Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

Published: May 4, 2012 doi: 10.3791/3791
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

Summary

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

Protocol

1. הדפס microarray נוגדן עבור assay

  1. לדלל את כל הנוגדנים ל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של תמיסת מלח פוספט חיץ, pH 7.2 (PBS).
  2. Aliquot 40 μl של נוגדן זה לתוך צלחת 384, גם המקור.
  3. טען את צלחת 384 גם מקור על microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. טען 20 microarray שקופיות נתיב אל microarrayer כמטרה.
  5. הגדר את microarrayer להדפיס 48 subarrays זהים, בהם 27 נוגדנים וחלבונים שליטה הם הבחינו בשלושה עותקים בדפוס 9x9 (איור 1E, 1F).
  6. התחל microarrayer להדפיס את microarray שקופיות נוגדנים.
  7. לאסוף את microarray שקופיות נוגדנים, ולאחסן אותם קלטת שקופיות עם יבוש. אבק לאטום את הקלטת בתוך שקית ניילון באמצעות ואקום אוטם (Foodsaver).
  8. אחסן את השקופיות microarray חתום על 4 מעלות במקרר.

2. מבחינה כימית חסום microarray נוגדן למניעת GBPקשירה של נוגדנים ללכוד

Assay microarray מתחיל פעם אחת את השקופיות microarray חסומים כימית נמשך כ -8 שעות. פעם אחת התחיל assay microarray יש להסתיים (שלבים 2 עד 8).

  1. קח microarray מחליק מהמקרר, ואת לאזן אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. להסיר את השקופית מתיבת אחסון בקצרה לשטוף אותם פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם 0.1% Tween 20 (PBST0.1) פעם שקופית כביסה אגן ולאחר מכן, 15 mM pH נתרן אצטט חיץ 5.0 עם 0.1% Tween (CBT0 0.1) באופן רציף. דגירה את השקופיות ב CBT0.1 במשך 10 דקות באגן שקופיות כביסה.
  3. הכן mM טרי 150 NaIO 4 ב 15 נתרן אצטט mM מאגר ה-pH 5.0 (CB), ולשמור אותו לתוך השקופית כביסה אגן במקרר תוך הימנעות אור לפני השימוש.
  4. להסיר את השקופית מ CB, והכניס אותו לתוך הכיור ובו NaIO טרי 4 עם הצד נוגדןפונה כלפי מעלה. מכסים את הקערה בנייר כסף, כדי למנוע אור, דגירה אגן שקופיות למשך 2 שעות עם עדין רועדת על 4 מעלות במקרר.
  5. הכינו 300 מ"ל של 10 חומצה גלוטמית hydrazide mM (חוסם) ב CB.
  6. להסיר את השקופית מן האגן, בקצרה לשטוף אותו CB 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם באגן שקופיות כביסה.
  7. דגירה של שקופיות חוסם באגן כביסה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
  8. הסר את השקופיות מן האגן, ולשטוף אותם עם PBST0.1 במשך 3 דקות.

3. חסום שאינם ספציפיים Bindings ל microarray עם אלבומין בסרום שור (BSA)

  1. הכינו 300 מ"ל של BSA 1% פוספט pH 7.2 חיץ מלוחים עם Tween 0.5% (PBST0.5) באגן שקופית כביסה, ו דגירה שקופיות microarray באגן שעה 1 בטמפרטורת החדר עם בעדינות רועד.
  2. יש לשטוף את השקופיות ב PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
  3. לשים את השקופיתעל מדף השקופית ולאחר ספין XG ב 1200 על צנטריפוגה 2 דקות כדי לייבש את השקופית microarray.

4. חותם השעווה רשת לשקופית microarray להפריד כל Subarray

  1. טרום חימום imprinter שעווה על 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  2. טען את השקופית microarray חסמו את imprinter שעווה עם הצד הפונה אל הנוגדן שעווה. משוך בעדינות את הידית חותם שעווה לשקופית באופן שווה.

5. החל דגימות סרום לשקופית microarray

  1. במהלך שלב 2.4, להכין דגימות סרום assay או פרופיל glyco במדגם 1 (5.1.1), או מדידה אחת glyco epiptope בין דוגמאות רבות (5.1.2).
    1. בניסוי על profilings glycan של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם 1 בסרום באמצעות מספר רב של Gbps (ראה הניסוי מדגם 1), אחד דגימות סרום יחולו על כל subarrays. במקרה זה, 40 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 360 של PBS המכיל 0.1%Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ארנב IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μl של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
    2. בניסוי למדידת glycan 1 על חלבונים בסרום מרובים בין דגימות סרום מרובים באמצעות אחת לתגליות GBP (ראה הניסוי מדגם 2). במקרה זה, 1 מספיק סרום μl הוא מדולל לתוך μl 9 של PBS המכיל 0.1% Tween-20, 0.1% Brij 35, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של העכבר IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עכברוש IgG, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ארנב IgG , 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של עז IgG ו - 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של החמור IgG. נפח זה מספיק ליישום 6 μL של פתרון בסרום בדילול מלא על כל subarray.
  2. לאחר חותם שעווה בשלב 4, בזהירות להחיל 6 μL מדגם בדילול מלא או דגימות בקרה (PBST0.1) כדי subarray כל השקופית. דגירה שקופית קלטת humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדרשעה 1.
  3. יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
  4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 דקה 2.

6. החל GBP Biotinylated (נוגדן Lectin או נגד glycan) לשקופית

  1. במהלך שלב 2.4, להכין 10μg/ml של לקטינים biotinylated / Gbps ב PBST0.1.
    1. בניסוי פרופיל glycan כי בדיקה דגימה אחת עם לקטינים רבים (דוגמת ניסוי 1), להכין 350 μL של lectin biotinylated כי היא מספקת את כל subarrays.
    2. ההקרנה אחת epitope / סמן glycan בדגימות מרובים באמצעות לקטינים רבים, להכין 10 μl של lectin כל biotinylated זה מספיק subarray 1.
  2. החל 6 μL של lectin biotinylated בדילול מלא (ים) subarray כל שקופית, ולאחר דגירה בתיבה שקופיות humidified במגבות נייר רטובות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
  3. יש לשטוף את השקופיות עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות כל טילי.
  4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.

7. החל NeutrAvidin תווית דיי גילוי Fluorescence

  1. הכן 350 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו כי היא מספקת את כל subarrays.
  2. החל 6 μL של NeutrAvidin 549 Dylight שכותרתו subarray על כל אחד, דגירה שקופית קלטת שקופיות humidified בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
  3. יש לשטוף את השקופית עם PBST0.1 שלוש פעמים במשך 3 דקות בכל פעם.
  4. לייבש את השקופית על ידי ספינינג אותו XG 1200 בצנטריפוגה במשך דקה 2.

8. להשיג תמונה microarray שקופיות על ידי סריקת שקופיות

  1. לסרוק את השקופית באמצעות סורק microarray הקרינה ברזולוציה של 10 מיקרומטר. הגדרות לייזר ו PMT צריך להיות חזק ככל האפשר, אך לא במקום הרוויה הוא ציין.

9. נתונים כריה ניתוח

  1. פתח את התמונה ArrayPro 3.2. הגדרת תבנית המערך על פי המפה מציגה את מערך כתמים במקומות נוגדנים. בזהירות ליישר כל עיגול בתבנית על המקום המתאים בתמונה.
  2. חלץ את העוצמה של כל מקום לקובץ Excel לניתוח נוסף.

10. נציג תוצאות

לדוגמא ניסוי 1

Glycosylation פרופיל של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם קרצינומה של המטופל hepatocellular בסרום באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי לקטינים נפוצה.

מטרת הניסוי היא לחקור את הפרופיל glycosylation הפרט של 20 גליקופרוטאינים של קרצינומה hepatocellular (HCC) מדגם בסרום החולה באמצעות microarray הנוגדן חסם כימית עם זיהוי lectin. Microarray נוגדנים, המכיל 48 subarrays זהים הכוללים 26 נוגדנים ביוטין-BSA, תוכנן ומיוצר כמתואר STEP 1. אלה היו 26 נוגדנים נגד 20 גליקופרוטאינים בסרום כי המזוהים מבטיחים ערך אבחון מוקדם של חולים HCC באמצעות immunoprecipitation מבוסס lectin בשילוב עם זיהוי המוני חלבון spectrometric 12, 32, כפי שמוצג בטבלה 1. דפוס סידור המקומות נוגדנים מודפסים בשלושה עותקים ב subarray נציג אחד מוצגות באיור 1E ו 1F, בהתאמה. שתי שקופיות microarray זהים, לא היה חסום מבחינה כימית (איור 1 א), ואילו השני היה (איור 1 ב), שימשו לבצע את אותו ניסוי פרופיל glycosylation על מנת להמחיש את חשיבות הליך כימי חסימת לניתוח. עבור השקופית חסם כימית (איור 1 ב), הניסוי התחיל שלב 2: כי לא חסם את השקופית כימית (איור 1 א), הניסוי החל משלב 3. הניסוי בוצע על ידי followinגרם כל השלבים המתוארים בפרוטוקול, למעט שלב 5.1.2 ו 6.1.2. בשלב 5.2, מדגם PBST0.1 השליטה יושם על subarrays בעמודה 1, 3, ו מדגם נקווה סרום HCC היה מוחל על subarrays בעמודה 2 ו -4, בהתאמה (כפי שמוצג באיור 1G). השוואה זו היא להראות את האפקטיביות, היעילות של ההליך, כמו גם את הזיקה אנטיגן המחייב של הנוגדנים לאחר כימית חוסם. 22 biotinylated לקטינים (כפי שניתן לראות בלוח 1) ספציפי כדי glycans שונים 18, 20 שהוחלו על כל subarray כפי שמוצג באיור 1G על פרופיל glycosylation. תמונות של (איור 1 א) microarrays חסומים כימית (איור 1 ב) וחסמו הלא כימי לאחר assay glycosylation פרופיל ידי ביצוע הפרוטוקול. כפי שניתן לראות את subarrays בעמודה 1 ו -3 הלא כימית microarrays חסומים (איור 1 א ', איור 1 ג), שבורק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים חייב לתפוס הנוגדנים, והראה רקע גבוהה מאוד דומים לאלה subarrays בעמודה 2 ו - 4, שבו המדגם סרום יושמה. אי אפשר להשיג מידע בפרופיל glycan משקופית זו microarray. נהפוך הוא, כאשר את אותו הניסוי נעשה על שקופית חסם כימית microarray נוגדנים, את subarrays בעמודה 1 ו 3, שבו רק PBST0.1 יושמה, רוב לקטינים הראה איגודי אין או נמוכה מאוד לתפוס נוגדנים, ואילו גבוהה אנטיגן איגודי נצפו עדיין בעמודה 2 ו - 4 ב subarrays, שבו מדגם בסרום יושמה (איור 1 ב 'ו 1D). התוצאה הראתה אלה הליך כימי חסימת היה שלב קריטי לפני מדידת glycans על נוגדנים שנתפסו גליקופרוטאינים. על ידי ביצוע הפרוטוקול, פרופילים glycosylation של 22 גליקופרוטאינים ב HCC בסרום ניתן להשיג.

ניסוי 2

מסך fucos שינוylation על גליקופרוטאינים בסרום ספציפיים כמו סמנים ביולוגיים שחמת הכבד מופלים ו קרצינומה חולים hepatocellular.

מטרת הניסוי הזה היא המסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular (HCC) חולים. שונה ניסוי 1, שבו רק דגימה אחת סרום יושם על subarrays כל נחקר עם לקטינים שונים, assay זה, בסך הכל 40 דגימות נסיוב שונים HCC ו שחמת חולים יושמו על subarray כל אחד, נחקר עם lectin 1 (אאל ). ניתוחים סטטיסטיים, כגון T הבדיקה, מקלט פעולה (ROC) עקומת אופייני, נעשה כדי להעריך את הפצות או ביצוע אבחון של epiptope סמן glycan / חלבון על כל אדם בכל דגימות סרום. השתמשנו microarray נוגדנים מיוצרים באותו ניסוי 1 חוץ נגד CA19-9 ואנטי לואיס נוגדנים צילומי במחקר זה. Experiment בוצע מתוך 2 ספטמבר לשלב 9 למעט שלב 5.1.1 ו 6.1.1. סה"כ 40 דגימות נסיוב של שחמת הכבד 20 ו -20 חולים HCC יושמו ב subarray אקראית של 48 subarrays יחד עם דגימות PBS בקרה כביקורת שלילית. Fucosylation של כל החלבונים שנתפסו זוהה לאחר מכן באמצעות lectin biotinylated Fucose ספציפי. התמונה microarray שמוצג באיור 1 הפגינו אאל lectin מחויב רק חלבונים בדם שנתפסו על microarray (איור 2 ד) במקום נוגדנים שנתפסו (2E איור). עוצמות את הקישור אאל של כל הנקודות הוצאו אז, ניתח באמצעות T הבדיקה עקומות ROC כדי להעריך את הביצועים של fucosylation (עוצמת מחייב אאל) של כל חלבון בסרום על אפליה בין HCC וקבוצות שחמת. התוצאות הראו כי fucosylation של חלבון GP73 נתן את האפליה הטובה ביותר בין שתי הקבוצות עם p = 0.03 ו-האזור מתחתהעקומה של עקומת ROC שווה ל 0.72. ניסוי זה הוכיח בהליך זה היא שיטה מהירה, יעילה לסינון glycan epitope / סמן על דוגמאות רבות בתוך חלבונים רבים.

תעודת זהות שם מגיב קיצור חברה קטלוג #
L1 Concanavalin Biotinylated ConA וקטור מעבדות BK-1000
L2 Lectin Biotinylated Sambucus nigra SNA וקטור מעבדות B-1305
L3 Biotinylated עדשה Culinaris Agglutinin רע"א וקטור מעבדות BK-2000
L4 Biotinylated Ricinus communis Agglutinin אני RCA וקטור מעבדות BK-1000
L5 Lectin Biotinylated Aleuria Aurantia אאל וקטור מעבדות B-1395
L6 Lectin Biotinylated Erythrina Cristagalli ECL וקטור מעבדות BK-3000
L7 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II GSL ב ' וקטור מעבדות BK-3000
L8 Biotinylated נבט חיטה Agglutinin WGA וקטור מעבדות BK-1000
L9 Biotinylated vulgaris Phaseolus Erythroagglutinin PHA-E וקטור מעבדות BK-2000
L10 Biotinylated vulgaris Phaseolus Leucoagglutinin PHA-L וקטור מעבדות BK-2000
L11 ביובוטנים tinylated Agglutinin הרשות הפלסטינית וקטור מעבדות BK-1000
L12 Biotinylated Pisum sativum Agglutinin PSA וקטור מעבדות BK-2000
L13 Biotinylated לבלב Biflorus Agglutinin DBA וקטור מעבדות BK-1000
L14 ב"דאטורה Biotinylated וסטרמוניום Lectin DSL וקטור מעבדות BK-3000
L15 Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin SJA וקטור מעבדות BK-2000
L16 סויה Biotinylated Agglutinin SBA וקטור מעבדות BK-1000
L17 Biotinylated Solanum Tuberosum (תפוחי אדמה) Lectin STL וקטור מעבדות BK-3000 </ Td>
L18 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin אני אני GSL וקטור מעבדות BK-2000
L19 Lectin Biotinylated בקיה Villosa VVL וקטור מעבדות BK-2000
L20 Biotinylated Lycopersicon Esculentum (עגבניות) Lectin לל וקטור מעבדות BK-3000
L21 Ulex Biotinylated Europaeus Agglutinin אני אני UEA וקטור מעבדות BK-1000
L22 Biotinylated Jacalin JACALIN וקטור מעבדות BK-3000
A1 F עיזים ("א.ב.) 2 נגד אדם IgM שבר, נוגדנים Fc5μ IgM ג'קסון חיסונית מחקר 109-006-129
A2 החמור F ('א.ב.) 2Frag נגד אדם IgG (H + L) נוגדן Ab1 ג'קסון חיסונית מחקר 709-006-149
A3 עכבר נגד אדם IgG ו '("א.ב.) 2 נוגדנים חד שבטיים AB3 ג'קסון חיסונית מחקר 209-005-097
A4 אנטי אנושי עז אלפא 2 macroglobulin polyclonal נוגדנים A2M GeneTex GTX62924
A5 הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים A1AT לי Biosiences CA1T-80A
A6 נגד אדם מאוס Alpha-1-antitrypsin נוגדנים חד שבטיים A1AT סיגמא אולדריץ' SAB4200198
A7 הארנב נגד אדם אלפא-1-antitrypsin polyclonal נוגדנים מערכה NeoMarkers RB-367-A1
A8 הארנב נגד אדם אלפא-1-מגוחכיםhymotrypsin polyclonal נוגדנים מערכה פישר סיינטיפיק RB9213R7
A9 נגד אדם מאוס transferrin חד שבטי נוגדן Transferrin GeneTex GTX101035
A10 הארנב נגד אדם transferrin polyclonal נוגדנים Transferrin GeneTex GTX77130
A11 אנטי אנושי עז אפוליפופרוטאין J polyclonal נוגדנים ApoJ Abcam ab7610
A12 נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן GP73 אבוט 14H4-23
ת 13 נגד אדם מאוס GP73 חד שבטי נוגדן GP73 סנטה קרוז ביוטכנולוגיה INC SC-101275
A14 הארנב נגד אדם אלפא 1 fetoprotein polyclonal נוגדנים AFP GenWay GWB-41C966
ת 15 נגד אדם מאוס Alpha-1 fetoprotein חד שבטי נוגדן AFP פיצג'רלד 10-A05A
A16 נגד אדם מאוס hemopexin חד שבטי נוגדן Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 עכבר נגד אדם glypican-3 (1G12) נוגדנים חד שבטיים GPL3 סנטה קרוז ביו SC-65443
A18 נגד אדם מאוס Kininogen (LMW) נוגדנים חד שבטיים Kininogen Assaypro 20333-05011
A19 הארנב נגד אדם MMP-21 חד שבטי נוגדן MMP21 Epitomic 1955-1
A20 נגד אדם מאוס CEACAM-1 נוגדנים חד שבטיים CEACAM מחקר ופיתוח מערכות MAB1180
21 עכברוש נגד האדם נוגדנים חד שבטיים DPPIV/CD26 DPPIV מחקר ופיתוח מערכות MAB22441
A22 נגד אדם מאוס PIVKA II נוגדנים חד שבטיים PIVICA קריסטל כימית 8040
A23 נגד carcinoembryonic עכבר אנטיגן CEA ארה"ב הביולוגי C1300
A24 עכבר נגד CA125 סרטן Antigen CA125 ארה"ב הביולוגי C0050-01D
A25 נגד CA19-9 סרטן עכבר אנטיגן CA19-9 ארה"ב הביולוגי C0075-18
A26 נגד לואיס עכבר x חד שבטי נוגדן לואיס X Calbiochem 434631
ביו Biotinylated BSA (בקרה חיובית) ביו תוצרת בית N / A

1. השולחן רשימת לקטינים ונוגדנים שימוש בפרוטוקול זה.

שם / s מגיב ציוד חברה מספר קטלוגי
ללא מגע microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate דיג 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray שקופיות Gentel PATH
Slide Imprinter (לא חובה) החברה ג'ל WSP60-1
מטרף דיג 15-453-211
סרכזת Eppendorf 5804 000.013
החלק כביסה אגן / שקופיות תבשיל מכתים Wiה נשלף ארון תקשורת דיג 08-812
הדגירה שקופיות תא / מיקרוסקופ שקופיות תיבת דיג 03-448-5
Brij 35, 30 W / V הפתרון% במים Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 דיג P337-100
נתרן Periodate (NaIO 4) סיגמא 311448
L-גלוטמית חומצה γ-hydrazide סיגמא G-7257
אצטט וסודיום (CH 3 COONa) סיגמא S2889
שור סרום אלבומין (BSA) Lampire ביולוגית Labs 7500804
מאגר מלוחים פוספט (PBS) (10X) Denville מדעי CP4390-48
Dylight 549 מצומדות NeutrAvidin Thermo 22837
מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות רוש 4693159001
ChromPure האדם IgG, קטע Fc ג'קסון Immunoresearch 009-000-008
ChromPure לנוגדנים אנושיים, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 009-000-003
ChromPure עכבר IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 015-000-003
ChromPure עכבר IgG, קטע Fc ג'קסון Immunoresearch 015-000-008
ChromPure הארנב IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 011-000-003
ChromPure חמור IgG, כל מולקולה ג'קסון Immunoresearch 017-000-003
Microarray סורק טקאן LS מחדש

טבלה 2. רשימהשל ציוד ריאגנטים שימוש בפרוטוקול זה.

תוכנית 1
תוכנית 1 תוכנית המציגה את microarray נוגדנים lectin מבוסס גילוי סמן ביולוגי glycan תהליך 1 (שלב 2 עד 4): בלוק חוסם עם microarray נוגדנים (Glu-hydrazide) ו - BSA, 2 (שלב 5).. להחיל דגימות סרום וללכוד גליקופרוטאינים ספציפיים עם נוגדנים ספציפיים: 3 (שלב 6): להחיל lectin biotinylated (ים): 4 (שלב 7): בדיקה אאל biotinylated עם NeutrAvidin 549 Dylight מיועד לשימוש microarray הדמיה.

איור 1
באיור 1. Microarray תמונות של פרופיל ניסוי לדוגמא glycosylation 1 של גליקופרוטאינים בסרום מספר במדגם החולה HCC בסרום באמצעות chemicברית חסם microarray נוגדנים עם זיהוי lectin נפוצה. שתי שקופיות microarray זהים, (א) לא חסום מבחינה כימית, או (ב) חסם כימית כמתואר בשלב 2, הן עברו את כל השלבים 2 עד 9 עבור פרופיל glycosylation, כמו גם למטרות השוואה. (א) ו - (ב) הם תמונות microarray סרק א 8 ב רזולוציה של 10 מיקרון. (ג) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של אף חסמו כימית שקופיות microarray (א) (ד) זום בתמונה של שתי השורות הראשונות של השקופית לא microarray חסם כימית (ב)); (ה) תרשים של ההסדר נוגדנים בתוך subarray כל אחד; (F) מפות מערך: מיקומו של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות: (ז) מדגם סרום ומיקום lectin: כך עולה דיאגרמות אשר subarray כל מדגם בסרום lectin יושם על.

איור 2
2. איור microarray תמונותהניסוי מדגם 2 מסך fucosylation שונה על גליקופרוטאינים בדם סמנים ביולוגיים ספציפיים כמו המפלים שחמת הכבד בחולים HCC. Assay microarray בוצע כמתואר בסעיף ניסוי 2 לדוגמא. (א) תמונה שלמה של שקופיות שקופיות microarray משלב 8 (ב) בתרשים ההסדר נוגדנים בתוך subarray זה: (ג) מערך: מפות מיקום של נוגדנים בתוך כל subarray, כל שם מייצג נוגדנים 3 נקודות; (ד) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם מדגם בסרום: (ה) זום בתמונה של subarray שהיו מודגרות עם PBS שליטה.

איור 3
איור 3. תוצאות Glycan אפיון של הניסוי מדגם 1. כל גרף עמודות מייצגים פרופיל מחייב lectin (או פרופילים glycan) של אחד חלבון 20 במבחן. סך הכל 22 לקטינים שונים שימשו לניתוח הדואר glycan פרופיל של כל חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1. היעד חלבון נוגדן הבחירה ללכוד

לפני assay microarray נוגדנים, חומרים כימיים וחומרים מסוימים יש צורך לקחת בחשבון ומוכן. לעצב microarray נוגדנים עבור פרופיל glycan או סמן ביולוגי glycan ההקרנה, פאנל של נוגדנים ספציפיים למועמדים גליקופרוטאין צריך להיקבע על פי הספרות או תוצאות קודמות. נוגדנים אלה נרכשו בדרך כלל מיצרנים שונים, כגון מחקר ופיתוח מערכות וכו 'IgGs עדיפים נוגדנים ללכוד מאז הבדיקות הקודמות שלנו הראו כי חלק IgM ו-IgE עלול לאבד לחלוטין את זיקות מחייבות אנטיגן שלהם לאחר שינוי כימי.

2. עיצוב וייצור של נוגדנים microarray

ייצור של נוגדנים microarray היא צעד אופציונלי אשר צריך microarrayer מקצועי יקר, מאומנים היטב אנשי לפעולה. עם זאת, אישית נוגדנים microarray תעשייהture ניתן לעשות זאת בקלות מספק שירותים כגון Serome Biosciences בע"מ לתוצאה חזקים, אנו ממליצים microarrayer ללא מגע, כגון נפח sciFLEXARRAYER Scienion אולטרה נמוכה ללא מגע microarrayer ששימש בייצור נוגדנים שלנו microarray. גבוה מחייב microarray קיבולת שקופיות, כגון הנתיב (Gentel ביו בע"מ WI) או שקופיות H (Shott, הרשות הפלסטינית).

3. בחר ולהכין חלבונים מחייב Glycan (Gbps) על פרופיל glycosylation

Gbps כי היעד שונה מונו או אוליגוסכרידים ניתן למצוא בספרות והן באמצעות מנוע החיפוש שפותח על ידי מעבדת Haab 29 ומתוחזק במכון Genomics Translational כדי לבחור Gbps עם סגוליות זיקה גבוהה וכדיאת אפיטופים glycan ממוקדות, בחר את המוטיב (epitope) מתוך התפריט הנפתח ולחץ על "חיפוש". ספציפית Gbps ל מוטיב זה (epitope) יירשם לפי שווי logP שלהם גבוהה לסדר נמוכה. גבוה logP עולה זיקה מחייבת חזק וספציפיות כדי מוטיב glycan / epitope. עקב בעיה לא מוגדרת הטבועה מחייב מ lectin, שיטה זו עדיין אינה אופטימלית כמו assay המבוסס על נוגדנים. לכן, אנו ממליצים בחום נגד glycan נוגדנים משמשים, כגון אנטי לואיס X או נגד sialyl לואיס נוגדנים, אם הם זמינים. השימוש Gbps מרובים לאיתור עוד אסטרטגיה לחצות לבדוק פרופילים מחייב שונים כדי לקבל נתונים אמינים מחייב.

4. ניתוח נתונים

כי שיטה זו משמשת כדי לזהות חלבונים בסרום מקומיים, חלבונים מתחמי יכול להיות בשבי זוהה. המערבי כתם או ספקטרומטריית מסה הוא שיטות טובות כדי לאמת את נתוני microarray. בינתיים, זיהוי של רמות החלבון באמצעות microarray אותו היא שיטה אחרת, ללמוד את הפרטים של שינוי glycosylation של חלבון, כגון האם השינויים הם תוצאה של שינוי רמת סך החלבון או סתם כי רמת glycosylation עלה על כל אחד החלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הפטיטיס ומחקר וירוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 63 גליקופרוטאינים glycan מחייב חלבון glycosylation חלבון מסוים מרובב תפוקה גבוהה glycan microarray הנוגדן חסם
נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J.,… More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter