Summary
Este estudio se refiere al desarrollo y la estandarización de un protocolo metodológico para determinar el valor a largo plazo (14 días) toxicidad letal ejercida por las sustancias químicas, aguas residuales industriales o de aguas residuales y líquidos de muestras ambientales en el crustáceo de agua salada,
Abstract
Nuestras actividades de investigación como objetivo el uso de métodos biológicos para la evaluación de la calidad ambiental, con especial referencia al agua salada / agua salobre y de sedimentos. La elección de los indicadores biológicos debe estar basada en el conocimiento científico confiable y, posiblemente, de la disponibilidad de procedimientos normalizados. En este artículo, presentamos un protocolo estandarizado que se utiliza el medio marino crustáceo Artemia para evaluar la toxicidad de productos químicos y / o de matrices ambientales marinas. Los científicos proponen que la artemia (Artemia) es un candidato adecuado para el desarrollo de un bioensayo estándar para la utilización en todo el mundo. Una serie de documentos han sido publicados sobre los efectos tóxicos de diversos productos químicos y sustancias tóxicas en artemia (Artemia). La principal ventaja de este crustáceo de los estudios de toxicidad es la disponibilidad total de los quistes secos, los cuales pueden ser inmediatamente utilizado en las pruebas y difícil cultivo no se exigió
Protocol
1. Método Estándar
Nuestras pruebas consiste en exponer larvas de Artemia a un intervalo de concentraciones de la sustancia o de una muestra de ensayo con el fin de determinar los niveles de concentración o dilución que pudieran causar la muerte del 50% de los organismos (CL 50) expuestos durante 14 días y cumplir con las condiciones definidas por este método. Si es necesario y posible, la siguiente también se puede determinar: a) el nivel de concentración que provoca la muerte de un 20% de los organismos expuestos (LC 20), b) el más alto nivel de concentración analizada que no determina una tasa de mortalidad superior a la de el control negativo (NOEC); el menor nivel de concentración de ensayo que determina, después de 14 días, una tasa de mortalidad mayor que la del control negativo (LOEC).
2. Ensayo de Materiales
2.1 huevos de Artemia
Para llevar a cabo las pruebas, Artemia franciscana 5. Los huevos o quistes certificados utilizados para la realización de análisis están disponibles comercialmente, por ejemplo, de la División de Control de Calidad Investigación, EE.UU. Agencia de Protección Ambiental, Cincinnati, OH 45268, EE.UU. o desde el Laboratorio de Investigaciones Biológicas de la Contaminación Acuática de la Universidad de Gante, Bélgica.
2,2 agua de dilución
Agua salada sintética se puede utilizar como agua de dilución, preparada por disolución de reconocidos reactivos de calidad analítica o una formulación disponible comercialmente en agua destilada o desionizada. Mezclas de sal para crear el agua salada ideal son comercialmente disponibles, por ejemplo, las mezclas del Océano instantáneos. Se recomienda un agua de dilución con una salinidad igual a 35 (± 2) PSU, así como una concentración de oxígeno disuelto de más de 80% del valor de saturación y una temperatura de 25 (± 2) y°, C. Después de aireación durante 48 horas y la filtración en filtros con una porosidad de al menos 0,45 m, la dilución se pueden almacenar durante un máximo de 30 días en la oscuridad a una temperatura de 0-4 ° C.
2.3 cultivo de algas
Se recomienda que los organismos de ensayo son alimentan de microalgas Dunaliella tertiolecta, que crecen exponencialmente y alcanzar densidades de 1.3x10 6 - 2.0x10 6 células / ml. Las pruebas en muestras del medio ambiente requiere de cultivos con densidades superiores a 2.0x10 6 células / ml 6. Se sugiere que Dunaliella tertiolecta crece en un medio de cultivo con agua de mar (30 (± 2) fuente de alimentación y 20 (± 1) ° C) con la adición de nutrientes esenciales, minerales y vitaminas. Algunas indicaciones sobre la composición de las algas y la preparación de los medios de comunicación se presentan en el Apéndice. La densidad celular inicial se sugiere a ser aproximadamente 10 5 células / ml. El cultivo de algas se mantiene en untermostato de ambiente a 20 (± 1) ° C, sistema de iluminación con lámparas fluorescentes de 3000 (± 300) lx, con una relación fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
Otras especies de fitoplancton también podría ser utilizado para la alimentación, pero sería necesario realizar estudios comparativos con estas especies de fitoplancton para encontrar el "equivalente" las especies de Dunaliella tertiolecta, debido a las condiciones experimentales (por ejemplo, densidades celulares iniciales, iluminación de luz, temperatura, composición de medios de cultivo y tiempo de exposición) varía entre las especies de fitoplancton. Además de la tolerancia de las microalgas a diferentes contaminantes debe tenerse en cuenta debido a los efectos contaminantes sobre el crecimiento y desarrollo de impacto fitoplancton también a la Artemia.
2.4 Sustancia de referencia
La sustancia de referencia en este ensayo es dodecil sulfato de sodio.
2,5 de vidrio para laboratorio
- Contenedores de prueba con 100 vasos de vidrio de borosilicato (18 ml para realizar las pruebas y 18 para la transferencia de soluciones).
- Un matraz (por ejemplo 500 matraz ml) para preparar la solución estándar.
- Seis frascos (por ejemplo 200 matraces ml) para preparar las soluciones de prueba.
- Vidrio o poliestireno 5 cm de diámetro placas de Petri con desprendible cubre a ser utilizado para la activación de los quistes y transferir Artemia desde el plato de la eclosión de los recipientes de ensayo.
- Pipetas Pasteur de vidrio (con las puntas redondeadas por la llama) para la transferencia de los nauplios.
- De vidrio o de cánulas desechables Pasteur 3 ml pipetas de plástico (para cortar) para la transferencia de Artemia.
- Micropipetas y pipetas graduadas para preparar las soluciones de pruebas.
- Seis cilindros graduados (por ejemplo 50 cilindros ml) para la transferencia de soluciones de evaluación de los matraces a tél probando contenedores.
3. Quiste de activación
3,1. Placas de Petri que contienen quistes + verter el agua
Para generar organismos de ensayo, 20 mg de quistes se colocan en una placa de Petri que contiene 12 ml de agua de dilución 48 horas antes del ensayo.
3,2. La incubación en la luz y en la oscuridad
La placa de Petri se mantiene a 25 (± 2) ° C y en un 4000 (± 1000) lux (lúmenes por metro cuadrado) intensidad de la luz durante una hora.
3,3. Sustitución del medio utilizando el microscopio
Después de 24 horas, las larvas de la eclosión se transfieren a una nueva placa de Petri llena de agua artificial. La transferencia se realiza utilizando el microscopio, es decir, utilizando una fuente de luz de modo que la eclosión, las larvas fototrópico migrar hacia el haz de luz. Una pipeta Pasteur de vidrio se utiliza para realizar la transferencia, asegurando que solamente el naciente larvas are transferido y no los quistes o las larvas todavía en las membranas.
3,4. La incubación en la oscuridad
El plato que contiene las larvas se coloca en una cámara termostática oscuridad durante 24 horas a 25 (± 2) ° C.
4. Preparación de las soluciones de prueba
4,1. Un peso de la sustancia + Introducir en el matraz
Se recomienda que la solución estándar para la sustancia de prueba se preparó disolviendo 0,5 g de la sustancia en un matraz de 500 ml. El matraz se llena con agua desionizada o destilada y la solución se agita hasta que la sustancia de pruebas se ha disuelto completamente. Las soluciones tienen que ser preparados en el momento de uso, a menos que no se sabe si la sustancia es estable en solución. En ese caso, la solución estándar se pueden preparar hasta dos días antes de la prueba.
4,2. Preparación del control negativo, añadiendo agua de dilución y wi algasª de la pipeta de 10 ml
El control negativo se prepara en un matraz (por ejemplo, 200 ml de volumen) mediante la adición de una alícuota de la suspensión de algas en el agua de dilución de modo que una densidad de 10 5 células / ml se obtiene.
4,3. Preparación de las soluciones de pruebas: la adición de agua de dilución, las algas y la solución estándar
Se sugiere que las soluciones de ensayo se preparan en cinco matraces de 200 ml mediante la adición de la solución estándar para el agua de dilución en las cantidades especificadas de manera que las concentraciones deseadas para las pruebas se obtiene. Para alimentar los organismos, partes alícuotas de una suspensión microalgas Dunaliella tertiolecta pueden utilizarse y se añadió a alcanzar una densidad de 10 5 células / ml cuando se preparan soluciones de prueba. La siguiente orden de adición, se recomienda: agua de dilución, la suspensión de algas y la solución estándar. Después de la preparación de soluciones de prueba, tienen que ser utilizados en el ensayo tan pronto como sea posible.
4,4. La transferencia de las soluciones de la mufla a los contenedores de prueba, y luego a las placas de Petri
Las cantidades iguales (50 ml) de las soluciones de ensayo se introduce en los recipientes de ensayo utilizando la probeta graduada. Tres réplicas para cada concentración se realizan. Para cada serie de pruebas, un contenedor de control se prepara con una cantidad de agua de dilución igual al volumen de las soluciones de ensayo. Volúmenes iguales (aproximadamente 12 ml) de las soluciones de ensayo se introducen en las placas de Petri. Para cada serie de pruebas, un plato de Petri de control se utiliza.
5. Preparación para las pruebas
5,1. Nauplios en la fase II-III
Cuarenta y ocho horas después de la activación de quistes, los nauplios llegar a la fase II-III de las larvas y luego son utilizables para la prueba.
5,2. Nauplios de transferencia en las placas de Petri utilizando el microscopio
La placa de Petri utilizado para quiste activación se saca de la cámara termostática. Una pequeña cantidad de larvas se transfieren a las placas de Petri que contenían el control y las soluciones de prueba. Esta tarea se va a realizar con el microscopio utilizando una pipeta de diámetro suficientemente grande para que los organismos no se dañan. En esta fase de la prueba, la transferencia se puede realizar con una pipeta Pasteur de vidrio (con punta redondeada por llama) y una fuente de luz situada lateralmente que fomenta la Artemia a agregarse.
5,3. Nauplios transferencia de las placas de Petri en los contenedores de prueba con el microscopio
Diez larvas se transfieren desde los platos Petri soluciones de ensayo a los recipientes de ensayo. También esta operación tiene que ser realizado mediante la utilización de la pipeta Pasteur y microscopio. Se recomienda que un volumen que no exceda de 1 ml se transfiere durante el paso de las larvas de no afectar el volumen total del sistema de prueba.
e_step "> 5.4. los envases llenos de cubierto con parafilmLos vasos de precipitados de ensayo están cubiertas con parafilm (dejando un hueco para el paso de aire), y se mantuvo a una temperatura de 25 (± 2) ° C durante toda la duración de la prueba y en una iluminación de 900 (± 100) lx con un fotoperíodo razón de 14 horas de luz de 10 horas de oscuridad.
6. Sustitución del Suplemento media y la Alimentación
6,1. Supervivencia de control de la frecuencia
Dos días después de la prueba ha comenzado, y después de los días 5, 7, 9 y 12 de la Artemia se observa bajo el microscopio para verificar la tasa de supervivencia y para reemplazar el medio y el suplemento alimenticio.
Número de organismos vivos se cuenta en cada recipiente de ensayo. Después de la observación bajo el microscopio y la estimulación ligera mecánica (por ejemplo, tocar las larvas con una pipeta Pasteur de vidrio) los organismos que no muestran un cierto movimiento en torno al 10 segundos debe considerarse muerto.
6,2. Preparación de una solución de ensayo que muestra muestreo algas con una pipeta de 10 ml y de muestreo de la sustancia de ensayo con una micropipeta. La transferencia de las soluciones de la mufla a los recipientes de prueba
Aunque las pruebas, las soluciones de ensayo debe ser reemplazado periódicamente, y se preparó en el mismo día que se van a utilizar. Las soluciones de ensayo se hacen de la solución estándar previamente preparada.
6,3. Artemia transferencia, utilizando una pipeta Pasteur de corte, de los contenedores de prueba de edad para los tres nuevos contenedores
La transferencia de Artemia se realiza mediante el uso de una pipeta con un diámetro lo suficientemente amplio como para no dañar los organismos. Durante esta fase, un plástico de 3 ml pipeta Pasteur (a cortar) puede ser utilizado.
6,4. Las larvas en un vaso que contiene ya sea en vivo o muerto Artemia
Después de 1 4 días de exposición al final de la prueba, el número de larvas supervivientes se contaron y se registran en la hoja de cálculo. LC 50 y / o LC 20, NOEC y LOEC de 14 días, se calculan y registran, así como los límites de confianza al 95% su caso, métodos y cálculo.
7. Los resultados representativos
Al final de la prueba (14 días), se calcula el porcentaje de mortalidad para cada concentración, de acuerdo con la siguiente fórmula:
(M s / N) * 100
Donde:
M s es el número promedio de personas murieron en la muestra analizada
N es el número total de personas expuestas
El cuadro 1 muestra un ejemplo de los datos de prueba (14d) con Artemia expuestos a dodecil sulfato de sodio.
| Las concentraciones (mg / l) | "> Número de personas murieron en cada réplicaMortalidad (%) | |||
| Yo | II | III | ||
| El control negativo | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Además, determinar elCL 50 por un valor de trama gráfica gaussiana logarítmica o el uso de métodos estadísticos apropiados (por ejemplo, de Spearman-Karber o método de prueba). El cálculo de LC 50 para los datos de la tabla 1 es 8,18 (7,15-9,37) mg / l. Si la concentración máxima probada causó una menor tasa de mortalidad del 50%, no debe proceder al cálculo del valor LC 50 que luego sería poco fiable o incluso no computable. En este caso, sin embargo, sería apropiado para repetir la prueba mediante la ampliación de la gama de concentraciones ensayadas. Por otra parte, el valor LC 50 más correctamente expresado como mayor que la concentración más alta probada, lo que posiblemente indica el porcentaje de mortalidad en la concentración más alta probada y la mayor concentración corresponde a un efecto que no.
Los resultados se consideran válidas si al final de la prueba de las siguientes condiciones se han cumplido:
- el control de la tasa media de mortalidades ≤ 20%;
- donde utilizando dodecilsulfato de sodio, la LC 50 a los 14 días está incluido en el 8,0 (± 5) mg / l de intervalo.
Si las condiciones anteriores no se han cumplido, todos los datos obtenidos con el mismo lote de organismos debe ser considerada no válida y se repite la prueba.
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Discussion
Artemia es uno de los organismos de prueba más valiosas disponibles para los ensayos de ecotoxicidad y la investigación realizada hasta el momento nos permite afirmar que es posible sostener varias opciones relacionadas con el uso de Artemia en toxicología y ecotoxicología. Las características que hacen de este organismo en una especie adecuada para los bioensayos son: una amplia distribución geográfica, alta adaptabilidad a condiciones ambientales adversas y nutrientes variados, la cultura de laboratorio relativamente simples y de mantenimiento, resistencia a la manipulación y de corto ciclo de vida, la producción de crías y los grandes existencia de una cantidad considerable de información sobre algunas especies. Una crítica contra el uso de Artemia se refiere a su sensibilidad a la exposición a productos químicos: estudios anteriores se refieren Artemia (prueba de 24 horas de exposición) como una especie menos sensible para estudios de ecotoxicidad, cuando se compara con otros organismos de ensayo en las mismas condiciones experimentales 3. La elección delmétodo para los ensayos de ecotoxicidad es crucial en este sentido. Queríamos estandarizar un método que tenía las mismas condiciones de partida (nauplios como un organismo de ensayo, obtenido a partir de la utilización de los quistes) del protocolo de 24 horas de exposición 4, pero con tiempos de exposición relativamente largos (14 días) podría proporcionar una más respuesta sensible. Este protocolo ciertamente permite una respuesta más sensible que los ensayos de toxicidad aguda, pero no se puede utilizar como un sustituto de una prueba de toxicidad crónica porque una exposición de 14 días no es relevante si tenemos en cuenta la estimación vida útil de Artemia. La selección de extremo para este método ha sido ampliamente discutido. Inicialmente, tanto la mortalidad y el crecimiento (es decir, longitud del caparazón después de la exposición de 14 días) fueron seleccionados, ya que también querían asegurar la observación de un efecto subletal para una prueba a largo plazo. Sin embargo, el punto final subletal se encontró que era menos sensible en comparación con la mortalidad 6. Por esta razón, la mortalidad es el punto final sólo se menciona en el indescriptibleión del protocolo y en el video. Este hallazgo es consistente con estudios de otros investigadores 7,8 quienes observaron que la supervivencia es el punto final más sensible de los considerados por ellos (la supervivencia, crecimiento y reproducción).
El método propuesto es útil para evaluar la toxicidad de productos químicos, efluentes y matrices ambientales 9. En la característica de que puede ser interesante para probar otros efectos subletales crónicos tóxicos, tales como marcadores biológicos (es decir, la actividad enzimática) 10.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Producido por Loredana Manfra del Instituto para la protección del medio ambiente y la investigación (ISPRA-Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental) y Federica Savorelli de la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente (Emilia-Romaña, Italia).
Los miembros de referencia para el subgrupo de trabajo sobre el crustáceo Artemia en el Grupo de Métodos biológicos - Agua salada / agua salobre y de sedimentos de la Comisión UNICHIM de la Calidad del Agua (el instituto para el funcionamiento de las normas técnicas en el sector químico).
Grabación y edición de Marco Pisapia de Ispra (Unidad de la web).
Producción de Coordinación de Anna Maria Cicerón y Erika Magaletti del ISPRA (Departamento de Monitoreo de la Calidad Ambiental).
Nos gustaría agradecer a la Agencia Regional para la Protección del Medio Ambiente de Emilia-Romaña, Ferrara Rama, el Grupo de Métodos biológicos - Agua salada / salobreEl agua y los sedimentos de la Comisión UNICHIM de Calidad del Agua y Migliore Luciana, la Universidad Tor Vergata (Roma) por su cooperación; Rossella Boscolo y Massimo Gabellini de Ispra (Departamento de Prevención y Mitigación de Impactos) por su apoyo financiero; Matassa Fabio y Londres, el Escuela de Idiomas en Roma por su apoyo lingüístico.
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