Summary
본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.
Protocol
1. 분석을위한 항체 Microarray 인쇄
- 0.5 MG / 인산염 완충 식염수, 산도 7.2 (PBS)의 ML에 모든 항체를 희석.
- 384 잘 소스 판으로 나누어지는 각 항체의 40 μl합니다.
- Scienion의 sciFLEXARRAYER의 microarrayer에 384 잘 소스 판을로드합니다.
- 목표로 microarrayer에 20의 PATH 환경 microarray 슬라이드를로드합니다.
- 27 항체 및 제어 단백질이 9x9 패턴 (그림 1E, 1F)에서 세중의에서 발견되는 48 동일 subarrays를 인쇄할 microarrayer를 설정합니다.
- 항체 microarray 슬라이드를 인쇄 microarrayer를 시작합니다.
- 항체 microarray 슬라이드를 수집하고, 건조가있는 슬라이드 카세트에 그들을 저장합니다. 진공 실러 (Foodsaver)를 사용하여 비닐 봉투에 카세트를 밀봉 진공 청소기.
- 4에 ° C 냉장고에 밀폐 microarray 슬라이드를 저장합니다.
2. 화학적 GBP을 방지하기 위해 항체 Microarray를 차단캡처 항체에 바인딩
microarray 분석은 microarray 슬라이드가 화학적으로 차단됩니다 한번 시작하고 약 8 시간 지속됩니다. 일단 microarray 분석이 완료되어야 시작했습니다 (단계 2-8).
- microarray는 냉장고에서 꺼내 슬라이드 타고 30 분 동안 실내 온도로 평형을 유지하다.
- 0.1 % 십대 초반 (CBT0와 15 밀리미터 아세트산 나트륨 버퍼 산도 5.0에서 다음 저장 상자에서 슬라이드를 제거하고 간단히 분지 닦고 슬라이드에 한 번 0.1 % 십대 초반 20 (PBST0.1)와 인산염 완충 식염수 산도 7.2에서 그들을 씻어하고, 0.1) 연속 패션 인치 슬라이드 세탁 분지에서 10 분 동안 CBT0.1에서 슬라이드를 품어.
- 15 MM 나트륨 아세테이트 버퍼 산도 5.0 (CB)에서 신선한 150 MM NaIO 4를 준비하고 사용 전 빛을 피하면서 냉장고에 분지를 해주고 슬라이드로에 보관하십시오.
- CB에서 슬라이드를 제거하고, 항체 측면과 함께 신선한 NaIO 4를 포함하는 유역에 넣어만은. 빛을 피하고, 부드러운가 냉장고에서 4 ° C에서 흔들림과 함께 12 시간 동안 슬라이드 분지 부화 알루미늄 호일과 유역을 포괄합니다.
- CB 10 MM 히드라 지드 glutamic 산 (차단기) 300 ML을 준비합니다.
- 분지에서 슬라이드를 제거하고, 짧게 3 회 오분 슬라이드 세척 유역의 각 시간에 CB에 린스.
- 부드러운 진동으로 실온에서 2 시간 동안 세척 분지 차단기의 슬라이드를 품어.
- 분지에서 슬라이드를 제거, 3 분 동안 PBST0.1으로 그들을 씻는다.
3. 소 혈청 알부민과 Microarray에 비 특정 바인딩을 차단 (BSA)
- 슬라이드 세탁 분지 0.5 % 십대 초반 (PBST0.5)와 인산염 완충 식염수 산도 7.2에서 1 % BSA 300 ML을 준비하고, 부드럽게 흔들어으로 실온에서 1 시간 분지에서 microarray 슬라이드를 품어.
- 삼분 때마다 PBST0.1 세번에 슬라이드를 씻어.
- 슬라이드를 올려microarray 슬라이드를 건조하기 위해 2 분을 원심 분리에 1,200 XG에서 슬라이드 랙, 그리고 스핀에서.
4. 각 Subarray를 구분할 수 Microarray 슬라이드쪽으로 인쇄물 왁스 그리드
- 70 왁스 imprinter 미리 가열을 15 분 ° C에서.
- 왁스로 향하게 항체 측면과 왁스 imprinter으로 차단된 microarray 슬라이드를로드합니다. 부드럽게 골고루 슬라이드로 인쇄물 왁스로 핸들을 당기십시오.
5. Microarray 슬라이드로 세럼 샘플을 적용
- 2.4 단계 동안 여러 샘플 (5.1.2) 중에서 한 표본에 glyco 프로 파일링 분석 (5.1.1) 또는 단일 glyco epiptope 측정 중 하나에 대한 혈청 샘플을 준비합니다.
- 여러 GBPs합니다 (샘플 실험 1 참조)을 사용하여 하나씩 혈청 시료에서 여러 혈청 glycoproteins의 glycan profilings에 대한 실험에서는, 혈청 샘플은 모든 subarrays에 적용됩니다. 이 경우, 40 μl 혈청 충분한은 0.1 %를 포함하는 PBS 360 μl에 희석되어십대 초반-20, 0.1 % Brij 35, 100 μg / 마우스 IgG, 100 μg / 쥐 IgG의 ML, 100 μg / 토끼 IgG, 100 μg / 산양 IgG의 ML 100 μg / 당나귀 IgG의 ML의 ML의 ML. 이 볼륨은 각 subarray에 희석 혈청 용액 중 6 μl를 적용하기위한 충분합니다.
- 한 GBP 탐지합니다 (샘플 실험 2 참조)를 사용하여 여러 개의 혈청 샘플 간의 여러 혈청 단백질에 관한 한 glycan 측정을위한 실험합니다. 이 경우, 1 μl 혈청 충분한는 PBS가 0.1 %를 포함하는 9 μl에 희석되어 십대 초반-20, 0.1 % Brij 35, 마우스 IgG, 100 μg / 쥐 IgG의 ML, 100 μg / 토끼 IgG의 ML 100 μg / ML , 100 μg / 산양 IgG과 100 μg / 당나귀 IgG의 ML의 ML. 이 볼륨은 각 subarray에 희석 혈청 용액 중 6 μL를 적용하기위한 충분합니다.
- 4 단계에서 왁스 인쇄물은 조심스럽게 슬라이드의 각 subarray로 희석 시료 또는 제어 샘플 6 μL (PBST0.1)를 적용한 후에. 상온에서 젖은 종이 타월로 humidified 카세트에서 슬라이드를 품어1 시간 정도.
- 삼분 각 시간 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 씻어.
- 이분에 대한 1,200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.
6. 슬라이드에 Biotinylated GBP을 (렉틴 또는 안티 glycan 항체) 적용
- 2.4 단계 동안 PBST0.1에 biotinylated lectins / GBPs의 10μg/ml를 준비합니다.
- glycan 프로 파일링 실험에서 여러 lectins와 프로브 한 샘플 (샘플 실험 1) 모든 subarrays하기에 충분 biotinylated 렉틴 350 μL를 준비니다.
- 여러 lectins를 사용하여 여러 샘플에서 단일 glycan 에피토프 / biomarker 심사에서는, subarray하기에 충분 각 biotinylated 렉틴 10 μl를 준비합니다.
- 슬라이드의 각 subarray로 희석된 biotinylated 렉틴 (들) 6 μL를 적용, 1 시간 동안 실온에서 젖은 종이 타월로 humidified 슬라이드 상자에서 품어.
- 삼분 각 TI에 대해 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 헹구어나.
- 이분을위한 원심 분리기 1200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.
7. 형광 검출을위한 염료 라벨 NeutrAvidin를 적용
- 모든 subarrays하기에 충분 Dylight 549 분류 NeutrAvidin 350 μL를 준비합니다.
- 각 subarray에 Dylight 549 분류 NeutrAvidin 6 μL를 적용, 1 시간 동안 실온에서 humidified 슬라이드 카세트에서 슬라이드를 품어.
- 삼분 각 시간 PBST0.1 세번으로 슬라이드를 씻어.
- 이분을위한 원심 분리기 1200 XG에 그것을 회전하여 슬라이드를 건조합니다.
8. 슬라이드를 스캔하여 Microarray 슬라이드 이미지를 구합니다
- 10 μm의 해상도에서 형광 microarray 스캐너를 사용하여 슬라이드를 검사합니다. 레이저와 PMT 설정은 최대한 강해 져야한다,하지만 포화 지점을 준수하지 않습니다.
9. 데이터 추출 및 분석
- ArrayPro 3.2 이미지를 엽니다. 항체 명소 위치를 보여주는 배열의지도에 따라 배열 템플릿을 설정합니다. 조심스럽게 이미지의 해당 지점에 각 템플릿 원을 맞춥니다.
- 추가 분석을 위해 엑셀 파일에 각 지점의 강도의 압축을 풉니다.
10. 대표 결과
샘플 실험 1
여러 lectins 검출과 화학적 차단 항체 microarray를 사용하여 간세포암 환자의 혈청 샘플에서 여러 혈청 glycoproteins의 글리코 실화 프로 파일링.
이 실험의 목표는 렉틴 탐지와 화학적으로 차단 항체 microarray를 사용하여 간세포암 (HCC) 환자의 혈청 샘플의 20 glycoproteins의 개별 글리코 실화 프로필을 탐구하는 것입니다. S에서 설명한대로 26 항체와 비오틴-BSA를 포함 48 동일한 subarrays를 포함 항체 microarray는, 설계 및 제조되었습니다한 tep. 이러한 26 항체는 표 1에서와 같이 대량 spectrometric 단백질 식별 12, 32와 결합 렉틴 기반 immunoprecipitation를 사용하여 HCC 환자에 대한 조기 진단 가치를 약속하는 것으로 판별 20 혈청 glycoproteins에 반대했다. 한 대표 subarray의 세중의에 인쇄된 항체 명소의 패턴과 배열은 각각 그림 1E 및 1 층에 표시됩니다. 다른 하나는 (그림 1B), 분석 화학적 차단 절차의 중요성을 설명하기 위해 동일한 글리코 실화 프로 파일링 실험을 수행하는 데 사용된 동안 두 개의 동일한 microarray 슬라이드, 하나는 화학적, (그림 1A) 차단 아니었어요. 화학적 차단 슬라이드 (그림 1B)의 경우 실험은 2 단계에서 시작; 없음 화학적으로 차단 슬라이드 (그림 1A)에 대해, 실험은 3 단계부터 시작했습니다. 실험 따라와에 의해 실시되었다g 단계 5.1.2과 6.1.2를 제외한 프로토콜에 설명된 모든 단계. 단계 5.2에서 PBST0.1 제어 예제는 컬럼 1과 3의 subarrays에 적용되었고, 풀링된 HCC 혈청 샘플 (그림 1G 참조) 컬럼이 각각 4, 관련 subarrays에 적용되었다. 이 비교는 화학적으로 차단 후 효과, 절차의 효율성뿐만 아니라 항체의 항원 결합 친화력을 보여주는 것입니다. 글리코 실화 프로 파일링을 위해 그림 1G 같이 다른 glycans 18, 20 ~ 구체적인 각 subarray에 적용되었다는 22 biotinylated lectins합니다 (표 1 참조). 프로토콜에 따라 글리코 실화 프로 파일링 분석 후 화학적으로 차단 (그림 1B)와 조미료를 차단합니다 (그림 1A) microarrays의 이미지. 마찬가지로 조미료를 차단 microarrays (그림 1A 및 그림 1C), 열의 1과 3의 subarrays에 표시되는에오직 PBST0.1 대부분 lectins는 항체를 캡처하는 구속, 적용 및 혈청 샘플을 적용하는 컬럼 2, 4, 사람들을 subarrays에 해당 비교할 매우 높은 배경을 보여줬습니다. 그것은이 microarray 슬라이드에서 glycan의 프로필 정보를 얻는 것은 불가능합니다. 반대로 같은 실험을 화학적으로 차단 항체 microarray 슬라이드에서 수행했을 때, 열 1과 유일한 PBST0.1이 적용되었다되는 3의 subarrays, 대부분의 lectins는 항체를 캡처 없거나 매우 낮은 바인딩을 보여주 없으며 당분간 높은 항원 바인딩은 여전히 혈청 샘플 (그림 1B와 1D) 적용된있는, 컬럼 2, 4 subarrays에서 관찰되었다. 이러한 결과는 화학적으로 차단 절차 항체-캡처한 glycoproteins에 glycans의 측정 이물 중요한 단계였다 보여주었다. 프로토콜에 따라, HCC 혈청 22 glycoproteins의 글리코 실화 프로파일 얻을 수 있습니다.
실험 2
변경된 fucos위한 화면차별 간의 간경변 및 간세포암 환자에 대한 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에 ylation.
이 실험의 목표는 간암 간경변과 간세포암 (HCC) 환자를 차별 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에서 변경된 fucosylation위한 화면입니다. 이러한 분석에 하나의 혈청 샘플은 모든 subarrays에 적용된 각종 lectins로 탐지되었다하는 실험 1, HCC 및 간경변 환자에서 총 40 가지 혈청 시료에서 서로 다른 각 subarray에 적용, 하나의 렉틴 (AAL로 탐지되었습니다 ). 이러한 T 테스트, 리시버 - 운영 특성 (ROC) 곡선과 같은 통계 분석은 배포판 또는 모든 혈청 샘플의 각 개별 단백질의 glycan epiptope / biomarker의 진단 성능을 평가하기 위해 이루어졌다. 우리는이 연구에서 안티 CA19-9 및 안티 루이스 X의 항체를 제외한 실험 1에서 제조된 동일한 항체 microarray를 사용했습니다. experiment는 단계 5.1.1와 6.1.1을 제외하고 9 단계로 9월 2일에서 실시되었다. 총 20 간경변 40 혈청 샘플 및 20 HCC 환자가 부정적인 컨트롤과 같은 컨트롤 PBS 샘플과 함께 48 subarrays의 무작위 subarray에서 적용되었다. 각 캡처된 단백질의 Fucosylation 그 후 biotinylated Fucose 특정 렉틴를 사용하여 감지되었습니다. 그림 1에 표시된 microarray 이미지는 대신 캡처한 항체의 microarray (그림 2D) (그림 2E)에서 캡처한 혈청 단백질에 바인딩 렉틴 AAL을 보여주었다. 모든 명소 AAL 바인딩 농도는 다음 추출하고, HCC 및 간경변 그룹 간의 차별의 각 혈청 단백질의 fucosylation (AAL 결합 강도)의 성능을 평가하는 T 테스트 및 ROC 곡선을 사용하여 분석되었다. 결과는 GP73 단백질의 fucosylation가 P와 함께 = 0.03를 두 그룹 사이에 최고의 차별을 준 지역 언더파-것으로 나타났다ROC 곡선의 곡선은 0.72로 같습니다. 이 실험은이 절차는 여러 단백질 내에서 여러 샘플에서 glycan의 에피토프 / biomarker 검사를위한 신속하고 효율적인 방법입니다 보여주었다.
| 신분증 | 시약의 이름 | 약어 | 회사 | # 카탈로그 |
| L1 | Biotinylated Concanavalin | ConA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L2 | Biotinylated Sambucus Nigra의 렉틴 | SNA | 벡터 연구소 | B-1305 |
| L3 | Biotinylated 렌즈 Culinaris Agglutinin | LCA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L4 | Ricinus Communis Agglutinin 봐도 Biotinylated | RCA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| 5 번 | Biotinylated Aleuria Aurantia의 렉틴 | AAL | 벡터 연구소 | B-1395 |
| L6 | Biotinylated Erythrina Cristagalli의 렉틴 | ECL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L7 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia 렉틴 II | GSL II | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L8 | Biotinylated 밀 배아 Agglutinin | WGA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L9 | Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Erythroagglutinin | PHA-E | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| 10 파운드 라니 | Biotinylated Phaseolus vulgaris의 Leucoagglutinin | PHA-L | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L11 | 바이오tinylated 땅콩 Agglutinin | PNA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L12 | Pisum Sativum Agglutinin을 Biotinylated | PSA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L13 | Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | DBA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L14 | Biotinylated 흰독말풀의 가시독말풀의 렉틴 | DSL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L15 | Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | SJA | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L16 | Biotinylated 대두 Agglutinin | SBA | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L17 | Biotinylated Solanum Tuberosum (감자) 렉틴 | STL | 벡터 연구소 | BK-3000 </ TD> |
| L18 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia의 렉틴 I | GSL 전 | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L19 | Biotinylated Vicia 비오의 렉틴 | VVL | 벡터 연구소 | BK-2000 |
| L20 | Biotinylated Lycopersicon Esculentum (토마토) 렉틴 | LEL | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| L21 | Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin 전 | UEA 전 | 벡터 연구소 | BK-1000 |
| L22 | Biotinylated Jacalin | JACALIN | 벡터 연구소 | BK-3000 |
| A1 | 염소 F (AB ') 2 조각 반 인간 IgM, Fc5μ 항체 | IgM | 잭슨 Immuno 연구 | 109-006-129 |
| A2 | 돈키 F (AB ') 2Frag 안티 - 인간 IgG (H + L) 항체 | AB1 | 잭슨 Immuno 연구 | 709-006-149 |
| A3 | 마우스 안티 인간 IgG F (AB ') 2 단클론 항체 | AB3 | 잭슨 Immuno 연구 | 209-005-097 |
| A4 | 염소 안티 인간의 알파 2 macroglobulin polyclonal 항체 | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 | A1AT | 리 Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | 마우스 안티 인간 알파-1-antitrypsin 단클론 항체 | A1AT | 시그마 알드리치 | SAB4200198 |
| A7 | 토끼 반 인간 알파-1-antitrypsin polyclonal 항체 | 주문 | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | 토끼 반 인간 알파 -1 - 익살스러운 몸짓hymotrypsin polyclonal 항체 | 주문 | 피셔 과학 | RB9213R7 |
| A9 | 마우스 안티 인간 트랜스페린 단클론 항체 | 트랜스페린 | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | 토끼 반 인간 트랜스페린 polyclonal 항체 | 트랜스페린 | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | 염소 안티 인간 apolipoprotein J polyclonal 항체 | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 | GP73 | 애보트 | 14H4-23 |
| A13 | 마우스 안티 인간 GP73 단클론 항체 | GP73 | 산타 크루즈 생명 공학 INC | SC-101275 |
| A14 | 토끼 반 인간의 알파 페토 프로테인-1 polyclonal 항체 | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | 마우스 안티 인간의 알파 페토 프로테인-1 단클론 항체 | AFP | 피츠제럴드 | 10-A05A |
| A16 | 마우스 안티 인간 hemopexin 단클론 항체 | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| 대답 17 | 마우스 안티 인간 glypican-3 (1G12) 단클론 항체 | GPL3 | 산타 크루즈 바이오 | SC-65443 |
| 대답 18 | 마우스 안티 인간 Kininogen (LMW) 단클론 항체 | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
| 대답 19 | 토끼 반 인간 MMP-21 단클론 항체 | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | 마우스 안티 인간 CEACAM-1 단클론 항체 | CEACAM | R & D 시스템 | MAB1180 |
| 21 | 쥐 안티 인간 DPPIV/CD26 단클론 항체 | DPPIV | R & D 시스템 | MAB22441 |
| 대답 22 | 마우스 안티 인간 PIVKA II 단클론 항체 | PIVICA | 크리스탈 화학 | 8040 |
| 대답 23 | 마우스 안티 carcinoembryonic 항원 | CEA | 미국 생물학 | C1300 |
| 대답 24 | 마우스 방지 CA125 암 항원 | CA125 | 미국 생물학 | C0050-01D |
| 대답 25 | 마우스 방지 CA19-9 암 항원 | CA19-9 | 미국 생물학 | C0075-18 |
| 대답 26 | 마우스 방지 루이스 X 단클론 항체 | 루이스 X | Calbiochem | 434,631 |
| 바이오 | Biotinylated BSA (긍정적인 제어) | 바이오 | 집에서 만든 | N / A |
이 프로토콜에서 사용 lectins 및 항체의 표 1.리스트.
| 시약 S / 장비의 명칭 | 회사 | 카탈로그 번호 |
| 비 접촉 microarrayer | BioDot INC | sciFLEXARRAYER |
| 384 microplate | 어부 | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray는 슬라이드 | Gentel | PATH |
| 슬라이드 Imprinter (옵션) | 젤 회사 | WSP60-1 |
| 흔드는 사람 | 어부 | 15-453-211 |
| 원심 분리기 | Eppendorf | 5804 000.013 |
| 분지 / 슬라이드 염색법 요리 WI 닦고 슬라이드일 이동식 랙 | 어부 | 08-812 |
| 슬라이드 배양 챔버 / 현미경 슬라이드 박스 | 어부 | 03-448-5 |
| Brij 35, 물 30 W / V % 용액 | Acros의 생명체 | AC32958-0025 |
| 십대 초반-20 | 어부 | P337-100 |
| 나트륨 Periodate (NaIO 4) | 시그마 | 311,448 |
| L-글루탐산 γ-히드라 지드 | 시그마 | G-7257 |
| 나트륨 아세테이트 무수 (CH 3 COONa) | 시그마 | S2889 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Lampire 생물학 실험실 | 7,500,804 |
| 인산 버퍼 식염수 (PBS) (10X) | Denville 과학 | CP4390-48 |
| Dylight 549 복합 NeutrAvidin | 써모 | 22,837 |
| 테아제 억제제 칵테일 정제 | 로슈 | 4693159001 |
| ChromPure 인간 IgG, FC 조각 | 잭슨 Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure 인간 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure 마우스 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure 마우스 IgG, FC 조각 | 잭슨 Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure 토끼 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure 돈키 IgG, 전체 분자 | 잭슨 Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray 스캐너 | Tecan | LS는 리로디드 |
표 2.리스트이 프로토콜에 사용되는 장비와 시약의.
계획은 1 glycan의 biomarker 발견 과정 1 (2 단계 4) 기반 렉틴 항체 microarray 보여주는 방식 : 차단기 (GLU - 히드라 지드)와 BSA와 항체 microarray 차단, 2 (5 단계) :.. 혈청 샘플을 적용하고 캡처 특정 항체와 특정 glycoproteins, 3 (6 단계) :; 프로브 microarray 이미징을위한 Dylight 549 분류 NeutrAvidin와 biotinylated AAL. 4 (7 단계) biotinylated 렉틴 (들)을 적용
chemic 사용하여 HCC 환자 혈청 샘플에서 여러 혈청 glycoproteins의 샘플 실험 1 글리코 실화 프로 파일링의 그림 1. Microarray 이미지동맹국은 여러 렉틴 검출과 항체 microarray를 차단했습니다. 두 개의 동일한 microarray 슬라이드는 () 아무도 화학적으로 차단하지, 또는 (b) 화학적으로 차단과 같은 2 단계의 설명에 모두 모두 글리코 실화 프로 파일링 2부터 9 단계뿐만 아니라 비교 용도로 갔다. (A)와 (B) microarray 이미지는 10 미크론의 해상도에서 8 단계에서 스캔합니다. 비 화학적 차단 microarray 슬라이드 (B))의 처음 두 행의 이미지 (D) 확대,, (C) 없음의 처음 두 행의 이미지의 확대는 화학적으로 microarray 슬라이드 () 차단 (E) 각 subarray 내에서 항체 배열의 다이어그램, (F) 배열지도 : subarray 각 항체의 위치, 각 항체 이름 3 장소를 나타내는, (G) 혈청 샘플과 렉틴 장소 : 각 혈청 샘플을 subarray 다이어그램 보여주 및 렉틴가에 적용되었다.
의 그림 2. Microarray 이미지간암 간경변 및 HCC 환자를 차별하는 생체 같은 특정 혈청 glycoproteins에서 변경된 fucosylation위한 샘플 실험이 화면. 샘플 실험이 섹션에서 설명한대로 microarray 분석이 실시되었다. () 8 단계에서 microarray 슬라이드의 전체 슬라이드 이미지가 있으며, 각 subarray 내에 항체 배열의 (B) 그림은, (C) 배열지도 : subarray 각 항체의 위치, 각 항체 이름은 3 반점을 나타냅니다; (D) 확대의 혈청 샘플과 함께 incubated 있었다 subarray의 이미지를, (E) 줌 - 인 PBS 제어 incubated 있었다 subarray의 이미지입니다.
그림 3. 샘플 실험 1에서 Glycan 프로 파일링 결과입니다. 각 막대 그래프가 20 테스트를 거친 단백질 중 하나의 렉틴 결합 프로파일 (또는 glycan 프로필에) 나타냅니다. 총 22 가지 lectins는 일을 분석하기 위해 사용되었다각 단백질의 전자 glycan 프로필.
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Discussion
1. 대상 단백질과 캡처 항체 선택
항체 microarray 분석에 앞서, 몇 가지 시약 및 재료는 고려가 필요하고 준비가되어 있습니다. glycan 프로 파일링 또는 glycan의 biomarker 검사, 당단백질 후보에 대한 특정 항체의 패널에 대한 항체 microarray를 디자인하기 위해서는 문학에 또는 이전 결과에 따라 결정되어야한다. 이러한 항체는 일반적으로 이러한 R & D 시스템 등 IgGs 등 다양한 업체에서 구입했습니다 이전 테스트를 몇 가지 IgM과 IGE 완전히 화학적 변형 후에 그들의 항원 결합 동질성을 잃을 수도 보여준 이후 캡처 항체를 선호하고 있습니다.
2. 디자인 및 항체 microarray의 제조
항체 microarray의 제조는 전문적이고 비싼 microarrayer, 그리고 작업에 대한 잘 훈련된 인력이 필요한 단계는 선택 사항입니다. 그러나, 맞춤형 항체 microarray manufac진짜야가 쉽게 강력한 결과에 대한 이러한 Serome Biosciences 주식 회사와 같은 서비스 제공 업체에서 할 수 있습니다, 우리는 우리의 항체 microarray 제작에 사용되었다 아닌 문의 microarrayer Scienion의 sciFLEXARRAYER 초저 볼륨으로, 비 접촉 microarrayer을 추천합니다. 같은 경로 (Gentel 바이오 주식 회사 WI) 또는 슬라이드 H (Shott, PA)와 같은 높은 결합 용량 microarray 슬라이드.
3. 글리코 실화 프로 파일링을 위해 Glycan 바인딩 단백질 (GBPs)을 선택하고 준비
GBPs 그 목표 다른 모노 또는 oligosaccharides는 문헌과 Haab 실험실 29에 의해 개발 및 Translational 지노 믹스 연구소에서 관리하고 검색 엔진을 통해 찾을 수 있습니다 높은 특이성과 친화도가있는 GBPs 선택하려면타겟 glycan의 epitopes는 드롭 다운 메뉴에서 모티브 (에피토프)을 선택한 다음 "검색." 이러한 모티브 (에피토프)에 GBPs 구체가 낮은 순서로 높은에서 그들의 logP 값에 따라 나열됩니다. 높은 logP는 glycan의 모티브 / 에피토프에 강한 구속력 친화력과 특이성을 나타냅니다. 렉틴에서 고유하지 않은 특정 바인딩 문제로 인해이 방법은 아직 항체 기반의 분석만큼 최적 않습니다. 그들이있는 경우 따라서, 우리는 강력하게 같은 반 루이스 X 또는 방지 sialyl 루이스 항체로, 그 백신 glycan 항체가 사용됩니다 좋습니다. 검출 여러 GBPs의 이용은 다른 바인딩 프로파일을 확인 횡단하고 안정적인 데이터 바인딩을 얻는 또 다른 전략이다.
4. 데이터 분석
이 방법은 원시 혈청 단백질을 감지하는 데 사용되기 때문에 단백질 단백질 단지는 캡처 및 검색됩니다. 서양 얼룩이나 질량 분광법은 microarray 데이터의 유효성을 검사하는 것은 좋은 방법이다. 그 사이에같은 microarray를 사용하여 단백질 수준의 검출은 변경 글리코 실화 수준이 단백질의 각 상승 단지 총 단백질 레벨의 변화 또는에 의한 것이라 여부 등 단백질 글리코 실화의 변경의 세부 사항을 배우는 또 다른 방법입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 간염과 바이러스 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
| Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
| Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
| Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
| Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
| Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
| Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
| Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
| Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
| Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
| Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
| Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
| Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
| Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| 384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
| Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. | |||
References
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