Summary
Diese Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Standardisierung eines wertvollen methodischen Protokoll, um langfristig (14 Tage) letale Toxizität von chemischen Substanzen, industrielles Abwasser oder Abwasser und flüssigen Umweltproben auf dem Salzwasser Krustentier ausgeübt zu bestimmen,
Abstract
Unsere Forschungsaktivitäten gezielt den Einsatz von biologischen Methoden zur Beurteilung der Umweltqualität, insbesondere in Bezug auf Salzwasser / Brackwasser und Sediment. Die Wahl des biologischen Indikatoren müssen auf zuverlässigen wissenschaftlichen Erkenntnissen beruhen und möglicherweise auf die Verfügbarkeit von standardisierten Verfahren. In diesem Artikel präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll, das die Marine Krustentier Artemia verwendet, um die Toxizität von Chemikalien und / oder der Meeresumwelt Matrizen zu bewerten. Die Wissenschaftler schlagen vor, den Artemia (Artemia) ein geeigneter Kandidat für die Entwicklung eines Standard-Bioassay für die weltweite Nutzung ist. Eine Reihe von Arbeiten über die toxischen Wirkungen von verschiedenen Chemikalien und Schadstoffen auf Artemia (Artemia) veröffentlicht worden. Der große Vorteil dieses Krustentier für Studien zur Toxizität ist die allgemeine Verfügbarkeit der trockenen Zysten, diese können sofort in Tests verwendet werden und schwierige Anbau wird nicht verlangt
Protocol
1. Method Standard
Unsere Tests schließt ein, dass Artemia Larven auf ein Intervall von Stoffkonzentrationen oder einer Probe zum Zwecke der Bestimmung der Konzentration oder Verdünnung Ebenen, die den Tod von 50% der Organismen (LC 50) über 14 Tage ausgesetzt wäre und die die Bedingungen definiert nach diesem Verfahren. Wenn nötig und möglich, kann die folgende ermittelt werden: a) die Konzentration, die den Tod von 20% der Organismen ausgesetzt (LC 20) bewirkt, b) die höchste Konzentration analysiert Ebene, die nicht ermittelt, eine höhere Sterblichkeitsrate als die von Die negative Kontrolle (NOEC), die niedrigste getestete Konzentration, die bestimmt, nach 14 Tagen, eine höhere Sterblichkeit als die der Negativ-Kontrolle (LOEC).
2. Testing Materials
2,1 Artemiaeier
Um Tests durchzuführen, Artemia franciscana 5. Zertifizierte Eier oder Zysten eingesetzt, um Tests zu unterstützen sind im Handel erhältlich, zB von der Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA oder aus dem Labor für biologische Forschung in Wasserverschmutzung, Universität Gent, Belgien.
2,2 Wasserverdünnung
Synthetische Salzwasser kann als Verdünnungswasser verwendet werden, hergestellt durch Lösen von anerkannter analytischer Qualität Reagenzien oder eine kommerziell erhältliche Formulierung in destilliertem oder deionisiertem Wasser. Salz Mischungen für die Erstellung der ideale Salzwasser sind kommerziell erhältlich, zB die Instant Ocean Mischungen. Es wird eine Verdünnung Wasser mit einem Salzgehalt von 35 (± 2) empfohlen Netzteil sowie eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von mehr als 80% des Wertes der Sättigung und einer Temperatur von 25 (± 2) unddeg; C Nach Belüftung für 48 Stunden Filtration Filter mit einer Porosität von mindestens 0,45 um, kann die Verdünnung für maximal 30 Tage lang im Dunkeln bei einer Temperatur von 0-4 ° C gelagert werden
2,3 Algenkultur
Es wird empfohlen, Testorganismen ernähren sich von Dunaliella tertiolecta Mikroalgen, die exponentiell wachsen und erreichen Dichten von 1.3x10 6 sind - 2.0x10 6 Zellen / ml. Testen auf Umweltproben erfordert Kulturen mit einer Dichte höher als 2.0x10 6 Zellen / ml 6. Es wird vorgeschlagen, Dunaliella tertiolecta in einem Kulturmedium, enthaltend Meerwasser wächst (30 (± 2) Netzteil und 20 (± 1) ° C) mit Zusatz von Nährstoffen, Mineralien und Vitamine. Einige Angaben über die Algen-Medien Zusammensetzung und Herstellung sind in der Anlage berichtet. Die ersten Zelldichte wird vorgeschlagen, etwa 10 5 Zellen / ml betragen. Die Algenkultur wird in einer gepflegtenRaumthermostat auf 20 (± 1) ° C, beleuchtet mit Leuchtstofflampen 3000 (± 300) lx, mit einer Photoperiode Verhältnis von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit.
Andere Phytoplanktonarten könnte auch für die Fütterung verwendet werden, aber es wäre notwendig, um vergleichende Untersuchungen mit diesen Phytoplanktonarten machen, um die "gleichwertig" Spezies Dunaliella tertiolecta finden, weil die experimentellen Bedingungen (z. B. anfängliche Zelldichten, Beleuchtung, Temperatur, Zusammensetzung der Kulturmedien und Belichtungszeit) variiert zwischen Phytoplankton-Arten. Neben der Toleranz der Mikroalgen auf verschiedene Schadstoffe berücksichtigt werden muss, weil die Schadstoff-Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung des Phytoplanktons Auswirkungen auch auf die Artemia.
2,4 Referenzstoff
Als Referenzsubstanz bei diesem Test ist Natriumdodecylsulfat.
2,5 Laborglas
- Testen Behältern einschließlich 100 ml Borosilikatglas Becher (18 bis 18 Tests und Lösungen für die Übertragung durchzuführen).
- Ein Kolben (zB 500 ml-Kolben), um die Standard-Lösung herzustellen.
- Sechs Flaschen (zB 200 ml-Kolben), die Lösungen für die Prüfung vorzubereiten.
- Glas oder Polystyrol mit 5 cm Durchmesser Petrischalen mit abnehmbaren Bezügen, um für die Aktivierung der Zysten und Übertragen von Artemia aus dem Schlüpfen Gericht auf die Prüfung von Behältern verwendet werden.
- Glas Pasteur Pipette (mit Tipps von Flamme gerundet) für die Übertragung der Nauplien.
- Glas oder Kanülen Pasteur 3 ml Einweg-Kunststoff-Pipetten (zu schneidenden) zur Übertragung von Artemia.
- Mikropipetten und Messpipetten zur Herstellung der Testlösungen.
- Sechs Messzylinder (z. B. 50 ml Flaschen) zur Übertragung von Testlösungen aus den Flaschen zu ter testet Container.
3. Zyste Aktivierung
3.1. Petrischalen mit Zysten + Gießen von Wasser
Um Testorganismen zu erzeugen, werden 20 mg von Zysten in eine Petrischale mit 12 ml Verdünnungswasser 48 Stunden vor dem Test gestellt.
3.2. Die Inkubation in dem Licht und der Dunkelheit
Die Petrischale wird auf 25 (± 2) ° C und bei einer 4000 (± 1000) Lux (Lumen pro Quadratmeter) Lichtintensität für eine Stunde.
3.3. Ersetzen des Mediums mit dem Mikroskop
Nach 24 Stunden werden die schlüpfenden Larven in eine neue Petrischale mit künstlichen Wasser gefüllt sind. Die Übertragung erfolgt mit Hilfe des Mikroskops, dh mit einer Lichtquelle, so dass die Schraffur, phototrope Larven in Richtung des Lichtstrahls zu migrieren. Ein Glas Pasteur Pipette wird verwendet, um den Transfer zu machen, dass nur die im Entstehen begriffene Larven are übertragen und nicht die Zysten oder die Larven noch in Membranen.
3.4. Inkubation im Dunkeln
Die Schale mit den Larven in einem dunklen thermostatischen Kammer für 24 Stunden bei 25 (± 2) ° C
4. Erstellung von Lösungen für die Werkstoffprüfung
4.1. Wiegen der Substanz + in den Kolben übertragen
Es wird empfohlen, dass die Standard-Lösung für die Testsubstanz durch Auflösen von 0,5 g des Materials in einen 500 ml-Kolben hergestellt wird. Der Kolben wird mit entionisiertem oder destilliertem Wasser gefüllt und die Lösung wird gerührt, bis die Testsubstanz vollständig gelöst ist. Lösungen müssen zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden, wenn es nicht bekannt, ob die Substanz in Lösung stabiles. In diesem Fall kann die Standard-Lösung bis zu zwei Tage vor dem Testen hergestellt werden.
4.2. Vorbereiten der Negativ-Kontrolle, indem Verdünnungswasser und Algen with der 10 ml Pipette
Die negative Kontrolle wird in einen Kolben (z. B. 200 ml Volumen) mit indem ein Aliquot des Algensuspension dem Verdünnungswasser so daß eine Dichte von 10 5 Zellen / ml erhalten wird hergestellt.
4.3. Vorbereitung der Lösungen für die Prüfung: Zugabe von Verdünnung Wasser, Algen-und Standard-Lösung
Es wird vermutet, dass Lösungen für die Prüfung in fünf 200-ml-Flaschen werden durch Hinzufügen der Standard-Lösung für das Verdünnungswasser in den Mengen, so dass die gewünschten Konzentrationen zum Testen erhalten angegeben wird vorbereitet. Um die Organismen ernähren, kann Aliquots einer Dunaliella tertiolecta Mikroalgen Suspension verwendet werden und hinzugefügt werden eine Dichte von 10 5 Zellen / ml zu erreichen, wenn Lösungen für die Prüfung vorbereitet werden. Die folgende Reihenfolge der Zugabe wird empfohlen: Verdünnungswasser, Algensuspension und Standard-Lösung. Nach der Vorbereitung der Lösungen für die Prüfung, sie müssen in dem Test verwendet so bald wie möglich werden.
4.4. Übertragen von Lösungen aus dem Kolben zu den Tests Container, dann zu den Petrischalen
Gleiche Mengen (50 ml) der Test-Lösungen befinden sich im testing-Container unter Verwendung der Messzylinder eingeführt. Drei Repliken für jede Konzentration hergestellt werden. Für jede Reihe von Tests wird eine Steuerung Behälter mit einer Menge von Verdünnungswasser gleich dem Volumen der Testlösungen hergestellt. Gleiche Volumina (ca. 12 ml) der Testlösungen werden in die Petrischalen eingeführt. Für jede Testreihe wird eine Kontrolle Petrischale verwendet.
5. Vorbereitung für die Prüfungen
5.1. Nauplien auf der Bühne II-III
Achtundvierzig Stunden nach der Aktivierung Zyste, erreichen die Nauplien die II-III Larvenstadium und sind dann einsetzbar für die Prüfung.
5.2. Nauplien Transfer in die Petrischalen mit dem Mikroskop
Die Petrischale für Zyste verwendet Aktivierung wird der thermostatischen Kammer entnommen. Eine kleine Menge der Larven werden in die Petrischalen mit der Steuerung und die Lösungen für die Prüfung übertragen. Diese Aufgabe ist mit dem Mikroskop unter Verwendung einer Pipette ausreichend großen Durchmesser, so dass die Organismen nicht beschädigt werden durchgeführt werden. In dieser Phase des Tests, kann die Übertragung mit einer Pasteurpipette aus Glas (mit Spitze von Flamme gerundet) und eine seitlich angeordnete Lichtquelle, die den Artemia ermutigt zu aggregieren durchgeführt werden.
5.3. Nauplien Transfer von den Petrischalen in die Test-Container mit dem Mikroskop
Zehn Larven werden von den Testlösungen Petrischalen zu den Tests Container übertragen. Auch dieser Vorgang muss unter Verwendung des Pasteur-Pipette und Mikroskop durchgeführt werden. Es wird empfohlen, dass ein Volumen von 1 ml während der Passage der Larven übertragen wird nicht auf das Gesamtvolumen des Testsystems beeinflussen.
e_step "> 5.4. Full Container mit Parafilm bedecktDie Prüfung Bechergläser werden mit Parafilm (wobei ein Spalt für den Luftdurchgang) bedeckt, und bei einer Temperatur von 25 (± 2) ° C für die gesamte Dauer des Tests und bei einer Beleuchtungsstärke von 900 (± 100) lx einer Photoperiode Verhältnis von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit.
6. Ersetzen des Mediums und Nahrungsergänzung
6.1. Überlebensrate Kontrolle
Zwei Tage nach dem Test begonnen hat, und dann nach 5, 7, 9, und 12 Tage, wird der Artemia unter dem Mikroskop, um die Überlebensrate zu überprüfen und die mittel-und die Nahrungsergänzungsmittel ersetzen beobachtet.
Anzahl der lebenden Organismen wird in jedem Test-Container gezählt. Nach Beobachtung unter dem Mikroskop und leichte mechanische Reize (zB Berührung der Larven mit einem Glas Pasteurpipette) Organismen handelt, die mit etwas Bewegung für ca. 10 seconds sollte als tot betrachtet werden.
6.2. Herstellung einer Testlösung Es werden Algen Abtastung mit einer 10 ml-Pipette und die Entnahme von diesem Stoff mit einer Mikropipette getestet werden. Übertragen von Lösungen aus dem Kolben zu den Test-Container
Während des Tests müssen die Testlösungen regelmäßig ausgetauscht werden, und bereitete in selben Tag wie sie verwendet werden sollen. Die Testlösungen werden von der Standard-Lösung vorher zubereitet wird.
6.3. Artemia Übertragung unter Verwendung eines Cut Pasteurpipette aus den alten Test-Container auf die drei neuen Container
Die Übertragung von Artemia wird unter Verwendung einer Pipette mit einer ausreichend großen Durchmesser, um nicht die Organismen beschädigen durchgeführt. Während dieser Phase kann ein 3-ml-Kunststoff-Pasteurpipette (zu schneidenden) verwendet werden.
6.4. Larven in einem Becher, die entweder lebende oder tote Artemia
Nach 1 4 Tage der Exposition am Ende des Tests wird die Anzahl der überlebenden Larven gezählt und aufgezeichnet auf dem Arbeitsblatt. LC 50 und / oder LC-20, sind NOEC und LOEC bei 14 Tagen, berechnet und aufgezeichnet sowie Konfidenzintervall bei 95% gegebenenfalls und Berechnungsmethoden.
7. Repräsentative Ergebnisse
Am Ende des Tests (14 Tage), wird der Prozentsatz an Mortalität bei jeder Konzentration, gemäß der folgenden Formel:
(M s / N) * 100
Wo:
M s ist gestorben durchschnittliche Anzahl der Individuen in der analysierten Probe
N die Anzahl der exponierten Personen
Tabelle 1 zeigt ein Beispiel von Daten eines Tests (14d) mit Artemia ausgesetzt Natriumdodecylsulfat.
| Konzentrationen (mg / l) | "> Anzahl der verstorbenen Personen in jedem ReplikatMortalität (%) | |||
| Ich | II | III | ||
| Negative Kontrolle | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Außerdem bestimmen dieLC 50-Wert durch eine graphische Gauss-logarithmischer Auftragung oder mit geeigneten statistischen Methoden (zB Spearman-Karber oder Probit-Methode). Die Berechnung der LC 50 für die Daten der Tabelle 1 ist 8,18 (7,15-9,37) mg / l beträgt. Falls die maximale Konzentration eine niedrigere Mortalitätsrate von 50% verursacht getestet, sollten Sie nicht auf die Berechnung der LC 50-Wert, der dann wäre unzuverlässig oder gar nicht berechenbar vorzugehen. In diesem Fall wäre jedoch sinnvoll sein, den Test durch die Verlängerung der Bereich der getesteten Konzentrationen zu wiederholen. Alternativ wird die LC 50-Wert richtiger als größer als die höchsten getesteten Konzentration exprimiert, was möglicherweise auf den Prozentsatz der Mortalität bei der höchsten getesteten Konzentration und die höchste Konzentration entsprechend einer nicht durch.
Die Ergebnisse werden als gültig angesehen, wenn am Ende der Prüfung die folgenden Bedingungen erfüllt sind:
- des Steuerelements durchschnittliche Sterblichkeitsrate≤ 20%;
- wobei mit Natriumdodecylsulfat, die LC 50 nach 14 Tagen in der 8,0 (± 5) mg / l Intervall enthalten.
Wenn die oben genannten Bedingungen nicht erfüllt wurden, sollten alle Daten mit der gleichen Charge von Organismen gewonnen als ungültig betrachtet und Tests wiederholt.
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Discussion
Artemia ist eine der wertvollsten Testorganismen für Ökotoxizitätsuntersuchungen und Forschung bisher getan erlaubt uns zu behaupten, dass es möglich ist, mehrere Optionen im Zusammenhang mit Artemia Einsatz in Toxikologie und Ökotoxikologie zu erhalten. Die Merkmale, die diesen Organismus verwandeln in eine geeignete Arten für Bioassays sind: eine breite geografische Streuung, hohe Anpassungsfähigkeit an widrige Umgebungsbedingungen und abwechslungsreiche Nährstoffe, relativ einfachen Labor-Kultur und Pflege, Widerstandsfähigkeit gegen Manipulation, kurzen Lebenszyklus, große Nachkommenschaft Produktion und den daß es eine beträchtliche Menge an Informationen über einige Arten. Eine Kritik gegen den Einsatz von Artemia ist auf seine Empfindlichkeit gegenüber chemischen genannten Kredite: frühere Studien beziehen sich Artemia (Test auf 24 Stunden Exposition) als weniger empfindlich für Ökotoxizitätsstudien Arten, wenn sie mit anderen Testorganismen unter den gleichen Versuchsbedingungen 3 verglichen. Die Wahl derMethode zur Prüfung der Ökotoxizität ist in dieser Hinsicht entscheidend. Wir wollten eine Methode, die die gleichen Ausgangsbedingungen (Nauplien als Testorganismus, die aus der Nutzung von Zysten erhalten) des Protokolls zu 24 Stunden nach der Exposition 4 hatte standardisieren, aber mit relativ langen Belichtungszeiten (14 Tage) konnte eine mehr bieten sensibles Ansprechverhalten. Dieses Protokoll ermöglicht sicherlich eine empfindlichere Reaktion als die akute Tests aber es kann nicht als Ersatz für eine Dauerprüfung verwendet werden, da eine Exposition von 14 Tagen ist nicht relevant, wenn die Abschätzung der Lebensdauer Artemia betrachten. Der Endpunkt für die Auswahl dieser Methode wurde vielfach diskutiert. Zunächst sowohl die Mortalität und das Wachstum (dh Panzerlänge nach 14-tägiger Exposition) wurden ausgewählt, weil wir wollten auch, um die Beobachtung einer subletalen Wirkung für einen Langzeittest zu gewährleisten. Jedoch wurde die subletalen Endpunkt festgestellt, dass weniger empfindlich gegenüber Mortalität 6. Aus diesem Grund ist die Sterblichkeit nur Endpunkt in der descript erwähntIonen des Protokolls und in dem Video. Dieser Befund steht im Einklang mit Studien anderer Forscher, die 7,8, dass das Überleben ist der empfindlichste Endpunkt unter den von ihnen (Überleben, Wachstum und Fortpflanzung) als beobachtet.
Die vorgeschlagene Methode ist sinnvoll für die Beurteilung der Toxizität von Chemikalien, Abwasser und Umwelt-Matrizen 9. In der Funktion könnte es interessant sein, zu anderen subletalen chronische toxische Effekte, wie z. B. Biomarker (zB enzymatische Aktivität) 10 zu testen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Produziert von Loredana Manfra des Instituts für Umweltschutz und Forschung (ISPRA-Department of Environmental Quality Monitoring) und Federica Savorelli der Landesanstalt für Umweltschutz (Emilia-Romagna, Italien).
Referenz Mitglieder für die Sub-Arbeitsgruppe für die Artemia Krustentier innerhalb der biologischen Methoden Group - Salzwasser / Brackwasser und Sediment des Unichim Kommission auf die Wasserqualität (das Institut für technische Standardisierung Betriebssystem in der chemischen Industrie).
Videographie und Bearbeitung von Marco Pisapia von Ispra (Web-Unit).
Die Produktion Koordination von Anna Maria Cicero und Erika Magaletti von Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring).
Wir möchten das regionale Amt für Umweltschutz der Emilia-Romagna, Ferrara Branch, die biologische Methode Gruppe danken - Salzwasser / BrackwasserWasser und Sediment des Unichim Kommission für Wassergüte-und Luciana Migliore, der Universität Tor Vergata (Rom) für die gute Zusammenarbeit; Rossella Boscolo und Massimo Gabellini von Ispra (Abteilung für Prävention und Abmilderung der Auswirkungen) für ihre finanzielle Unterstützung; Fabio Matassa und dem London School of Languages in Rom für ihre sprachliche Unterstützung.
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