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Biology

化学阻断抗体芯片复用高通量的复杂样品中特定蛋白糖基化的剖析

Published: May 4, 2012 doi: 10.3791/3791
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 4, 1
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

Summary

在这项研究中，我们描述了一个复用高通量抗体芯片与外源凝集素的检测方法，可以在特定的蛋白质糖基化分析改进协议。该协议提供了新的可靠的试剂和显着降低，相比以前的程序的时间，成本和实验室设备的要求。

Abstract

在这项研究中，我们描述了一个用于在复用高通量抗体芯片与糖结合蛋白检测，允许特定蛋白质的糖基化分析的有效协议。蛋白质糖基化是最常见的翻译后修饰，对蛋白质的发现，导致多元化的修改的物理，化学，生物学特性和蛋白质。由于糖基化机制是特别容易受到疾病的进展和恶性转化，异常糖基化已被确认为癌症和其他疾病的早期检测标志物。然而，目前的方法来研究蛋白糖基化通常是在最普通的实验室或临床的设置和使用更实用的方法来研究蛋白糖基化需要过于复杂或昂贵。在这项研究中所描述的新的协议，使得与糖结合使用的化学阻断抗体芯片蛋白（GBP）检测，并显着减少的时间，成本和实验室设备，需要研究蛋白糖基化的要求。在此方法中，多个固定的糖蛋白特异性抗体直接打印到芯片的幻灯片和抗体的N-糖链被封锁。受阻，固定糖蛋白特异性抗体能够捕获和隔离从一个复杂的样品，直接应用到芯片幻灯片糖蛋白。聚糖检测，然后可以进行生物素标记的凝集素和其他Gbps的芯片幻灯片的应用，而具有约束力的水平可以决定使用Dylight 549-链霉。通过使用多个生物素标记的凝集素抗体面板和探测，这种方法可以有效的发展，在一个特定的人或动物样品中发现的不同的蛋白质糖基化的文件。

介绍

蛋白糖基化，这是我S的 ​​最普遍的对蛋白质翻译后的修改，修改的物理，化学，生物特性的一种蛋白质，在1-6各种生物过程中起着根本性的作用。由于糖基化机制是特别容易受到疾病的进展和恶性转化已被公认为早期发现癌症和其他疾病的7-12生物标志物，异常糖基化。事实上，目前大多数肿瘤标志物，如三级分数的α-1，甲胎蛋白（法新社）13-15肝癌，胰腺癌16 CA199检测，有17个是所有异常的糖蛋白的糖基。然而，研究蛋白糖基化的方法已经复杂，不适合常规实验室和临床设置。 Chen 等最近发明了一种化学阻断抗体芯片1糖结合蛋白（GBP），高吞吐量的检测方法在一个复杂的样品18届复轮廓本土糖蛋白的糖基化。多个固定的糖蛋白特异性抗体的亲和力在此基础芯片的方法，捕捉和隔离从复杂的混合物，直接对芯片的幻灯片的糖蛋白，对每一个人捕获的蛋白聚糖GBPS测量。因为所有正常的抗体含有N-糖链最Gbps的，可以确认，这种方法的关键步骤是化学阻断抗体聚糖结合英镑。在此过程中，CI S-二醇组抗体聚糖被首先氧化成醛基使用醋酸钠缓冲液避光NAIO 4。醛基肼组的交联剂，4 - （4 N-MaleimidoPhenyl的）丁酸盐酸肼（MPBH），随后的二肽，半胱氨酸，甘氨酸，酰亚胺组，共轭共轭MPBH。从而被转换成笨重没有羟基，这阻碍了外源凝集素和其他Gbps的绑定捕获抗体，聚糖对抗体的顺式二醇组。这堵过程使Gbps和外源凝集素结合，只捕获蛋白聚糖。阻断后，这个化学，血清标本聚糖检测，通过使用不同的生物素标记的凝集素和Gbps的抗体芯片孵育，用Cy3-链霉亲和观察。抗体面板和探测多个外源凝集素的并行使用提供了在一个给定的样本18-20离散多种蛋白质糖基化型材。该方法已成功地应用于多个不同的实验室1，7，13，19-31。然而，影响稳定MPBH和半胱氨酸，甘氨酸，复杂性和扩展的过程，在这个方法的重复性，该方法的有效性和效率。在这个新的协议，我们更换一个更加稳​​定MPBH和半胱氨酸，甘氨酸试剂谷氨酸肼（GLU-肼），从而显着提高了简化的方法，重现性和缩短整个程序，以便它可以在一个工作日内完成。在这个新的协议，我们描述的详细程序的协议，可以很容易地通过正常的实验室常规蛋白糖基化研究和技术，这是要获得可重复性和可重复的结果。

Protocol

1。打印检测抗体芯片

  1. 所有的抗体稀释至0.5毫克/毫升磷酸盐缓冲液，pH值7.2（PBS）的。
  2. 40μl每个抗体的分装成384井源板。
  3. ，Scienion sciFLEXARRAYER的微阵列加载到384井源板。
  4. 20 PATH芯片幻灯片加载到微阵列为目标。
  5. 设置打印48个相同的子阵发现在一个9x9的模式（ 图1E，1F）一式三份，其中27个抗体和控制蛋白质微阵列。
  6. 启动微阵列打印抗体芯片的幻灯片。
  7. 收集的抗体芯片的幻灯片，在幻灯片与干燥剂的录像带和存储。真空密封在一个塑料袋，用真空封口机（Foodsaver）录像带。
  8. 在4°C冰箱中保存的密封芯片的幻灯片。

2。化学座抗体芯片，以防止英镑捕获抗体结合

基因芯片检测开始后的芯片幻灯片化学堵塞，持续约8小时。一旦启动芯片分析已完成（步骤2至8）。

  1. 采取的芯片滑出冰箱，，和室温平衡30分钟。
  2. 从储物箱中取出的幻灯片，并简要磷酸盐缓冲液pH值7.2 0.1％吐温20（PBST0.1）在洗手盆幻灯片冲洗一次，然后在15毫米醋酸钠缓冲液pH值5.0与0.1％吐温（CBT0 .1）在一个连续的方式。在CBT0.1孵育的幻灯片，在幻灯片洗手盆10分钟。
  3. 新鲜的150毫米NAIO 4，准备在15毫米醋酸钠缓冲液pH值5.0（CB），并保持它在冰箱洗衣机盆地，而避免使用前，成幻灯片。
  4. 从CB删除的幻灯片，并放入含有抗体方面的新鲜NAIO 4盆朝上。用铝箔覆盖的盆地，以避免光，幻灯片盆地温柔的震动在4°C冰箱孵育2小时。
  5. 准备300毫升10毫米肼谷氨酸CB（阻滞剂）。
  6. 从盆地中删除的幻灯片，并简要冲洗3次，每次5分钟的时间在幻灯片洗手盆的CB。
  7. 在室温下2小时在洗涤盆轻轻摇动孵育阻滞剂幻灯片。
  8. 从盆地中删除的幻灯片，并用3分钟PBST0.1。

3。阻止非特异性绑定的芯片与牛血清白蛋白（BSA）的

  1. 准备300毫升1％BSA的磷酸盐缓冲液pH值7.2，0.5％吐温（PBST0.5）在幻灯片洗手盆，并在盆地的芯片幻灯片孵育1小时在室温下轻轻晃动。
  2. 冲洗在PBST0.1三次，每次3分钟的幻灯片。
  3. 放幻灯片幻灯片架，并在1200 XG离心2分钟，晾干芯片幻灯片上的自旋。

4。印记蜡电网到芯片的幻灯片来分隔每个子阵

  1. 预热70蜡打印机°C 5分钟。
  2. 装入抗体方面临的蜡蜡压印封锁芯片幻灯片。轻轻一拉手柄到幻灯片的印记蜡均匀。

5。血清样品应用到芯片的幻灯片

  1. 在2.4步，准备一个样本或者糖分析法（5.1.1），或单的糖epiptope测量多个样品（5.1.2）之间的血清标本。
    1. 在一个血清样品中的糖蛋白，通过使用多个吉比特（见样本实验1）多个血清糖profilings实验，血清样品将被应用到所有的子阵列。在这种情况下，40微升血清充足稀释成360μL含0.1％的PBS吐温20，0.1％布里杰35，100微克/毫升100微克/毫升鼠IgG，鼠IgG，兔IgG，山羊IgG的100微克/毫升和100微克/毫升驴IgG的100微克/毫升。这个量是足够应用到每个子阵6μL稀释血清溶液。
    2. 在一个多个血清样品中的多种血清蛋白聚糖对英镑检测（见样本实验2）使用测量实验。在这种情况下，1微​​升血清充足稀释成9μlPBS含0.1％的吐温20，0.1％布里杰35，100微克/毫升100微克/毫升鼠IgG，鼠IgG，兔IgG 100微克/毫升100微克/毫升山羊IgG和100微克/毫升驴抗体。这卷6μL稀释血清溶液应用到每个子阵是足够的。
  2. 蜡的印记，在第4步后，仔细地申请到每个子阵的幻灯片6μL稀释后的样品或对照样品（PBST0.1）。在加湿录像带的幻灯片用湿纸巾，在室温下孵育1个小时。
  3. 冲洗，与PBST0.1 3次，每次3分钟的幻灯片。
  4. 干纺纱1200 XG 2分钟的幻灯片。

6。生物素英镑（凝集素或抗糖抗体应用到幻灯片）

  1. 在第2.4步，准备在PBST0.1生物素标记的凝集素/ GBPS10μg/mL组。
    1. 在糖分析实验中，探针与多个外源凝集素的样品（样品实验1），准备350μL生物素标记的凝集素，是足够的所有子阵。
    2. 在单糖抗原/生物标志物，在使用多个外源凝集素的筛选多个样品，准备足够的一个子数组的每个生物素的凝集素，加入10μl。
  2. 6μL稀释的生物素标记的凝集素（S）应用到每个子阵的幻灯片，在“加湿幻灯片中孵育1小时，在室温下的湿纸毛巾。
  3. 3分钟内每TI有PBST0.1三次冲洗的幻灯片我。
  4. 纺纱在1200 XG离心2分钟，晾干幻灯片。

7。应用荧光检测染料标记NeutrAvidin

  1. 准备350μLDylight 549标记NeutrAvidin，这是足够的所有子阵。
  2. 应用到每个子阵6μLDylight 549标记NeutrAvidin液，室温孵育1小时的在加湿幻灯片录像带的幻灯片。
  3. 冲洗，与PBST0.1 3次，每次3分钟的幻灯片。
  4. 干纺纱它在1200 XG离心2分钟的幻灯片。

8。获得微阵列扫描幻灯片幻灯片图像

  1. 使用荧光微阵列扫描仪以10微米的分辨率扫描的幻灯片。激光和光电倍增管的设置应尽可能强大，但没有观察到饱和点。

9。数据提取和分析

  1. 打开图像ArrayPro 3.2。 成立阵列模板，根据阵图，显示抗体点的位置。小心地将图像中的对应点到每个模板圈。
  2. 提取到一个Excel文件作进一步的分析，每个点的强度。

10。代表结果

样本实验1

多个血清糖蛋白在肝癌病人血清样品使用化学阻断抗体芯片检测多个凝集素的糖基化分析。

这个实验的目的是探索使用化学阻断抗体芯片与外源凝集素检测在肝细胞癌（HCC）患者血清样品个人20糖蛋白糖基化的文件。设计和制造抗体芯片，包含48个相同的子阵，其中包括26抗体和生物素BSA，在STEP 1。这26对承诺通过使用基于凝集素免疫沉淀结合质谱蛋白质鉴定12，32，如表1所示为肝癌患者的早期诊断价值确定的20个血清糖蛋白抗体。图案印在一式三份中的一个代表子阵的抗体点安排在图1E和1F所示，分别为。两个相同的芯片的幻灯片，一个是化学阻断（ 图1A），而另一个（ 图1B），被用来进行相同的糖基化分析实验的化学阻断程序的重要性，以证明分析。化学封锁的幻灯片（ 图1B），实验开始第2步;没有化学阻断的幻灯片（ 图1A），从第3步开始实验。跟随着进行实验Ğ除了5.1.2和6.1.2步骤在协议中所述的所有步骤。 5.2中的步骤，PBST0.1控制样品被应用到子阵1和3列，汇集肝癌血清样品被应用到子阵中列2和4分别（ 图1G）。这种比较是化学阻断后显示的效益，效率的程序，以及抗原抗体的亲和力。 22生物素标记的凝集素（如表1所示），具体到不同的聚糖18，20，被应用到每个子阵图1G显示糖基化分析。化学阻断（ 图1B）和非化学阻断（ 图1A）后，按照该协议的糖基化分析检测芯片的图像。所示非化学阻断芯片（ 图1A和图1C），1和3列的子阵只有PBST0.1应用，最凝集素的约束捕捉抗体，并表现出非常高的背景下，与应用于血清样品中列第2和第4，这些子阵。这是不可能获得这种芯片的幻灯片糖的个人资料信息。相反，化学阻断抗体芯片幻灯片上进行相同的实验时，列1和3，其中仅PBST0.1应用子阵，最凝集素均没有或非常低的绑定捕获抗体;而高抗原绑定在子阵仍在观察，2和4列，其中血清样品（ 图1B和1D）。这些结果表明，前测量的抗体捕获的糖蛋白聚糖的化学阻断程序是一个关键的一步。按照协议，22日在肝癌患者血清糖蛋白糖基化型材可以得到。

实验2

屏幕为改变fucosylation歧视的肝硬化和肝癌患者的生物标志物的特异性血清糖蛋白。

这个实验的目的是为特定的血清糖蛋白作为生物标志物的歧视性肝硬化和肝细胞癌（HCC）患者改变fucosylation屏幕。不同的实验，其中只有一个血清样品被应用到每个子阵列，并探讨各种凝集素，在这个实验中，共有40种不同的肝癌和肝硬化患者的血清标本被应用到每个子阵，一个外源凝集素（AAL的探讨）。如接收者工作特征（ROC）曲线，T检验，统计分析，完成评估的的糖epiptope /所有血清样品中的每一个个体蛋白质生物标志物的分布或诊断性能。除了抗CA19-9和反刘易斯X抗体，在这项研究中，我们使用相同的抗体芯片制造实验1。在experiment从9月2日进行，除5.1.1和6.1.1步骤9步骤。共有40个血清样品来自20个肝硬化和20例HCC患者采用PBS作为阴性对照，与对照样品48子数组的随机子阵。 fucosylation每个捕获的蛋白质，然后用​​生物素化的岩藻糖特异性凝集素检测。 如图1所示的芯片图像显示只约束上，而不是捕获抗体芯片（ 图2D）（图2E）捕获血清蛋白的凝集素AAL的。所有景点AAL的结合强度，然后提取，并通过T检验和ROC曲线评估fucosylation每个血清蛋白在肝癌和肝硬化组之间的歧视（AAL的结合强度）的性能分析。结果表明，GP73蛋白fucosylation了两组之间的歧视， 以 p = 0.03下面积ROC曲线曲线等于0.72。这个实验证明，此过程中聚糖抗原/生物标志物筛选多个样品内多种蛋白质是一种快速，有效的方法。

编号 试剂名称 缩写 公司 产品编号
母语生物素伴刀豆球蛋白A 刀豆媒介实验室 BK-1000
二级接骨木黑质凝集素生物素国民核算体系媒介实验室 B - 1305
三级生物素镜头扁豆凝集素 LCA的媒介实验室 BK-2000
L4 生物素蓖麻凝集素我的RCA 媒介实验室 BK-1000
腰 Aleuria Aurantia凝集素生物素 AAL的媒介实验室 B - 1395
L6 刺桐Cristagalli凝集素生物素的ECL 媒介实验室 BK-3000
L7的生物素加纳（Bandeiraea）的Simplicifolia凝集素二吉斯达二媒介实验室 BK-3000
八楼生物素小麦胚芽凝集素 WGA的媒介实验室 BK-1000
采用L9 生物素绿豆寻常Erythroagglutinin PHA-E的媒介实验室 BK-2000
L10 生物素绿豆寻常Leucoagglutinin PHA-L的媒介实验室 BK-2000
L11 生物tinylated花生凝集素巴勒斯坦民族权力机构媒介实验室 BK-1000
L12 生物素豌豆凝集素变压吸附媒介实验室 BK-2000
L13号 Dolichos Biflorus凝集素生物素 DBA的媒介实验室 BK-1000
L14 生物素曼陀罗曼陀罗凝集素的DSL 媒介实验室 BK-3000
L15 生物素苦参粳稻凝集素 SJA 媒介实验室 BK-2000
L16号生物素标记的大豆凝集素校本评核媒介实验室 BK-1000
L17 生物素化的马铃薯（土豆）凝集素 STL的媒介实验室 BK-3000 </ TD>
L18的生物素化的加纳（Bandeiraea）Simplicifolia的凝集素我吉斯达我媒介实验室 BK-2000
第19课蚕豆簇毛麦凝集素生物素 VVL 媒介实验室 BK-2000
L20的生物素化的番茄（番茄）凝集素 LEL的媒介实验室 BK-3000
为L21 生物素标记的荆豆凝集素我 UEA的我媒介实验室 BK-1000
L22的生物素Jacalin JACALIN 媒介实验室 BK-3000
A1的山羊F（下AB'）2片段的抗人IgM，Fc5μ抗体 IgM抗体杰克逊免疫研究 109-006-129
A2的驴F（AB'）2片段的抗人IgG（H + L）抗体 AB1类杰克逊免疫研究 709-006-149
A3的鼠抗人IgG F（AB'）2单克隆抗体 AB3 杰克逊免疫研究 209-005-097
A4纸羊抗人α2巨球蛋白的多克隆抗体 A2M开发 GeneTex GTX62924
A5的兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体 A1AT 李Biosiences CA1T-80A
A6的鼠抗人α-1-抗胰蛋白酶单克隆抗体 A1AT Sigma Aldrich公司 SAB4200198
A7的兔抗人α-1-抗胰蛋白酶多克隆抗体法 NeoMarkers RB-367-A1的
A8的兔抗人α-1-滑稽hymotrypsin多克隆抗体法 Fisher Scientific则 RB9213R7
A9的鼠抗人转铁蛋白的单克隆抗体转 GeneTex GTX101035
A10的兔抗人转铁蛋白的多克隆抗体转 GeneTex GTX77130
A11 羊抗人载脂蛋白J多克隆抗体 ApoJ abcam ab7610
A12往鼠抗人GP73单克隆抗体 GP73 雅培 14H4-23
A13号鼠抗人GP73单克隆抗体 GP73 圣克鲁斯生物技术公司 SC-101275
A14高速公路兔抗人α-1甲胎蛋白多克隆抗体法新社 ĞenWay 幸福感的41C966
A15 鼠抗人的α-1单克隆抗体甲胎蛋白法新社菲茨杰拉德 10-A05A
A16 鼠抗人单克隆抗体hemopexin hemopexin assaypro 60190-05011
A17中鼠抗人的glypican，3（1G12）单克隆抗体 GPL3 圣克鲁斯生物 SC-65443
A18 鼠抗人激肽原（低分子量）单克隆抗体激肽原 assaypro 20333-05011
A19中兔抗人MMP-21单克隆抗体 MMP21 epitomic 1955-1
A20的鼠抗人CEACAM-1单克隆抗体 CEACAM R＆D系统 MAB1180
一21 鼠抗人DPPIV/CD26单克隆抗体 DPPIV R＆D系统 MAB22441
A22号鼠抗人PIVKA第二单克隆抗体 PIVICA 晶体化学 8040
A23座鼠标防癌胚抗原东航美国生物 C1300
A24的小鼠抗血清CA125癌抗原 CA125的美国生物 C0050-01D
A25 鼠标反CA19-9癌抗原 CA19-9 美国生物 C0075-18
A26 鼠标反刘易斯x的单克隆抗体刘易斯X Calbiochem公司 434631
生物生物素标记的牛血清白蛋白（阳性对照） 生物自制 N / A

表1。在这个协议中使用的凝集素和抗体的名单。

试剂小号/设备名称 公司 目录编号
非接触微阵列 BioDot公司 sciFLEXARRAYER
384微孔板费舍尔 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
超薄硝化棉coate芯片滑 gentel 路径
幻灯片印记（可选） 凝胶公司 WSP60-1
沙克尔费舍尔 15-453-211
离心分离 Eppendorf公司 5804 000.013
滑动洗涤盆/幻灯片染色碟无线TH可拆卸支架费舍尔 08-812
幻灯片孵化室/显微镜幻灯片中费舍尔 03-448-5
布里杰35 W / V，30％水溶液 Acros Organics公司 AC32958-0025
吐温20 费舍尔 P337-100
高碘酸钠（NAIO 4） 西格玛 311448
L-谷氨酸γ-肼西格玛 G - 7257
无水醋酸钠（CH 3 COONa） 西格玛 S2889
牛血清白蛋白（BSA） lampire生物实验室 7500804
磷酸盐缓冲液（PBS）（10X） 丹维尔科学 CP4390-48
dylight 549共轭NeutrAvidin 热 22837
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片罗氏公司 4693159001
ChromPure人IgG，Fc片段杰克逊Immunoresearch 009-000-008
ChromPure人IgG，整个分子杰克逊Immunoresearch 009-000-003
ChromPure小鼠IgG，整个分子杰克逊Immunoresearch 015-000-003
ChromPure小鼠IgG，Fc片段杰克逊Immunoresearch 015-000-008
ChromPure兔IgG，整个分子杰克逊Immunoresearch 011-000-003
ChromPure驴抗体，整个分子杰克逊Immunoresearch 017-000-003
微阵列扫描仪 Tecan公司的LS重装上阵

表2。名单在这个协议中使用的设备和试剂。

计划1
计划1计划显示外源凝集素的抗体芯片，基于聚糖的生物标志物的发现过程1（步骤2至4）：座阻滞剂（GLU-肼）和BSA抗体芯片; 2（步骤5）：适用于血清样品和捕捉特定的糖蛋白特异性抗体; 3（步骤6）：适用于生物素标记的凝集素（S）; 4（步骤7）：探头Dylight 549标记的微阵列成像NeutrAvidin的生物素AAL的。

图1
图1。芯片图像样本实验1肝癌病人血清样品中的多个血清糖蛋白糖基化分析使用的化学盟友阻止抗体芯片与多个外源凝集素检测。两个相同的芯片幻灯片，（一）没有化学阻断，或（B）在第2步化学阻断，同时通过糖基化分析的所有步骤，从2到9，以及比较的目的去。 （A）和（b）是芯片的图像扫描分辨率在10微米的步骤8。 （五）（三）在图像放大的前两行的无化学阻断芯片幻灯片（A），（四）放大图像中的前两行的化学阻断非芯片幻灯片（乙））;抗体安排在每个子阵图;（F）的阵列映射：每个抗体的子数组中的位置，每个抗体的名字代表3点（G）的血清样品和外源凝集素的位置：图表显示子数组的每个血清样品凝集素被应用到。

图2
图2。芯片图像样本实验2屏幕上的具体作为生物标志物的歧视性肝硬化和肝癌患者血清糖蛋白的改变fucosylation。基因芯片检测进行了样品实验2节所述。 （一）（三）整个芯片从8步幻灯片幻灯片图像;（二）抗体安排在每个子阵图;阵列地图：每个抗体的子数组中的位置，每个抗体的名字代表了3点; （四）放大培养与血清样品中的一个子阵的形象;（五）有放大培养与PBS对照组的一个子阵的形象。

图3
图3。聚糖样品实验1的分析结果。每个柱状图代表20种蛋白的外源凝集素具有约束力的文件（或糖型材）。共有22个不同的凝集素被用来分析日é聚糖每个蛋白质的个人资料。

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Discussion

1。目标蛋白质和捕获抗体的选择

抗体芯片检测之前，一些试剂和材料都需要考虑和准备。聚糖分析或聚糖的生物标志物的筛选，抗体的特定糖候选人的面板设计的抗体芯片，根据文献，或从先前的结果，应确定。购买来自不同厂商，如R＆D系统等的IgG，这些抗体通常是首选，因为我们以前的测试表明，一些IgM和IgE可能完全失去了化学修饰后，其抗原的亲和力捕获抗体。

2。抗体芯片的设计和制造

抗体芯片制造是一个可选的步骤，这需要专业和昂贵的微阵列，和训练有素的操作人员。然而，定制抗体芯片制造TURE可以很容易地做了一个健壮的结果，如Serome Biosciences公司的服务提供商，我们建议一种非接触式的微阵列，如Scienion sciFLEXARRAYER超低量非接触微阵列，这是在我们的抗体芯片制造使用。高结合能力芯片的幻灯片，如路径（Gentel生物公司WI）或幻灯片的H（索特，PA）。

3。选择和准备聚糖结合蛋白（Gbps）的糖基化分析

Gbps的目标不同单或寡糖可以在文学和哈布实验室29开发和维持翻译基因组学研究所通过搜索引擎发现要选择Gbps的高特异性和亲和力有针对性的糖链抗原表位，从下拉菜单中选择主题（抗原），然后点击“搜索。” Gbps的具体到这个主题（抗原），将根据他们的logP值值从高至低的顺序列出。更高的logP值指示更强聚糖主题/抗原的亲和力和特异性。由于固有的非特异性凝集素结合的问题，这种方法还没有为基于抗体的检测最佳。因此，我们强烈建议使用抗糖抗体，如抗刘易斯X或反唾液酸化Lewis A抗体，如果可用。 GBPS多个检测使用的是另一种策略，交叉检查不同约束力型材和获得可靠的数据绑定。

4。数据分析

因为这种方法是用来检测本机的血清蛋白，蛋白质复合物可能会被捕获和检测。 Western blot法或质谱是很好的方法来验证芯片数据。在此期间，使用相同的芯片，蛋白水平的检测是蛋白质的糖基化改变的细节，如是否改变是由于总蛋白水平的变化，或只是对每个蛋白质的糖基化水平增加，另一种方法来学习。

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Disclosures

作者没有透露。

Acknowledgments

这项工作是由肝炎病毒研究的研究所支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

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References

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分子生物学，63期，糖蛋白，糖蛋白，特定的蛋白质糖基化，复用高通量糖阻断抗体芯片
化学阻断抗体芯片复用高通量的复杂样品中特定蛋白糖基化的剖析
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Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J.,… More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

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