Summary
Denna studie handlar om utveckling och standardisering av en värdefull metodologisk protokoll för att bestämma lång sikt (14 dagar) letal toxicitet som utövas av kemiska ämnen, industriell avloppsvatten eller avlopp och flytande miljöprover på saltvatten kräftdjur,
Abstract
Vår forskning inriktas på användning av biologiska metoder för utvärdering av miljökvalitet, med särskild hänvisning till saltvatten / bräckt vatten och sediment. Valet av biologiska indikatorer måste baseras på tillförlitliga vetenskapliga rön och eventuellt av tillgången till standardiserade förfaranden. I den här artikeln presenterar vi ett standardiserat protokoll som används den marina kräftdjur Artemia för att utvärdera toxiciteten av kemikalier och / eller marina miljön matriser. Forskarna föreslår att Artemia (Artemia) är en lämplig kandidat för utveckling av en standard bioassay för global användning. Ett antal artiklar har publicerats på de toxiska effekterna av olika kemikalier och gifter om artemia (Artemia). Den stora fördelen med denna skaldjur för toxicitetsstudier är den övergripande tillgången på de torra cystor, dessa omedelbart kan användas i testning och svår att bruka inte efterfrågas
Protocol
1. Method Standard
Våra tester är att exponera Artemia larver till ett intervall av ämne koncentrationer eller ett test prov för att fastställa den koncentration eller utspädning nivåer som skulle orsaka döden för 50% av de organismer (LC 50) exponerade under 14 dagar och som uppfyller de definierade villkor genom denna metod. Om det är nödvändigt och möjligt, kan följande också bestämmas: a) koncentrationsnivå som orsakar död 20% exponerade organismer (LC 20), b) den högsta analyserade halten nivå som inte fastställa en högre dödlighet än den negativa kontrollen (NOEC); den lägsta testade koncentrationen nivå som bestämmer, efter 14 dagar, en högre dödlighet än den hos den negativa kontrollen (LOEC).
2. Testing Materials
2,1 Artemia ägg
För att utföra provning, Artemia franciscana 5. Certifierade ägg eller cystor som används för att stödja tester är kommersiellt tillgängliga, t.ex. från Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45.268, USA eller från laboratoriet för biologisk forskning i föroreningar i vattnet, universitetet i Gent, Belgien.
2,2 vattenutspädning
Syntetisk saltvatten kan användas som spädvatten, framställd genom upplösning av vedertagen analyskvalitet reagenser eller en kommersiellt tillgänglig formulering i destillerat eller avjoniserat vatten. Salt blandningar för att skapa den perfekta saltvatten är kommersiellt tillgängliga, t.ex. Instant Ocean blandningar. Det rekommenderas en spädning vatten med en salthalt som är lika med 35 (± 2) PSU samt en koncentration av upplöst syre av mer än 80% av värdet av mättnad och en temperatur av 25 (± 2) &°, C. Efter luftning under 48 timmar och filtrering i filter med en porositet av minst 0,45 ^ m, kan spädning lagras under maximalt 30 dagar i mörker vid en temperatur av 0-4 ° C.
2,3 algkulturen
Det rekommenderas att försöksdjur är livnär sig på Dunaliella tertiolecta mikroalger, som växer exponentiellt och nå tätheter av 1.3x10 6 - 2.0x10 6 celler / ml. Försök på miljöprover kräver kulturer med densiteter högre än 2.0x10 6 celler / ml 6. Det har föreslagits att Dunaliella tertiolecta växer i ett odlingsmedium innehållande havsvatten (30 (± 2) PSU och 20 (± 1) ° C) med tillsats av väsentliga näringsämnen, mineraler och vitaminer. Några indikationer på alger media sammansättning och beredning redovisas i bilaga. Den initiala celldensiteten har föreslagits att vara approximativt 10 5 celler per ml. Algkulturen bibehålls i ettrumstermostat vid 20 (± 1) ° C, belystes med lysrör 3000 (± 300) lx, med en fotoperiod förhållande av 16 timmars ljus och 8 timmars mörker.
Andra växtplanktonarter skulle också kunna användas för utfodring men det skulle vara nödvändigt att göra jämförande studier med dessa växtplankton för att hitta de "likvärdiga" arter Dunaliella tertiolecta, eftersom de experimentella villkoren (t.ex. initiala celldensiteter, lätt belysning, temperatur, sammansättning av odlingsmedia och exponeringstid) varierar mellan växtplankton. Förutom tolerans mikroalger till olika föroreningar måste beaktas eftersom de förorenande effekter på tillväxten och utvecklingen av växtplankton effekt även för Artemia.
2,4 Referenssubstans
Referenssubstansen i detta test är natriumdodekylsulfat.
2,5 Laboratory glas
- Testa behållare, inklusive 100 ml borsilikat glasbägare (18 för att utföra tester och 18 för att överföra lösningar).
- En kolv (t.ex. 500 ml flaska) för att förbereda standardlösningen.
- Sex kolvar (t.ex. 200 ml flaskor) för att förbereda testning lösningar.
- Glas eller polystyren 5 cm i diameter petriskålar med avtagbar klädsel som ska användas för att aktivera cystor och överföra Artemia från kläckning skålen till testning behållarna.
- Glas Pasteur pipetter (med tips avrundade med låga) för att överföra nauplii.
- Glas kanyler eller Pasteur 3 ml engångs plastpipetter (sänkas) för överföring av Artemia.
- Mikropipetter och graderade pipetter för att förbereda testning lösningar.
- Sex graderade cylindrar (t.ex. 50 ml flaskor) för överföring av testar lösningar från kolvarna till Than testning behållare.
3. Cysta Aktivering
3,1. Petriskålar innehållande cystor + att hälla vatten
Att generera testorganismer är 20 mg cystor placerades i en petriskål innehållande 12 ml av utspädningsvatten 48 timmar före testning.
3,2. Inkubation i ljus och mörker
Petriskålen hålles vid 25 (± 2) ° C och vid ett 4000 (± 1000) lux (lumen per kvadratmeter) ljusintensitet under en timme.
3,3. Att ersätta mediet med användning av mikroskop
Efter 24 timmar är de kläckning larverna överförs till en ny petriskål fylld med artificiell vatten. Överföringen sker med hjälp av mikroskop, dvs med hjälp av en ljuskälla så att kläckningen, fototropiskt larver vandrar mot ljusstrålen. Ett glas pasteurpipett används för att göra överföringen, se till att endast den framväxande larverna are överföras och inte cystor eller larver fortfarande membran.
3,4. Inkubation i mörker
Skålen innehållande larver placeras i en mörk termostatisk kammare under 24 timmar vid 25 (± 2) ° C.
4. Beredning av Test Solutions
4,1. Vägning ämnet + överföras till kolven
Det rekommenderas att den standardlösning för testning substans framställs genom upplösning av 0,5 g av substansen i en 500 ml kolv. Kolven fylldes med avjoniserat eller destillerat vatten och lösningen omröres tills testet substansen är fullständigt upplöst. Lösningar måste vara beredd vid nytta om det inte är känt om ämnet är stabilt i lösning. I det fallet kan den standardlösning framställas upp till två dagar före testning.
4,2. Förbereda den negativa kontrollen, lägga utspädningsvatten och alger with 10 ml pipett
Den negativa kontrollen är framställd i en kolv (t.ex. 200 ml volym) genom att tillsätta en alikvot av Algsuspensionen till utspädningsvattnet, så att en densitet av 10 5 celler per ml erhålles.
4,3. Förbereda tester lösningar: att tillsätta spädvatten, alger och standardlösning
Det föreslås att testa lösningar upprättats i fem 200 ml kolvar genom att lägga till standardlösningen den utspädning som vattnet i mängder som anges så att de önskade koncentrationerna för testning erhålls. Att mata; kan alikvoter av en Dunaliella tertiolecta mikroalger suspensionen användas och tillsattes för att uppnå en densitet av 10 5 celler per ml vid testning lösningar framställs. Följande ordning Dessutom rekommenderas: spädvatten, alger fjädring och standardlösning. Efter framställning av testning lösningar, måste de användas i analysen så snart som möjligt.
4,4. Överföring lösningar från kolven till testning behållarna, sedan till petriskålar
Lika mängder (50 ml) av testning lösningar införs i test behållarna utnyttjar mätglas. Tre repliker för varje koncentration görs. För varje provserie är en kontroll behållare framställd med en mängd utspädningsvatten lika med volymen av testlösningarna. Lika stora volymer (ca 12 ml) av testlösningen införes i petriskålar. För varje provserie är en kontroll petriskål användas.
5. Förberedelser för provning
5,1. Nauplii vid II-III stadiet
Fyrtioåtta timmar efter cysta aktivering, nauplii nå II-III larvstadiet och är sedan användas för testning.
5,2. Nauplii överförs till de petriskålar med hjälp av mikroskop
Det petriskål används för cysta aktivering tas ut ur den termostatiska kammaren. En liten mängd av larver överförs till Petri-skålar innehållande kontroll-och de testlösningar. Denna uppgift ska utföras med mikroskopet använder en pipett tillräckligt stor diameter så att organismer inte skadas. I denna fas av testet, kan överföringen ske med ett glas Pasteur pipett (med spetsen omgiven av låga) och en i sidled positionerad ljuskälla som uppmuntrar Artemia att aggregera.
5,3. Nauplii överföring från Petriskålarna i provrören behållare med mikroskopet
Tio larver överförs från testning lösningar Petriskålarna till testning behållarna. Även denna operation måste utföras genom att använda Pasteur-pipett och mikroskop. Det rekommenderas att en volym av högst 1 ml överförs under passagen av larver inte påverka den totala volymen av testsystem.
e_step "> 5.4. Full behållare täckt med parafilmDe tester bägarna är täckta med parafilm (lämnar en lucka för luft passage), och hölls vid en temperatur på 25 (± 2) ° C under hela provningen och vid en belysning av 900 (± 100) LX med en fotoperiod förhållande av 14 timmars ljus och 10 timmars mörker.
6. Byta Medium och kosttillskott
6,1. Överlevnad styrning
Två dagar efter provet har börjat, och sedan efter 5, 7, 9 och 12 dagar är Artemia observeras under mikroskop för att verifiera överlevnad och att ersätta mediet och kosttillskott.
Antal levande organismer räknas i varje testbehållare. Efter observation under mikroskop och lätt mekanisk stimulering (t.ex. röra larverna med ett glas Pasteurpipett) organismer som inte visar någon rörelse i ca 10 seconds bör vara döda.
6,2. Beredning av en testlösning visar alger provtagning med en 10 ml pipett och provtagning av ämnet testas med en mikropipett. Överföring lösningar från kolven till test behållarna
Medan testning måste testlösningarna bytas ut med jämna och framställt på samma dag som de ska användas. Testlösningar är gjorda av standardlösningen tidigare framställts.
6,3. Artemia överföring använder ett snitt Pasteur pipett från gamla prov behållarna till de tre nya behållare
Överföringen av Artemia utförs genom användning av en pipett med en tillräckligt stor diameter för att inte skada organismer. Under denna fas kan en 3 ml av plast pasteurpipett (kapas) användas.
6,4. Larver i en bägare innehållande antingen levande eller döda Artemia
Efter 1 4 dagar exponering i slutet av testning, är antalet överlevande larver räknades och registrerades i kalkylbladet. LC 50 och / eller LC 20, NOEC och LOEC vid 14 dagar, beräknas och redovisas, liksom konfidensintervall på 95% i förekommande fall, och beräkningsmetoder.
7. Representativa resultat
Vid slutet av testet (14 dagar), beräkna den procentuella mortaliteten för varje koncentration, i enlighet med följande formel:
(M ^ / N) * 100
Där:
M s är genomsnittligt antal dog individer i det analyserade provet
N är totala antalet exponerade personer
Tabell 1 rapporterar ett exempel på data från ett test (14d) med Artemia utsätts för natriumdodekylsulfat.
| Koncentrationer (mg / l) | "> Antal dog individer i varje replikMortalitet (%) | |||
| Jag | II | III | ||
| Negativ kontroll | 0 | 2 | 1 | 10 |
| 1,56 | 1 | 2 | 0 | 10 |
| 3,12 | 2 | 0 | 2 | 13 |
| 6,25 | 3 | 2 | 3 | 27 |
| 12,5 | 8 | 9 | 10 | 90 |
| 25,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
| 50,0 | 10 | 10 | 10 | 100 |
Dessutom bestämmerLC 50-värdet av en grafisk gaussisk logaritmisk plot eller med lämpliga statistiska metoder (till exempel Spearman-Karber eller Probit Method). Beräkning av LC 50 för data i tabell 1 är 8,18 (7,15-9,37) mg / liter. Om den maximala koncentrationen testade orsakat en lägre dödlighet på 50%, bör du fortsätta att inte beräkningen av LC 50-värdet som då skulle vara opålitliga eller till och med icke-beräkningsbar. I detta fall skulle emellertid vara lämpligt att upprepa testet genom att förlänga det testade koncentrationer. Alternativt LC 50 värde mer korrekt uttryckt som större än den högsta testade koncentrationen, vilket möjligen indikerar procentandelen dödlighet vid den högsta testade koncentrationen och den högsta koncentrationen som motsvarar en ingen effekt.
Resultaten anses giltiga om slutet för att testa följande villkor är uppfyllda:
- kontrollens genomsnittliga dödlighetär ≤ 20%;
- där användning natriumdodecylsulfat, LC 50 vid 14 dagar är inkluderad i 8,0 (± 5) mg / l-intervall.
Om ovanstående villkor inte har uppfyllts, ska alla data som erhållits med samma parti organismer anses vara ogiltig och testning upprepas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artemia är ett av de mest värdefulla testorganismerna tillgängliga för ekotoxicitet Provnings-och Forskningsinstitut gjort så här långt kan vi konstatera att det är möjligt att upprätthålla flera alternativ relaterade till Artemia användning i toxikologi och ekotoxikologi. De egenskaper som vänder denna organism i en lämplig art för bioanalyser är: en bred geografisk spridning, hög anpassningsförmåga till ogynnsamma miljöförhållanden och olika näringsämnen, relativt enkla laborationer kultur och underhåll, resistens mot manipulation, kort livscykel, stort avkomma produktion och Förekomsten av en betydande mängd information om vissa arter. En kritik mot användning av Artemia är hänvisade till sin känslighet för kemisk exponering: tidigare studier hänvisas Artemia (test till 24 timmars exponering) som ett mindre känsliga art för ekotoxicitet studier, jämfört med andra testorganismer under samma experimentella förhållanden 3. Valet avmetod för ekotoxicitetsstudier är avgörande i detta avseende. Vi ville att standardisera en metod som hade samma startvillkoren (nauplii som ett test organism, som erhålls från användningen av cystor) i protokollet till 24 timmars exponering 4, men med relativt långa exponeringstider (14 dagar) skulle ge en mer känslig respons. Detta protokoll möjliggör säkert en känsligare respons än de akuta testerna men det kan inte användas som ett substitut för en kroniskt test eftersom en exponering på 14 dagar är inte relevant om vi betraktar uppskattningen livslängd Artemia. Slutpunkten val för denna metod har diskuterats. Inledningsvis både dödlighet och tillväxt (dvs. ryggsköldens längd efter 14-dagars exponering) valdes, eftersom vi ville också se till att observation av en subletal effekt för ett långtidstest. Emellertid var subletal slutpunkt befunnits vara mindre känslig än dödlighet 6. Av detta skäl dödligheten är den enda slutpunkten nämns i description av protokollet och i videon. Detta resultat överensstämmer med studier av andra forskare 7,8 som observerade att överlevnad är den mest känsliga slutpunkten bland dem som anses av dem (överlevnad, tillväxt och reproduktion).
Den föreslagna metoden är användbar för att utvärdera toxiciteten hos kemikalier, avlopp och miljö matriser 9. I funktionen kan det vara intressant att testa andra subletala kroniska toxiska effekter, såsom biomarkörer (dvs. enzymatisk aktivitet) 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Producerad av Loredana Manfra av Institutet för miljöskydd och forskning (Ispra-Department of Environmental Quality Monitoring) och Federica Savorelli av regionala byrån för miljöskydd (Emilia-Romagna, Italien).
Referens medlemmar för sub-arbetsgrupp om Artemia kräftdjur inom biologiska metoder gruppen - Saltwater / bräckt vatten och sediment från UNICHIM kommissionen om vattenkvalitet (Institutet för teknisk standardisering som arbetar inom den kemiska sektorn).
Videography och redigering av Marco Pisapia Ispra (Web Unit).
Produktionen Samordning av Anna Maria Cicero och Erika Magaletti Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring).
Vi vill tacka regionala byrån för miljöskydd Emilia-Romagna, Ferrara Branch, de biologiska metoderna gruppen - Saltwater / bräcktVatten och sediment från UNICHIM kommissionen om vattenkvalitet och Luciana Migliore, Tor Vergata universitet (Rom) för deras samarbete, Rossella Boscolo och Massimo Gabellini Ispra (Institutionen förebygga och begränsa följderna av påverkan) för sitt ekonomiska stöd, Fabio Matassa och London School of Languages i Rom för deras språkliga stöd.
References
- Togulga, M. The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii. Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).
- Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).
- Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).
- APAT IRSA-CNR. Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003. Terzo Metodo, 8060 (2003).
- Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. The use of Artemia nauplii for toxicity tests – a critical analysis. Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).
- Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica. Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).
- Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana. Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).
- Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA. Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).
- Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti". , UNICHIM. (2010).
- Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica. Chem. 48, 563-569 (2002).
