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Biology

रासायनिक अवरुद्ध जटिल नमूने में मल्टिप्लेक्स उच्च throughput विशिष्ट प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की रूपरेखा के लिए एंटीबॉडी माइक्रोएरे

Published: May 4, 2012 doi: 10.3791/3791
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

Summary

इस अध्ययन में, हम एक multiplexed lectin पहचान पद्धति है कि विशिष्ट प्रोटीन का ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ उच्च throughput एंटीबॉडी माइक्रोएरे के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल के नए विश्वसनीय अभिकर्मकों सुविधाओं और काफी समय, लागत, और प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकताओं के रूप में पिछले प्रक्रिया की तुलना में कम कर देता है.

Protocol

1. प्रिंट परख के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे

  1. फॉस्फेट बफर खारा, 7.2 पीएच (पीबीएस) में 0.5 मिलीग्राम / मिलीग्राम सभी एंटीबॉडी पतला.
  2. 384 अच्छी तरह से स्रोत थाली में प्रत्येक एंटीबॉडी के 40 μl अशेष भाजक.
  3. Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer पर 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट लोड.
  4. लक्ष्य के रूप में microarrayer पर 20 पथ माइक्रोएरे स्लाइड लोड.
  5. Microarrayer सेट करने के लिए 48 समान subarrays, जिसमें 27 एंटीबॉडी और नियंत्रण प्रोटीन एक 9x9 पैटर्न (चित्रा 1E, 1F) में तीन प्रतियों में देखा जाता है मुद्रित करने के लिए.
  6. Microarrayer शुरू करने के लिए एंटीबॉडी माइक्रोएरे स्लाइड मुद्रित.
  7. एंटीबॉडी माइक्रोएरे स्लाइड ले लीजिए, और उन्हें desiccant के साथ स्लाइड कैसेट की दुकान में. निर्वात एक प्लास्टिक की थैली में वैक्यूम मुहर Foodsaver () का उपयोग करके कैसेट सील.
  8. 4 बजे ° रेफ्रिजरेटर में सी स्टोर सील माइक्रोएरे स्लाइड.

2. रासायनिक ब्लॉक एंटीबॉडी माइक्रोएरे GBP रोकेंकब्जा एंटीबॉडी के लिए बाध्य

माइक्रोएरे परख एक बार शुरू होता है माइक्रोएरे स्लाइड रासायनिक अवरुद्ध कर रहे हैं और के बारे में 8 घंटे के लिए रहता है. एक बार माइक्रोएरे परख शुरू करने के लिए पूरा हो गया है (2 से 8 कदम).

  1. लो माइक्रोएरे रेफ्रिजरेटर से बाहर स्लाइड, और उन्हें 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान को संतुलित करना.
  2. निकालें और भंडारण बॉक्स से स्लाइड संक्षेप में उन्हें फॉस्फेट बफर खारा पीएच 7.2 में 0.1% 20 बीच (PBST0.1) के साथ एक बेसिन धोने स्लाइड में कुल्ला एक बार, और फिर 15 मिमी सोडियम एसीटेट बफर पीएच 5.0 से 0.1% के बीच (CBT0 में 0.1 एक अनुक्रमिक फैशन में). CBT0.1 में स्लाइड धोने बेसिन में 10 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
  3. 15 मिमी सोडियम एसीटेट बफर पीएच 5.0 (सीबी) में ताजा 150 मिमी 4 NaIO तैयार है, और यह एक रेफ्रिजरेटर में बेसिन धोने के उपयोग करने से पहले प्रकाश से परहेज करते समय स्लाइड में रहते हैं.
  4. सीबी से स्लाइड निकालें, और यह एंटीबॉडी पक्ष के साथ ताजा 4 NaIO युक्त बेसिन में डाल दियाऊपर का सामना करना पड़. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बेसिन प्रकाश से बचने के लिए, और 2 घंटे के लिए एक रेफ्रिजरेटर के कोमल डिग्री सेल्सियस 4 झटकों के साथ स्लाइड बेसिन सेते हैं.
  5. सीबी में 10 मिमी hydrazide glutamic एसिड (अवरोधक) के 300 एमएल तैयार.
  6. बेसिन से स्लाइड निकालें, और संक्षेप में 5 मिनट स्लाइड धोने बेसिन में हर समय के लिए 3 बार सीबी में यह कुल्ला.
  7. कोमल झटकों के साथ एक कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए धोने बेसिन में अवरोधक में स्लाइड्स सेते हैं.
  8. बेसिन से स्लाइड निकालें, और उन्हें PBST0.1 3 मिनट के लिए के साथ धो लो.

3. माइक्रोएरे के लिए गोजातीय सीरम albumin के साथ गैर विशिष्ट बाइंडिंग ब्लॉक (बीएसए)

  1. 0.5% बीच (PBST0.5) के साथ एक स्लाइड धोने बेसिन में फॉस्फेट बफर खारा 7.2 पीएच में 1% BSA के 300 मिलीलीटर, तैयार है और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से मिलाते साथ बेसिन में माइक्रोएरे स्लाइड सेते हैं.
  2. PBST0.1 तीन बार में 3 मिनट प्रत्येक समय के लिए स्लाइड कुल्ला.
  3. स्लाइड रखोएक स्लाइड रैक, और 2 माइक्रोएरे स्लाइड सूखी मिनट के लिए एक centrifugation पर 1200 XG पर और स्पिन पर.

4. छाप लिए माइक्रोएरे प्रत्येक Subarray के अलग स्लाइड पर ग्रिड वैक्स

  1. मोम imprinter में 70 प्री - हीटिंग ° 5 मिनट के लिए सी.
  2. प्रतिरक्षी मोम का सामना करने के पक्ष के साथ मोम imprinter में अवरुद्ध माइक्रोएरे स्लाइड लोड. धीरे छाप मोम संभाल स्लाइड पर समान रूप से खींच.

5. माइक्रोएरे स्लाइड पर सीरम नमूने लागू करें

  1. 2.4 चरण के दौरान, या तो एक नमूने में glyco रूपरेखा परख (5.1.1), या कई नमूने (5.1.2) के बीच एक glyco epiptope माप के लिए सीरम के नमूने तैयार करते हैं.
    1. कई Gbps (1 प्रयोग नमूना देखें) का उपयोग करके एकाधिक सीरम एक सीरम के नमूने में glycoproteins की glycan profilings के लिए एक प्रयोग में, एक सीरम नमूनों सभी subarrays पर लागू किया जाएगा. इस मामले में, 40 μl सीरम पर्याप्त पीबीएस के 360 μl 0.1% युक्त में पतला हैबीच-20, 0.1% 35 बृज, माउस आईजीजी, 100 μg / एमएल की चूहा आईजीजी, खरगोश आईजीजी, 100 / μg बकरी आईजीजी एमएल और 100 μg / गधा आईजीजी की मिलीलीटर की 100 μg / एमएल 100 μg / एमएल. इस मात्रा प्रत्येक subarray पर पतला सीरम समाधान के 6 μl लागू करने के लिए पर्याप्त है.
    2. एक प्रयोग में एक glycan माप GBP detections (2 प्रयोग नमूना देखें) का उपयोग करके कई सीरम नमूनों के बीच कई सीरम प्रोटीन पर के लिए. इस मामले में, 1 μl सीरम पर्याप्त पीबीएस युक्त 0.1% की 9 μl में पतला है बीच - 20, 0.1% बृज 35, 100 / μg एमएल माउस आईजीजी, चूहा आईजीजी 100 μg / एमएल, 100 μg / एमएल की खरगोश आईजीजी 100 μg / एमएल की बकरी आईजीजी और 100 / μg गधा आईजीजी की एमएल. इस मात्रा प्रत्येक subarray पर पतला सीरम समाधान के 6 μL लागू करने के लिए पर्याप्त है.
  2. चरण 4 में मोम के बाद छाप, ध्यान से स्लाइड का प्रत्येक subarray पतला नमूना या नियंत्रण के नमूने के 6 μL (PBST0.1) लागू. कमरे के तापमान पर गीला कागज तौलिये के साथ एक humidified कैसेट में स्लाइड सेते हैं1 घंटे के लिए.
  3. PBST0.1 हर बार 3 मिनट के लिए तीन बार के साथ स्लाइड कुल्ला.
  4. यह 2 मिनट के लिए 1200 XG पर कताई द्वारा स्लाइड सूखी.

6. स्लाइड पर Biotinylated GBP (lectin या विरोधी glycan एंटीबॉडी) लागू करें

  1. 2.4 चरण के दौरान, PBST0.1 में biotinylated lectins / Gbps के 10μg/ml को तैयार करते हैं.
    1. Glycan रूपरेखा प्रयोग में है कि जांच एकाधिक lectins के साथ एक नमूना (नमूना 1 प्रयोग), 350 biotinylated lectin μL तैयार है कि सभी subarrays के लिए पर्याप्त है.
    2. एकल एकाधिक lectins का उपयोग करके glycan का मिलान / biomarker के कई नमूने में स्क्रीनिंग में, प्रत्येक biotinylated lectin कि एक subarray के लिए पर्याप्त है 10 μl तैयार.
  2. स्लाइड का प्रत्येक subarray, पतला biotinylated lectin (ओं) की 6 μL लागू करें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गीला कागज तौलिये के साथ humidified स्लाइड बॉक्स में सेते हैं.
  3. कुल्ला PBST0.1 तीन बार के साथ 3 प्रत्येक ती मिनट के लिए स्लाइडमुझे.
  4. यह 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में 1200 XG पर कताई द्वारा स्लाइड सूखी.

7. प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए डाई NeutrAvidin लेबल लागू करें

  1. 549 लेबल NeutrAvidin Dylight के 350 μL है कि सभी subarrays के लिए पर्याप्त है तैयार.
  2. प्रत्येक subarray पर Dylight 549 लेबल NeutrAvidin की 6 μL लागू करें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर humidified स्लाइड कैसेट में स्लाइड को सेते हैं.
  3. PBST0.1 हर बार 3 मिनट के लिए तीन बार के साथ स्लाइड कुल्ला.
  4. 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में 1200 XG पर यह कताई द्वारा स्लाइड सूखी.

8. स्लाइड स्कैन द्वारा माइक्रोएरे स्लाइड छवि प्राप्त

  1. 10 माइक्रोन संकल्प पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोएरे स्कैनर का उपयोग करके स्लाइड स्कैन. लेजर और पी एम टी सेटिंग्स के रूप में संभव के रूप में मजबूत होना चाहिए, लेकिन कोई संतृप्ति जगह मनाया जाता है.

9. डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण

  1. छवि में 3.2 ArrayPro खोलें. सरणी सरणी नक्शा कि एंटीबॉडी स्पॉट स्थानों से पता चलता है के अनुसार टेम्पलेट सेट करें. ध्यान से छवि में इसी स्थान पर प्रत्येक टेम्पलेट चक्र संरेखित करें.
  2. आगे के विश्लेषण के लिए एक Excel फ़ाइल में प्रत्येक स्थान की तीव्रता निकालें.

10. प्रतिनिधि परिणाम

नमूना एक प्रयोग

ग्लाइकोसिलेशन कई lectins का पता लगाने के साथ रासायनिक अवरुद्ध एंटीबॉडी माइक्रोएरे का उपयोग करके एकाधिक सीरम hepatocellular कार्सिनोमा रोगी के सीरम के नमूने में glycoproteins की रूपरेखा.

इस प्रयोग के लक्ष्य hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) रोगी सीरम नमूना में lectin पता लगाने के साथ रासायनिक अवरुद्ध एंटीबॉडी माइक्रोएरे का उपयोग करके 20 glycoproteins की व्यक्तिगत ग्लाइकोसिलेशन प्रोफ़ाइल का पता लगाने के लिए है. एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे,, कि 48 समान subarrays जो 26 एंटीबॉडी और बायोटिन-BSA बनाया गया था और निर्मित के रूप में एस में वर्णितएक चरण है. इन 26 एंटीबॉडी 20 सीरम glycoproteins कि lectin आधारित सामूहिक spectrometric 12 प्रोटीन की पहचान, के रूप में 32 तालिका 1 में दिखाया के साथ संयुक्त immunoprecipitation का उपयोग कर के द्वारा एचसीसी रोगियों के लिए शीघ्र निदान मूल्य का वादा के रूप में पहचान के खिलाफ थे. और एंटीबॉडी एक प्रतिनिधि subarray में तीन प्रतियों में मुद्रित स्पॉट के पैटर्न व्यवस्था से चित्रा 1E और 1F में दिखाए जाते हैं, क्रमशः. दो समान माइक्रोएरे स्लाइड, एक रासायनिक (चित्रा 1 ए) अवरुद्ध है, जबकि अन्य एक (चित्रा 1 बी), वही ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा प्रयोग के लिए बाहर ले जाने के क्रम में विश्लेषण के लिए रासायनिक अवरुद्ध प्रक्रिया के महत्व को प्रदर्शित इस्तेमाल किया गया था नहीं था. रासायनिक अवरुद्ध स्लाइड (चित्रा 1 बी) के लिए, प्रयोग चरण 2 में शुरू कर दिया है, कोई भी रासायनिक अवरुद्ध स्लाइड (चित्र 1 ए) के लिए, चरण 3 से प्रयोग शुरू कर दिया. प्रयोग followin के द्वारा किया गयाजी 5.1.2 और 6.1.2 चरण के लिए छोड़कर सभी प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों. 5.2 चरण में, एक PBST0.1 नियंत्रण नमूना स्तंभ 1 और 3 में subarrays पर लागू किया गया था, और एक जमा एचसीसी सीरम नमूना स्तंभ 2 और 4, क्रमशः में subarrays पर लागू किया गया था (के रूप में चित्र 1G में दिखाया गया है). यह तुलना करने के लिए रासायनिक अवरुद्ध करने के बाद प्रभावशीलता, प्रक्रिया की दक्षता के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी के प्रतिजन बाध्य संबंध दिखाने के लिए है. के 22 biotinylated (तालिका 1 में दिखाया गया है) lectins कि विभिन्न 18 glycans, 20 विशिष्ट प्रत्येक subarray पर लागू किया गया के रूप में ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा के लिए 1G चित्र में दिखाया गया. रासायनिक (चित्रा 1 बी) अवरुद्ध और गैर रासायनिक अवरुद्ध (चित्र 1 ए) प्रोटोकॉल का पालन करके ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा परख के बाद डीएनए की छवियाँ. जैसा कि गैर रासायनिक अवरुद्ध (चित्र 1 ए और चित्रा 1C) प्रोटीन, में स्तंभ 1 और 3 में subarrays में दिखाया गया है जिस परPBST0.1 ही लागू किया गया था सबसे lectins एंटीबॉडी पर कब्जा करने के लिए बाध्य है, और बहुत अधिक है कि स्तंभ 2 और 4 में उन subarrays जो सीरम नमूना पर लागू किया गया था करने के लिए तुलनीय पृष्ठभूमि से पता चला. इस माइक्रोएरे स्लाइड से glycan प्रोफ़ाइल जानकारी प्राप्त करने के लिए असंभव है. इसके विपरीत, जब एक ही प्रयोग एक रासायनिक अवरुद्ध एंटीबॉडी माइक्रोएरे स्लाइड पर किया गया था, में subarrays स्तंभ 1 और 3, जिस पर केवल PBST0.1 लागू किया गया था, सबसे lectins नहीं या बहुत कम बाइंडिंग से पता चला एंटीबॉडी पर कब्जा, जबकि उच्च प्रतिजन बाइंडिंग अभी भी स्तंभ 2 और 4 में थे subarrays में मनाया, जिस पर सीरम नमूना (चित्रा 1 बी और 1D) लागू किया गया था. इन परिणाम से पता चला रासायनिक अवरुद्ध प्रक्रिया एंटीबॉडी glycoproteins पर कब्जा कर लिया glycans के माप सामने एक महत्वपूर्ण कदम था. प्रोटोकॉल का पालन करके, एचसीसी सीरम में 22 glycoproteins की ग्लाइकोसिलेशन प्रोफाइल प्राप्त किया जा सकता है.

2 प्रयोग

बदल fucos के लिए स्क्रीनभेदभाव लीवर सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा के रोगियों के लिए बायोमार्कर के रूप में विशिष्ट सीरम glycoproteins पर ylation.

इस प्रयोग के लक्ष्य बायोमार्कर के रूप में विशिष्ट सीरम glycoproteins कि लीवर सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) रोगियों भेदभाव पर बदल fucosylation के लिए स्क्रीन के लिए है. 1 प्रयोग, इस परख में जो में केवल एक सीरम नमूना हर subarrays पर लागू किया गया था और विभिन्न lectins के साथ जांच की, कुल 40 एचसीसी और सिरोसिस के रोगियों से अलग सीरम नमूनों से अलग प्रत्येक subarray पर लागू किया गया, और एक lectin (AAL के साथ जांच ). टी परीक्षण, रिसीवर ऑपरेटिंग विशेषता वक्र (आरओसी), के रूप में सांख्यिकीय विश्लेषण, वितरण या glycan / सीरम के नमूने में प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन पर epiptope biomarker के नैदानिक ​​प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था. हम विरोधी CA19-9 और इस अध्ययन में विरोधी लुईस एक्स एंटीबॉडी के अलावा एक ही एंटीबॉडी माइक्रोएरे एक प्रयोग में निर्मित इस्तेमाल किया. अनुभवiment 2 सितम्बर से किया गया 5.1.1 और 6.1.1 चरण के लिए छोड़कर 9 कदम. 20 सिरोसिस से कुल 40 सीरम के नमूने और 20 एचसीसी रोगियों नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नियंत्रण पीबीएस नमूनों के साथ साथ 48 subarrays यादृच्छिक subarray पर लागू किया गया. प्रत्येक कब्जा कर लिया प्रोटीन की fucosylation तो विशेष biotinylated lectin Fucose का उपयोग करके पाया गया. चित्र 1 में दिखाया माइक्रोएरे छवि lectin केवल सीरम प्रोटीन माइक्रोएरे पर कब्जा कर लिया एंटीबॉडी के बजाय (चित्र 2 डी) (चित्रा 2 ई) पर कब्जा करने के लिए बाध्य AAL प्रदर्शन किया. सभी स्थानों के AAL बाध्यकारी तीव्रता, तो निकाले गए थे और टी परीक्षण और आरओसी घटता का उपयोग करने के लिए एचसीसी और सिरोसिस समूहों के बीच भेदभाव पर प्रत्येक सीरम प्रोटीन की fucosylation (AAL बाध्यकारी तीव्रता) के प्रदर्शन का मूल्यांकन विश्लेषण किया. नतीजे बताते हैं कि एक पी के साथ दो समूहों के बीच भेदभाव सबसे अच्छा प्रोटीन की fucosylation GP73 दिया = 0.03 और क्षेत्र के तहतROC वक्र वक्र 0.72 के बराबर होती है. इस प्रयोग का प्रदर्शन इस प्रक्रिया glycan स्क्रीनिंग पर कई प्रोटीन के भीतर कई नमूने का मिलान biomarker / के लिए एक तेजी से, कुशल तरीका है.

आईडी अभिकर्मक का नाम संक्षिप्तीकरण कंपनी # सूची
L1 Biotinylated एक Concanavalin ConA वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L2 Biotinylated Sambucus नाइग्रा lectin SNA वेक्टर प्रयोगशालाओं बी 1305
L3 Biotinylated लेंस Culinaris Agglutinin एलसीए वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L4 Ricinus Communis Agglutinin मैं Biotinylated आरसीए वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L5 Biotinylated Aleuria Aurantia lectin AAL वेक्टर प्रयोगशालाओं बी 1395
L6 के Biotinylated Erythrina Cristagalli lectin ईसीएल वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000
L7 Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectin द्वितीय GSL द्वितीय वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000
L8 Biotinylated गेहूं रोगाणु Agglutinin WGA वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L9 Biotinylated Phaseolus vulgaris के Erythroagglutinin पीएचए - ई वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L10 Biotinylated Phaseolus vulgaris के Leucoagglutinin पीएचए - एल वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L11 बायोtinylated मूंगफली Agglutinin PNA वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L12 मंजिष्ठा Agglutinin Biotinylated पीएसए वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L13 Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin यूके वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L14 Biotinylated नशा एक प्रकार का धतूरा lectin डीएसएल वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000
L15 Biotinylated Sophora बिही Agglutinin SJA वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L16 Biotinylated सोयाबीन Agglutinin एसबीए वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L17 Biotinylated सोलेनम (आलू) Tuberosum lectin STL वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000 </ P>
L18 मैं biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectin GSL मैं वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L19 Biotinylated Vicia Villosa lectin VVL वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-2000
L20 Biotinylated Lycopersicon (टमाटर) Esculentum lectin लेल वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000
L21 Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin मैं UEA है मैं वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-1000
L22 Biotinylated Jacalin JACALIN वेक्टर प्रयोगशालाओं बीके-3000
A1: बकरी एफ (अब) 2 टुकड़ा विरोधी मानव आईजीएम, Fc5μ प्रतिरक्षी आईजीएम जैक्सन इम्यूनो रिसर्च 109-006-129
A2 में गधा (अब) एफ 2Frag विरोधी मानव आईजीजी प्रतिरक्षी (एच एल +) AB1 जैक्सन इम्यूनो रिसर्च 709-006-149
A3 माउस विरोधी मानव आईजीजी (अब) एफ 2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी AB3 जैक्सन इम्यूनो रिसर्च 209-005-097
ए 4 बकरी विरोधी मानव अल्फा 2 macroglobulin पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी A2M GeneTex GTX62924
A5 खरगोश विरोधी मानव अल्फा-1-antitrypsin पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी A1AT ली Biosiences CA1T-80A
उ 6 माउस विरोधी मानव अल्फा-1-antitrypsin मोनोक्लोनल एंटीबॉडी A1AT सिग्मा Aldrich SAB4200198
7 खरगोश विरोधी मानव अल्फा-1-antitrypsin पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी अधिनियम NeoMarkers आरबी 367 - A1
A8 खरगोश विरोधी मानव अल्फा-1-विलक्षणhymotrypsin पॉलीक्लोनल प्रतिपिण्ड अधिनियम फिशर साइंटिफिक RB9213R7
A9 माउस विरोधी मानव transferrin मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Transferrin GeneTex GTX101035
A10 खरगोश विरोधी मानव transferrin पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी Transferrin GeneTex GTX77130
A11 बकरी विरोधी मानव अपोलीपोप्रोटीन जम्मू पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी ApoJ Abcam ab7610
A12 माउस विरोधी मानव GP73 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी GP73 Abbott है 14H4 - 23
A13 माउस विरोधी मानव GP73 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी GP73 सांता क्रूज़ जैव प्रौद्योगिकी कांग्रेस SC-101,275
A14 खरगोश विरोधी मानव अल्फा - 1 fetoprotein पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी एएफपी जीenWay GWB-41C966
A15 माउस विरोधी मानव अल्फा-1 fetoprotein मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एएफपी फित्ज़्गेराल्ड 10-A05A
A16 माउस विरोधी मानव hemopexin है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Hemopexin Assaypro 60,190-05,011
A17 विरोधी मानव (1G12) glypican 3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस GPL3 सांता क्रूज़ जैव SC - 65,443
A18 माउस विरोधी मानव Kininogen है (LMW) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Kininogen Assaypro 20,333-05,011
A19 खरगोश विरोधी मानव एमएमपी 21 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी MMP21 Epitomic 1955-1
A20 माउस विरोधी मानव CEACAM है 1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी CEACAM अनुसंधान एवं विकास सिस्टम MAB1180
एक21 चूहा विरोधी मानव DPPIV/CD26 के मोनोक्लोनल एंटीबॉडी DPPIV अनुसंधान एवं विकास सिस्टम MAB22441
A22 माउस विरोधी मानव PIVKA द्वितीय मोनोक्लोनल एंटीबॉडी PIVICA क्रिस्टल रसायन 8040
A23 माउस प्रतिजन विरोधी - carcinoembryonic सीईए अमेरिकी जैविक C1300
A24 विरोधी CA125 माउस कैंसर एंटीजन CA125 अमेरिकी जैविक C0050-01D
A25 माउस विरोधी CA19-9 कैंसर प्रतिजन CA19 - 9 अमेरिकी जैविक C0075-18
A26 माउस विरोधी लुईस एक्स मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लुईस एक्स Calbiochem 434,631
जैव Biotinylated BSA (सकारात्मक नियंत्रण) बायो घर का बना N / A

टेबल lectins और एंटीबॉडी इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की सूची 1.

अभिकर्मक / उपकरणों के नाम कंपनी सूचीपत्र संख्या
गैर संपर्क microarrayer BioDot इंक sciFLEXARRAYER
384 microplate मछुआ 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate माइक्रोएरे स्लाइड Gentel पथ
स्लाइड imprinter (वैकल्पिक) जेल कंपनी WSP60 - 1
एक प्रकार के बरतन मछुआ 15-453-211
अपकेंद्रित्र Eppendorf 5804 000.013
बेसिन / स्लाइड धुंधला डिश वाई धोने स्लाइडवें हटाने योग्य रैक मछुआ 08-812
स्लाइड का ऊष्मायन स्लाइड / कक्ष खुर्दबीन बॉक्स मछुआ 03-448-5
35 बृज, 30 w / v पानी में% समाधान Acros ऑर्गेनिक्स AC32958-0025
बीच - 20 मछुआ P337-100
सोडियम Periodate (4 NaIO) सिग्मा 311,448
एल Glutamic एसिड γ - hydrazide सिग्मा जी 7257
सोडियम एसीटेट निर्जल (सीएच 3 COONa) सिग्मा S2889
गोजातीय सीरम albumin (BSA) के Lampire जैविक लैब्स 7500804
फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा (10X) Denville वैज्ञानिक CP4390 - 48
Dylight 549 संयुग्मित NeutrAvidin थर्मो +२२८३७
Protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोलियाँ रॉश 4693159001
ChromPure मानव आईजीजी, एफसी टुकड़ा जैक्सन Immunoresearch 009-000-008
ChromPure मानव आईजीजी, पूरे अणु जैक्सन Immunoresearch 009-000-003
ChromPure माउस आईजीजी, पूरे अणु जैक्सन Immunoresearch 015-000-003
ChromPure माउस आईजीजी, एफसी टुकड़ा जैक्सन Immunoresearch 015-000-008
ChromPure खरगोश आईजीजी, पूरे अणु जैक्सन Immunoresearch 011-000-003
ChromPure गधा आईजीजी, पूरे अणु जैक्सन Immunoresearch 017-000-003
माइक्रोएरे स्कैनर Tecan लोकसभा रीलोडेड

तालिका 2 सूची.इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता उपकरणों और अभिकर्मकों की.

एक योजना
योजना 1 lectin एंटीबॉडी आधारित glycan biomarker खोज की प्रक्रिया 1 (2 करने के लिए चरण 4) माइक्रोएरे दिखा योजना: ब्लॉक अवरोधक (Glu - hydrazide) और BSA के साथ एंटीबॉडी माइक्रोएरे, 2 (5.). सीरम नमूनों को लागू करने और कब्जा विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट glycoproteins, 3 (6): जांच माइक्रोएरे इमेजिंग के लिए Dylight 549 लेबल NeutrAvidin के साथ biotinylated AAL. 4 (7.) biotinylated lectin (ओं) लागू

चित्रा 1
चित्रा 1. रसायन का उपयोग करके नमूना प्रयोग 1 एचसीसी रोगी के सीरम के नमूने में कई सीरम glycoproteins की ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा के माइक्रोएरे छवियोंसहयोगी एकाधिक lectin का पता लगाने के साथ एंटीबॉडी माइक्रोएरे अवरुद्ध. दो समान माइक्रोएरे स्लाइड, (ए) कोई भी रासायनिक अवरुद्ध, या (बी) के रूप में रासायनिक अवरुद्ध चरण 2 में वर्णित, दोनों ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा के लिए 2 से 9 के लिए कदम के रूप में अच्छी तरह से तुलना उद्देश्य के माध्यम से चला गया. (ए) और (ख) माइक्रोएरे चित्र 10 माइक्रोन का एक संकल्प में चरण 8 पर स्कैन कर रहे हैं. (डी) गैर रासायनिक अवरुद्ध माइक्रोएरे स्लाइड (बी)) की पहली दो पंक्तियों की छवि में ज़ूम, (सी) कोई नहीं की पहली दो पंक्तियों की छवि में ज़ूम रासायनिक माइक्रोएरे (ए) स्लाइड अवरुद्ध (ई) प्रत्येक subarray भीतर एंटीबॉडी व्यवस्था के चित्र, (एफ) सरणी नक्शे: प्रत्येक एंटीबॉडी के स्थान subarray भीतर हर प्रतिरक्षी नाम के 3 स्थानों का प्रतिनिधित्व करता है, (D) सीरम नमूना और lectin स्थान: एक चित्र से पता चलता है जो प्रत्येक सीरम नमूना subarray के और lectin पर लागू किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. माइक्रोएरे छवियोंbiomarkers कि लीवर सिरोसिस और एचसीसी रोगियों भेदभाव के रूप में विशिष्ट सीरम glycoproteins पर बदल fucosylation के लिए नमूना प्रयोग 2 स्क्रीन. माइक्रोएरे परख नमूना प्रयोग धारा 2 में वर्णित के रूप में किया गया. (ए) चरण 8 से माइक्रोएरे स्लाइड के पूरे स्लाइड छवि, (बी) प्रत्येक subarray भीतर एंटीबॉडी व्यवस्था के चित्र, (सी) सरणी नक्शे: subarray भीतर प्रत्येक एंटीबॉडी के स्थान, हर प्रतिरक्षी नाम के 3 स्पॉट का प्रतिनिधित्व करता है; (डी) में ज़ूम - छवि एक subarray है कि सीरम नमूना के साथ incubated रहे थे, (ई) एक ज़ूम में एक subarray कि पीबीएस नियंत्रण के साथ incubated रहे थे की छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3 नमूना प्रयोग एक से glycan रूपरेखा परिणाम. प्रत्येक बार ग्राफ 20 परीक्षण प्रोटीन lectin बंधन प्रोफ़ाइल (या glycan प्रोफाइल) के प्रतिनिधित्व करते हैं. कुल 22 अलग lectins वें विश्लेषण किया गयाई प्रत्येक प्रोटीन की glycan प्रोफ़ाइल.

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Discussion

1. लक्ष्य प्रोटीन और एंटीबॉडी पर कब्जा चयन

एंटीबॉडी माइक्रोएरे परख के लिए पहले, कुछ अभिकर्मकों और सामग्री के लिए विचार किया जाना आवश्यक हैं और तैयार है. Glycan रूपरेखा या glycan biomarker स्क्रीनिंग, ग्लाइकोप्रोटीन उम्मीदवारों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के एक पैनल के लिए एक एंटीबॉडी माइक्रोएरे डिजाइन साहित्य या पिछले परिणामों के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए. ये एंटीबॉडी आमतौर पर अनुसंधान एवं विकास सिस्टम आदि IgGs के रूप में विभिन्न विक्रेताओं से खरीदे गए थे पर कब्जा एंटीबॉडी पसंद कर रहे हैं के बाद से हमारे पिछले परीक्षणों से पता चला कि कुछ आईजीएम और IgE के रासायनिक संशोधन के बाद पूरी तरह से उनके प्रतिजन बाध्यकारी समानताएं खो सकते हैं.

2. एंटीबॉडी माइक्रोएरे के डिजाइन और निर्माण

एंटीबॉडी माइक्रोएरे का निर्माण एक वैकल्पिक कदम है जो पेशेवर और महंगी microarrayer, और ऑपरेशन के लिए अच्छी तरह से प्रशिक्षित कर्मियों की जरूरत है. हालांकि, अनुकूलित एंटीबॉडी माइक्रोएरे निर्माणऊपरी आसानी से परिणाम के लिए एक मजबूत Serome Biosciences इंक के रूप में एक सेवा प्रदाता से किया जा सकता है, हम Scienion sciFLEXARRAYER अल्ट्रा कम गैर संपर्क microarrayer मात्रा के जो हमारे एंटीबॉडी माइक्रोएरे निर्माण में इस्तेमाल किया गया था के रूप में एक गैर संपर्क microarrayer, सलाह देते हैं. (Gentel जैव इंक WI) पथ या स्लाइड एच (Shott, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के रूप में उच्च बाध्यकारी क्षमता माइक्रोएरे स्लाइड.

3. चयन और ग्लाइकोसिलेशन रूपरेखा के लिए glycan बंधनकारी प्रोटीन (Gbps) की तैयारी

Gbps कि लक्ष्य अलग मोनो या oligosaccharides साहित्य में और Haab प्रयोगशाला द्वारा 29 विकसित और translational जीनोमिक्स संस्थान में बनाए रखा है एक खोज इंजन के माध्यम से पाया जा सकता है उच्च विशिष्टता और आत्मीयता के साथ Gbps चयनलक्षित glycan epitopes, ड्रॉप डाउन मेनू से आकृति (मिलान) का चयन करें, और क्लिक करें "खोज." इस आकृति (मिलान) Gbps विशिष्ट उनके logP मूल्य से कम आदेश के लिए उच्च करने के लिए अनुसार सूचीबद्ध किया जाएगा. उच्च logP एक मजबूत बाध्य संबंध और glycan आकृति / मिलान करने के लिए विशिष्टता इंगित करता है. निहित गैर विशिष्ट lectin से बाध्यकारी मुद्दे के कारण, इस पद्धति अभी भी रूप में एंटीबॉडी आधारित परख के रूप में इष्टतम नहीं है. इस प्रकार, हम दृढ़ता से अनुशंसा करते हैं कि विरोधी glycan एंटीबॉडी उपयोग किया जाता है, विरोधी लुईस एक्स या विरोधी sialyl एक एंटीबॉडी लुईस के रूप में, अगर वे उपलब्ध हैं. कई Gbps का पता लगाने के लिए उपयोग एक और रणनीति के पार विभिन्न बंधन प्रोफाइल की जाँच करें और विश्वसनीय डेटा बाइंडिंग प्राप्त है.

4. डेटा विश्लेषण

क्योंकि इस विधि देशी सीरम प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों और कब्जा किया जा सकता का पता चला. पश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्री अच्छा माइक्रोएरे डेटा को मान्य करने के तरीकों है. इस बीच, प्रोटीन माइक्रोएरे वही प्रयोग के स्तर का पता लगाने के प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन परिवर्तन के जैसे कि परिवर्तन कुल प्रोटीन का स्तर बदल सकते हैं या सिर्फ इतना है कि ग्लाइकोसिलेशन स्तर प्रोटीन के प्रत्येक पर वृद्धि के कारण थे, विवरण जानने के लिए एक और तरीका है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम हेपेटाइटिस वायरस और अनुसंधान के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

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आण्विक जीवविज्ञान 63 अंक glycoproteins glycan बंधनकारी प्रोटीन विशिष्ट प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन उच्च throughput glycan अवरुद्ध एंटीबॉडी माइक्रोएरे मल्टिप्लेक्स
रासायनिक अवरुद्ध जटिल नमूने में मल्टिप्लेक्स उच्च throughput विशिष्ट प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की रूपरेखा के लिए एंटीबॉडी माइक्रोएरे
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Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J.,… More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

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