Summary
מחקר זה עוסק בפיתוח סטנדרטיזציה של פרוטוקול מתודולוגית חשוב לקבוע לטווח ארוך (14 יום) רעילות קטלני המופעל על ידי חומרים כימיים, שפכים תעשייתיים או ביוב דגימות סביבתיות נוזליים על לסרטן מים מלוחים,
Abstract
פעילויות המחקר שלנו למקד את השימוש בשיטות ביולוגיות לצורך הערכה של איכות הסביבה, תוך התייחסות מיוחדת מים מלוחים / מים מליחים ומשקעים. הבחירה של אינדיקטורים ביולוגיים חייב להיות מבוסס על ידע מדעי אמין, אולי, על זמינותם של נהלים אחידים. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי המשמש לסרטן ימית הארטמיה להעריך את רעילות של כימיקלים ו / או של מטריצות הסביבה הימית. המדענים מציעים כי ארטמיה (הארטמיה) הוא המועמד המתאים לפיתוח המבדק תקן ניצול ברחבי העולם. מספר מאמרים פורסמו על ההשפעות הרעילות של כימיקלים שונים על toxicants ארטמיה (הארטמיה). היתרון הגדול של לסרטן זה ללימודים רעילות הוא הזמינות הכללית של ציסטות יבשים אלה יכולים לשמש מיד בבדיקת וטיפוח קשה לא דרש
Protocol
1. שיטה סטנדרטית
בדיקה שלנו כרוך בחשיפת הזחלים הארטמיה למרווח של ריכוזי חומר או מדגם הבדיקה לצורך קביעת ריכוז או דילול לרמות שיגרמו למוות של 50% של האורגניזמים (LC 50) נחשף במהלך 14 יום ועמידה בתנאים המוגדרים בשיטה זו. אם יש צורך ואם ניתן לעשות זאת הבאה עשויה גם לקבוע: א) רמת הריכוז הגורם למוות של 20% של אורגניזמים שנחשפו (LC 20), ב) הריכוז הגבוה ביותר ברמה ניתחו כי אינו קובע שיעור תמותה גבוה יותר מזה של הביקורת השלילית (NOEC); הרמה הנמוכה ביותר ריכוז נבדק הקובע, לאחר 14 יום, שיעור תמותה גבוה יותר מזה של שליטה שלילי (LOEC).
2. בדיקת חומרים
2.1 הארטמיה ביצים
כדי לבצע בדיקות, הארטמיה franciscana 5. ביצים מוסמכים או ציסטות נוצלו כדי לתמוך בדיקות זמינים באופן מסחרי, למשל מתוך חטיבת המחקר של אבטחת איכות, ארה"ב המשרד להגנת הסביבה, OH 45268 בסינסינטי, ארה"ב או מהמעבדה למחקר ביולוגי בזיהום Aquatic, אוניברסיטת גנט, בלגיה.
2.2 מים לדילול
מלח סינתטי עשוי לשמש מים לדילול, שהוכנה על ידי המסת חומרים כימיים המוכרים איכות אנליטיות או ניסוח זמינים מסחרית במים מזוקקים או דה מיונן. תערובות מלח ליצירת מים מלוחים אידיאלי זמינים באופן מסחרי, למשל, את תערובות האוקיינוס מיידיות. מומלץ דילול במים עם מליחות השווה ל 35 (± 2) PSU כמו גם ריכוז החמצן המומס של יותר מ -80% מהשווי של הרוויה בטמפרטורה של 25 (± 2) &מעלות: ג לאחר אוורור במשך 48 שעות ו אוורור מסננים עם נקבוביות של לפחות 0.45 מיקרומטר, דילול ניתן לאחסן לתקופה מקסימלית של 30 ימים בחושך בטמפרטורה של 0-4 ° C.
2.3 אצות תרבות
מומלץ אורגניזמים הבדיקה הם ניזונים microalgae tertiolecta דונליאלה, אשר גדלים באופן אקספוננציאלי ולהגיע בצפיפות של 1.3x10 6 - 2.0x10 6 תאים למ"ל. בדיקות על דגימות סביבתיות דורש תרבויות עם צפיפויות גבוהות יותר מ 2.0x10 6 תאים למ"ל 6. הוא הציע כי דונליאלה tertiolecta גדל מדיה ותרבות המכילים מי ים (30 (± 2) PSU ו 20 (± 1) מעלות צלזיוס) עם תוספת של חומרים מזינים חיוניים, מינרלים וויטמינים. כמה סימנים על הרכב מדיה הכנה אצות והם דיווחו בנספח. צפיפות התא הראשוני מומלץ להיות כ 10 5 תאים למ"ל. התרבות אצות נשמר ב תרמוסטט חדר 20 (± 1) מעלות צלזיוס, מואר עם מנורות פלורסנט (3000 ± 300) LX, עם יחס photoperiod של 16 שעות של אור 8 שעות חושך.
מינים אחרים הפיטופלנקטון יכול לשמש גם למטרות האכלה אך יהיה צורך לעשות מחקרים השוואתיים עם מינים אלה הפיטופלנקטון למצוא את "שווה ערך" ממין דונליאלה tertiolecta, כי תנאי הניסוי (למשל, צפיפות התאים הראשונים, תאורה אור, טמפרטורה, הרכב בתקשורת תרבות וזמן החשיפה) משתנה בין המינים הפיטופלנקטון. מלבד הסובלנות של microalgae למזהמים שונים שצריך לקחת בחשבון כי ההשפעות מזהמים על צמיחה ופיתוח של השפעה הפיטופלנקטון גם הארטמיה.
2.4 עיון בחומר
חומר העזר במבחן זה Dodecyl נתרן גופרתי.
2.5 מעבדה זכוכית
ss = "jove_content"> בנוסף לציוד המעבדה הרגילה, החומר שלהלן נדרש:
- בדיקת מכולות כולל 100 מ"ל כוסות ההתכה של זכוכית בורו (18 לבצע בדיקה 18 להעברת פתרונות).
- צפחת (למשל בקבוק 500 מ"ל) כדי להכין את הפתרון הסטנדרטי.
- שש צלוחיות (למשל 200 צלוחיות מ"ל) להכין את פתרונות בדיקה.
- זכוכית או קלקר 5 ס"מ קוטר צלחות פטרי עם מכסה נשלף לשמש להפעלת ציסטות והעברת הארטמיה מצלחת הבקיעה את מיכלי בדיקה.
- זכוכית פסטר בטפי להחדרת נוזלים (עם טיפים מעוגלות על ידי להבה) להעברת nauplii.
- זכוכית cannulae או פסטר 3 מ"ל בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק חד פעמיות (יש לחתוך) להעברת הארטמיה.
- Micropipettes ו טפטפות לסיום הטיפול להכין את פתרונות בדיקה.
- שישה צילינדרים הדרגתיים (למשל 50 צילינדרים מ"ל) להעברת פתרונות בדיקה מן הבקבוקים כדי לאהוא בודק מכולות.
3. ציסטה הפעלת
3.1. צלחות פטרי המכילות ציסטות + שפיכת מים
כדי לייצר אורגניזמים הבדיקה, 20 מ"ג של ציסטות ממוקמים בתוך צלחת פטרי המכילה 12 מ"ל מים לדילול 48 שעות לפני הבדיקה.
3.2. הדגירה של האור בחושך
צלחת פטרי נשמר 25 (± 2) מעלות צלזיוס, ב 4000 (± 1000) לוקס (לומן למ"ר) עוצמת האור למשך שעה אחת.
3.3. החלפת בינוני באמצעות מיקרוסקופ
לאחר 24 שעות, הזחלים הבקיעה מועברים לתוך צלחת פטרי חדש מלא מים מלאכותי. ההעברה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ, כלומר באמצעות מקור אור כך, הבקיעה הזחלים שפנה אל האור נודדים כלפי קרן אור. פסטר זכוכית פיפטה משמש לביצוע העברה, על מנת להבטיח כי רק הזחלים ar המתהווהדואר העבירה ולא את ציסטות או זחלים עדיין ממברנות.
3.4. הדגירה בחושך
מנה המכילה את הזחלים ממוקם בתא תרמוסטטי כהה במשך 24 שעות בכל 25 (± 2) ° C.
4. הכנת פתרונות בדיקה
4.1. שקילת חומר + להעביר בקבוק
מומלץ פתרון סטנדרטי עבור חומר בדיקות מוכן על ידי המסת 0.5 גרם של החומר בבקבוק 500 מ"ל. בקבוק מלא מים עם דה מיונן או מזוקקים והפתרון הוא עורר עד חומר בדיקות נמס לגמרי. הפתרונות צריכים להיות מוכנים בזמן השימוש, אלא אם כן לא ידוע אם החומר הוא יציב בתמיסה. במקרה זה, הפתרון הסטנדרטי עשוי להיות מוכן עד יומיים לפני הבחינה.
4.2. הכנת הביקורת השלילית, הוספת מים לדילול ואצות Wiה 10 מ"ל פיפטה
בקרה שלילית מוכן בבקבוק (למשל 200 מ"ל נפח) על ידי הוספת aliquot ההשעיה אצות למים דילול כך צפיפות של 10 5 תאים למ"ל מתקבל.
4.3. הכנת פתרונות בדיקה: הוספת מים אצות דילול, והפתרון הסטנדרטי
הוא הציע פתרונות בדיקה מוכנים בעוד חמש צלוחיות 200 מ"ל על ידי הוספת הפתרון תקן למים דילול בכמויות שצוינו כך הריכוזים הרצוי לבדיקה מתקבל. כדי להאכיל את היצורים, aliquots של השעיה microalgae דונליאלה tertiolecta ניתן להשתמש והוסיף להגיע צפיפות של 10 5 תאים למ"ל כאשר פתרונות בדיקה מוכנים. לפי הסדר הבא של בנוסף מומלץ: דילול במים, השעיה אצות פתרון סטנדרטי. לאחר הכנה של פתרונות בדיקה, הם צריכים לשמש assay בהקדם האפשרי.
4.4. העברת פתרונות מן הבקבוק אל מיכלי בדיקה, אחר כך את צלחות פטרי
כמויות שוות (50 מ"ל) של פתרונות בדיקה מוכנסים המיכלים בדיקה ניצול גליל בוגר. שלושה העתקים של ריכוז כל מבוצעים. עבור כל סדרה של בדיקות, מכולה מלאה מוכנה עם כמות מים לדילול שווה לנפח של פתרונות בדיקה. כמויות שוות (כ -12 מ"ל) של פתרונות בדיקה מוכנסים על צלחות פטרי. עבור כל סדרה של בדיקות, צלחת פטרי השליטה משמש.
5. הכנה לבחינות
5.1. Nauplii בשלב II-III
ארבעים ושמונה שעות לאחר הפעלת ציסטה, nauplii מגיעים לשלב II ו-III הזחל שמישים מכן לבדיקה.
5.2. Nauplii העברת לתוך צלחות פטרי באמצעות מיקרוסקופ
צלחת פטרי המשמש ציסטה ההפעלה לקוחה מתוך החדר תרמוסטטי. כמות קטנה של זחלים מועברים לתוך צלחות פטרי המכילות את השליטה ואת הפתרונות בדיקה. משימה זו היא שיש לבצע עם מיקרוסקופ ניצול פיפטה של קוטר רחב מספיק כך אורגניזמים לא להיפגע. בשלב זה של הבדיקה, העברת ניתן לבצע עם פיפטה פסטר זכוכית (עם קצה מעוגל על ידי להבה) ומקור אור מיקומו רוחבית המעודדת הארטמיה לצבור.
5.3. Nauplii העברה מן צלחות פטרי לתוך מכולות בדיקה עם מיקרוסקופ
עשרת הזחלים מועברים הפתרונות מנות בדיקות פטרי את מיכלי בדיקה. גם פעולה זו צריכה להתבצע על ידי שימוש פיפטה פסטר ומיקרוסקופ. מומלץ בנפח שאינו עולה על 1 מ"ל מועבר במהלך המעבר של הזחלים לא להשפיע על היקף כולל של מערכת הבדיקה.
e_step "> 5.4. מכולות מלאות מכוסה parafilmכוסות הבדיקה מכוסים parafilm (השארת רווח למעבר אוויר), וכן לשמור על טמפרטורה של 25 (± 2) מעלות צלזיוס למשך כל המבחן ועל הארה של 900 (± 100) LX עם photoperiod יחס של 14 שעות אור 10 שעות חושך.
6. התקנה מחדש של מוסף בינוני ומזון
6.1. שיעור ההישרדות השליטה
יומיים לאחר הבדיקה החלה, ואז אחרי 5 ימים, 7, 9, 12, הארטמיה הוא ציין תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את שיעור ההישרדות להחליף בינוני תוסף מזון.
מספר אורגניזמים חיים נספר במיכל כל הבדיקה. לאחר תצפית תחת מיקרוסקופ וגירוי מכני קלה (למשל נגיעה הזחלים עם פיפטה פסטר זכוכית) אורגניזמים שלא להראות קצת תנועה על 10 שלeconds יש לשקול מת.
6.2. הכנת פתרון מבחן מראה הדגימה אצות עם פיפטה 10 מ"ל ו דגימה של חומר להיבדק עם micropipette. העברת פתרונות מהבקבוק כדי המכולות הבדיקה
בעוד בדיקות, פתרונות הבדיקה יש להחליף מדי פעם, ומוכן באותו יום כפי שהם לשמש. פתרונות בדיקה עשויים פתרון סטנדרטי שהוכן קודם לכן.
6.3. העברת הארטמיה, ניצול פסטר חתך פיפטה, החל מכלי הבדיקה הישנים לשלושת מכולות חדשים
העברה של הארטמיה מבוצעת באמצעות פיפטה עם קוטר רחב מספיק כדי לא לגרום נזק אורגניזמים. בשלב זה, 3 מ"ל פיפטה פסטר מפלסטיק (לגזור) ניתן להשתמש.
6.4. הזחלים בכוס המכילה גם הארטמיה חי או מת
אחרי 1 4 ימים של חשיפה בסוף הבדיקה, מספר לשרוד הזחלים נספר ונרשם בגליון. LC 50 ו / או LC 20, NOEC ו LOEC על 14 ימים, מחושבים והקליט, כמו גם מגבלות ביטחון על 95% שבו שיטות המתאימות ולאחר חישוב.
7. נציג תוצאות
בסוף המבחן (14 ימים), לחשב את אחוז התמותה בריכוז זה, על פי הנוסחה הבאה:
(M S / N) * 100
איפה:
M s הוא המספר הממוצע של אנשים שמתו במדגם ניתח
N הוא המספר הכולל של אנשים שנחשפו
1 מציגה דוגמאות של נתוני הבדיקה (14d) עם הארטמיה חשופים נתרן גופרתי Dodecyl.
| ריכוז (מ"ג / ל ') | "> מספר האנשים שמתו העתק כלהתמותה (%) | |||
| אני | ב ' | ג | ||
| בקרה שלילית | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1.56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3.12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6.25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12.5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50.0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
יתר על כן, לקבוע אתLC 50 ערך העלילה גאוס גרפי לוגריתמי או שימוש בשיטות סטטיסטיות מתאימות (למשל ספירמן-Karber או שיטה רווחים לא). חישוב LC 50 עבור נתוני לוח 1 הוא 8.18 (7.15-9.37) מ"ג / ליטר. אם את הריכוז המרבי נבדק גרם שיעור התמותה נמוך יותר של 50%, אתה לא צריך להמשיך בחישוב הערך LC 50 אשר היה אז להיות לא אמין או אפילו לא חשיב. במקרה זה, עם זאת, ראוי לחזור על הבדיקה על ידי הרחבת טווח הריכוזים שנבדקו. לחלופין, הערך LC 50 באה לידי ביטוי יותר נכון כמו גדול הריכוז הגבוה ביותר במבחן, מה שיכול לרמז על אחוז התמותה בריכוז הגבוהה ביותר נבדק הריכוז הגבוה ביותר המתאים הועיל.
תוצאות נחשבים תקף אם בסופה של בדיקה התנאים הבאים מולאו:
- השליטה של שיעור התמותה הממוצעהוא ≤ 20%;
- שם משתמש נתרן גופרתי Dodecyl, LC 50 ב -14 יום כלולה 8.0 (± 5) מ"ג / ליטר מרווח.
אם התנאים הנ"ל לא מולאו כל הנתונים שהושגו עם קבוצה דומה של אורגניזמים יש לקחת בחשבון לא חוקי ובדיקה חוזרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הארטמיה הוא אחד היצורים הבדיקה הערך הרב ביותר עבור בדיקות ecotoxicity מחקר שנעשה עד כה מאפשר לנו לקבוע כי אפשר לקיים מספר אפשרויות הקשורות לשימוש הארטמיה ב טוקסיקולוגיה Ecotoxicology. המאפיינים שהופכים את האורגניזם למין מתאימים bioassays הם: פיזור גיאוגרפי רחב, הסתגלות גבוהה לתנאי סביבה קשים וחומרים מזינים שונים, תרבות מעבדה פשוטה יחסית ותחזוקה, עמידות מניפולציה, מחזור חיים קצר, ייצור צאצאים גדול ואת קיומה של כמות ניכרת של מידע על מינים מסוימים. הביקורת נגד השימוש הארטמיה נקרא רגישותו חשיפות כימיים: מחקרים קודמים מתייחסים הארטמיה (מבחן חשיפה שעות 24) כמין רגישים פחות ללימודי ecotoxicity, בהשוואה לאורגניזמים אחרים הבדיקה תחת תנאי הניסוי זהים 3. הבחירה שלשיטה לבדיקה ecotoxicity הוא חיוני בהקשר זה. רצינו לבצע סטנדרטיזציה שיטה היו תנאי הפתיחה זהה (nauplii כאורגניזם הבדיקה, המתקבל משימוש ציסטות) לפרוטוקול ל -24 שעות של חשיפה 4, אבל עם זמני חשיפה ארוכים יחסית (14 ימים) יכול לספק יותר רגישות התגובה. פרוטוקול זה בהחלט מאפשר מענה רגיש יותר במבחני חדות אבל זה לא יכול לשמש תחליף לבדיקה כרונית בגלל חשיפה של 14 ימים אינו רלוונטי, אם נחשוב על אומדן תוחלת החיים של הארטמיה. בחירת נקודת הסיום של שיטה זו נדונה בהרחבה. בתחילה הן התמותה וצמיחה (אורך שריון כלומר לאחר חשיפה של 14 יום) נבחרו, כי אנחנו גם רוצים להבטיח תצפית של השפעת sublethal למבחן ארוך טווח. עם זאת, נקודת הסיום sublethal נמצא להיות רגיש פחות לעומת התמותה 6. מסיבה זו התמותה היא נקודת הסיום רק מוזכר descriptיון של פרוטוקול וגם וידאו. ממצא זה עולה בקנה אחד עם מחקרים של חוקרים אחרים 7,8 שהבחינו כי הישרדות היא נקודת הסיום הרגיש ביותר בין אלה נחשבים על ידם (, הישרדות גידול ורבייה).
השיטה המוצעת היא שימושית להערכת רעילות של כימיקלים, שפכים ומטריצות הסביבה 9. תכונה זה יכול להיות מעניין לבחון אחרים תת קטלניים השפעות רעילות כרוניות, כגון סמנים ביולוגיים (כלומר הפעילות האנזימטית) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
הופק על ידי Loredana Manfra של מכון המחקר להגנה על הסביבה (Ispra-מחלקת ניטור איכות הסביבה) ו פדריקה Savorelli של הסוכנות האזורית לאיכות הסביבה (Emilia-Romagna, איטליה).
התייחסות חברי עבור קבוצת המשנה העבודה על הארטמיה לסרטן בקבוצת שיטות ביולוגיות - מים מלוחים / מים מליחים ומשקעים של ועדת UNICHIM על איכות המים (המכון הפעלה תקינה טכנית במגזר כימי).
Videography ועריכה על ידי מרקו Pisapia של Ispra (יחידת האינטרנט).
תיאום הפקה של אנה מריה קיקרו אריקה Magaletti של Ispra (מחלקת ניטור איכות הסביבה).
אנו רוצים להודות הסוכנות האזורית לאיכות הסביבה של אמיליה, רומניה, פררה סניף, קבוצת שיטות ביולוגיות - מים מלוחים / מליחיםמים ומשקעים של ועדת UNICHIM על איכות המים לוסיאנה Migliore, Tor Vergata האוניברסיטה (רומא) על שיתוף הפעולה, Rossella Boscolo ו מאסימו Gabellini של Ispra (החוג למניעת הקלה של השפעות) על התמיכה הכספית, פאביו Matassa של לונדון בית הספר לשפות ברומא על התמיכה הלשונית שלהם.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
