentrações testadas. Alternativamente, o LC 50 valor é mais correctamente expresso como maior do que a maior concentração testada, possivelmente indicando a percentagem de mortalidade na maior concentração testada ea concentração mais elevada que corresponde a uma nenhum efeito.
Os resultados são considerados válidos se no fim de testar as condições a seguir foram atendidos:
- a taxa de controle de mortalidade médiaé ≤ 20%;
- onde usando dodecil sulfato de sódio, o LC 50, 14 dias está incluído no 8,0 (± 5) mg / l de intervalo.
Se as condições acima não foram cumpridos, todos os dados obtidos com o mesmo lote de organismos devem ser considerados inválidos e repetidos testes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artemia é um dos organismos de teste mais valiosos disponíveis para testes de ecotoxicidade e de investigação feito até agora permite-nos afirmar que é possível manter várias opções relacionadas com Artemia uso em Toxicologia e Ecotoxicologia. As características que tornam este organismo em uma espécie com potencial para bioensaios são: uma ampla distribuição geográfica, alta adaptabilidade às condições ambientais adversas e nutrientes variados, cultura laboratorial relativamente simples e de manutenção, resistência à manipulação, de curto ciclo de vida, produção de prole grande e os existência de uma quantidade considerável de informações sobre algumas espécies. Uma crítica contra o uso de Artemia é referido a sua sensibilidade à exposição a produtos químicos: Estudos anteriores referem-se Artemia (teste de 24 horas de exposição) como uma espécie menos sensíveis para estudos de ecotoxicidade, quando comparado com outros organismos de teste sob as mesmas condições experimentais 3. A escolha dométodo de ensaio de ecotoxicidade é crucial neste domínio. Queríamos padronizar um método que tinha as mesmas condições de partida (náuplios como um organismo de teste, obtido a partir do uso de cistos) do protocolo de 24 horas de exposição 4, mas com tempos de exposição relativamente longo (14 dias) poderia proporcionar uma mais resposta sensível. Este protocolo permite certamente uma resposta mais sensível do que os testes agudos, mas ela não pode ser utilizado como um substituto para um teste de crónica, porque uma exposição de 14 dias não é relevante, se considerarmos o tempo de vida de estimativa de Artemia. A seleção do terminal para este método tem sido amplamente discutido. Inicialmente mortalidade, e crescimento (ou seja, comprimento da carapaça após 14 dias de exposição) foram selecionados, pois também queria garantir a observação de um efeito subletal de um teste de longa duração. No entanto, o ponto de extremidade subletal foi encontrado para ser menos sensível em comparação com a mortalidade 6. Por esta razão a mortalidade é o ponto de extremidade apenas mencionado no descriptíon do protocolo e no vídeo. Este achado é consistente com estudos de outros pesquisadores que observaram 7,8 que a sobrevivência é o desfecho mais sensível entre os considerados por eles (sobrevivência, crescimento e reprodução).
O método proposto é útil para avaliar a toxicidade de produtos químicos, efluentes e matrizes ambientais 9. No recurso que poderia ser interessante para testar outras sub-letais efeitos tóxicos crônicos, tais como biomarcadores (atividade enzimática, por exemplo) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Produzido por Loredana Manfra do Instituto para a proteção ambiental e à pesquisa (ISPRA-Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental) e Savorelli Federica da Agência Regional de Proteção Ambiental (Emilia-Romagna, Itália).
Os membros de referência para o subgrupo de trabalho sobre o crustáceo Artemia dentro do Grupo métodos biológicos - água salgada / água salobra e Sedimentos da Comissão UNICHIM da Qualidade da Água (Instituto para a operação de normalização técnica no sector químico).
Videografia e edição por Marco Pisapia de ISPRA (Unidade de Web).
Coordenação de Produção por Anna Maria Cícero e Magaletti Erika de ISPRA (Departamento de Monitoramento da Qualidade Ambiental).
Gostaríamos de agradecer à Agência Regional de Proteção Ambiental da Emilia-Romagna, Ferrara Branch, o Grupo de Métodos Biológicos - água salgada / salobraÁgua e Sedimentos da Comissão UNICHIM sobre Qualidade da Água e Migliore Luciana, da Universidade Tor Vergata (Roma) da sua cooperação; Boscolo Rossella e Massimo Gabellini de ISPRA (Departamento de Prevenção e Mitigação de Impactos) pelo apoio financeiro; Matassa Fabio e Londres Escola de Idiomas em Roma, pelo seu apoio linguístico.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
