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Biology

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Protocol

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1. Drucken Sie einen Antikörper Microarray für die Assay-

  1. Die Serum-Antikörper bis 0,5 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2 (PBS).
  2. 40 ul Aliquot jedes Antikörpers in die 384-Well-Platte Quelle.
  3. Laden Sie das 384-Well-Platte auf die Quelle Scienion sciFLEXARRAYER Microarrayer.
  4. Legen Sie 20 PATH Microarray Slides auf den Microarrayer als Ziel.
  5. Stellen Sie die Microarrayer zu 48 identische Untergruppen, in denen 27-Antikörpern und Kontroll-Proteinen in dreifacher Ausfertigung in einer 9x9-Muster (Abbildung 1E, 1F) gesichtet werden zu drucken.
  6. Starten Sie den Microarrayer, um die Antikörper Microarray-Slides zu drucken.
  7. Sammeln Sie die Antikörper Microarray Slides, und speichern sie in Dias Kassette mit Trockenmittel. Vakuumieren Sie die Kassette in einer Plastiktüte mit Folienschweißgerät (FoodSaver).
  8. Lagern Sie die versiegelte Microarray Slides bei 4 ° C im Kühlschrank.

2. Chemisch blockieren Antikörper Microarray GBP zu verhindernBindung an die Fänger-Antikörper

Die Mikroarray-Test beginnt, sobald die Microarray-Slides sind chemisch blockiert und dauert ca. 8 Stunden. Nach dem Start der Microarray-Assay wurde abgeschlossen werden (Schritte 2 bis 8).

  1. Nehmen Sie die Microarray-Slides aus dem Kühlschrank, und sie ins Gleichgewicht auf Raumtemperatur für 30 Minuten.
  2. Entfernen der Folie aus dem Aufbewahrungsbehälter und kurz spülen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 mit 0,1% Tween 20 (PBST0.1) einmal in einer Folie Waschbecken, und dann in 15 mM Natriumacetat, pH 5,0 mit 0,1% Tween (CBT0 .1) in einer sequenziellen Weise. Die Objektträger in CBT0.1 für 10 Minuten in Folie Waschbecken.
  3. Bereiten Sie frischen 150 mM NaIO 4 in 15 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,0 (CB), und halten Sie sie in in eine Folie Waschbecken in einem Kühlschrank bei gleichzeitiger Vermeidung Licht vor dem Gebrauch.
  4. Entfernen Sie die Folie aus der CB, und steckte es in das Becken mit frischem NaIO 4 mit dem Antikörper Seitenach oben zeigt. Decken Sie die Schüssel mit Alufolie, um Licht zu vermeiden, und inkubieren Sie die Folie Becken für 2 Stunden unter leichtem Schütteln bei 4 ° C im Kühlschrank aufbewahrt.
  5. Bereiten Sie 300 ml 10 mM Hydrazid Glutaminsäure (der Blocker) in CB.
  6. Entfernen Sie die Folie aus dem Becken, und spülen Sie ihn kurz in CB 3 mal für jeweils 5 min in Folie Waschbecken.
  7. Objektträger in der Blocker in ein Waschbecken für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  8. Entfernen Sie die Dias aus dem Becken, und waschen Sie sie mit PBST0.1 für 3 Minuten.

3. Sperren nicht-spezifische Bindungen zu dem Mikroarray mit Rinderserumalbumin (BSA)

  1. Planen 300 ml 1% BSA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 mit 0,5% Tween (PBST0.5) in einem Schlitten Waschbecken, und Inkubieren des Mikroarrays Folie in dem Becken für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln.
  2. Spülen Sie die Folien in PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
  3. Legen Sie die Folieauf einer Folie Rack, und drehen sich mit 1.200 xg auf einer Zentrifugation für 2 Minuten, um die Dia-Mikroarray trocknen.

4. Impressum Wax Gitter auf den Microarray-Slide an jede Untergruppe Trennen

  1. Vorwärmen das Wachs Imprinter bei 70 ° C für 5 Minuten.
  2. Laden Sie das blockierte Microarray gleiten in den Wachs-Imprinter mit Antikörper Seite nach dem Wachs. Ziehen Sie den Griff zum Impressum Wachs gleichmäßig auf den Objektträger.

5. Bewerben Serumproben auf den Microarray-Slide

  1. Während der Schritt 2.4, bereiten Serumproben entweder für Glyco-Profiling-Test in einer Probe (5.1.1), oder einzelne Glyco epiptope Messung von mehreren Proben (5.1.2).
    1. In einem Experiment für die Glykan Profilierungen mehrerer Serumglycoproteinen in einer Serumprobe, indem Sie mehrere Euros (siehe Probe Experiment 1), wird ein Serum-Proben auf alle Untergruppen angewendet werden. In diesem Fall wird 40 ul Serum ausreichend in 360 ul PBS, enthaltend 0,1% verdünntTween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml Maus-IgG, 100 ug / ml Ratten-IgG, 100 ug / ml Kaninchen-IgG, 100 ug / ml Ziegen IgG und 100 ug / ml IgG Esel. Diese Menge ist ausreichend für die Anwendung von 6 ul verdünnte Serum-Lösung auf jedes Sub-Arrays.
    2. In einem Experiment für die eine Glykan Messung an mehreren Serumproteine ​​unter mehreren Serumproben unter Verwendung eines GBP Erkennungen (siehe Beispiel Experiment 2). In diesem Fall wird 1 ul Serum ausreichend in 9 l PBS, enthaltend 0,1% Tween-20 verdünnt, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml Maus-IgG, 100 ug / ml Ratten-IgG, 100 ug / ml Kaninchen-IgG , 100 ug / ml Ziegen IgG und 100 ug / ml IgG Esel. Diese Menge ist ausreichend für die Anwendung von 6 ul verdünnte Serum-Lösung auf jedes Sub-Arrays.
  2. Nach Wachs Impressum in Schritt 4, sorgfältig anwenden 6 ul der verdünnten Proben bzw. Kontrollproben (PBST0.1) zu jedem Subarray des Schlittens. Inkubieren Sie den Objektträger in einer feuchten Kassette mit feuchten Papiertüchern bei Raumtemperaturfür 1 Stunde.
  3. Spülen Sie den Schlitten mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
  4. Trocknen Sie die Folie, durch Drehen der bei 1200 xg für 2 Minuten.

6. Bewerben Biotinyliertes GBP (Lektin oder Anti-Glykan Antikörper) auf den Objektträger

  1. Während der Schritt 2.4, bereiten 10μg/ml von biotinylierten Lektine / Gbps in PBST0.1.
    1. In Glykan Profiling-Experiment, dass die Sonde eine Probe mit mehreren Lektine (Probe Experiment 1), bereiten 350 ul biotinylierten Lektin, das reicht für alle Teilfelder ist.
    2. In einzelnen Glykan Epitop / Biomarker-Screening in mehreren Proben durch die Verwendung mehrerer Lektine, bereiten 10 ul jeder biotinylierten Lektin, das reicht für eine Subarray ist.
  2. Bewerben 6 ul der verdünnten biotinylierten Lektin (s) zu jeder Teilmatrix von der Folie, und bebrüten in der befeuchteten schiebeschachtel mit feuchten Papiertüchern bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  3. Spülen Sie die Dias mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten timich.
  4. Trocknen Sie die Folie, durch Drehen der bei 1200 xg in der Zentrifuge für 2 Minuten.

7. Bewerben Farbstoff markiert NeutrAvidin für Fluoreszenzdetektion

  1. Bereiten Sie 350 ul DyLight 549 beschriftet NeutrAvidin, die ausreichend für alle Teilfelder ist.
  2. Bewerben 6 &mgr; l DyLight 549 beschriftet NeutrAvidin auf jede Untergruppe, und inkubieren Sie die Folie in der befeuchteten Objektträger Kassette bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
  3. Spülen Sie den Schlitten mit PBST0.1 dreimal für jeweils 3 Minuten Zeit.
  4. Trocknen Sie die Folie durch Spinnen der es bei 1200 xg in der Zentrifuge für 2 Minuten.

8. Erhalten Microarray Slide Bild durch Scannen des Slide

  1. Scannen Sie das Bild mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroarray-Scanner mit 10 mm Auflösung. Die Laser-und PMT-Einstellungen sollten so stark sein wie möglich, aber keine Sättigung vor Ort beobachtet wird.

9. Datenextraktion und-analyse

  1. Öffnen Sie das Bild in ArrayPro 3.2. Richten Sie den Array-Vorlage nach dem Array Karte, die die Antikörper Flecken Standorten zeigt. Richten Sie jede Vorlage Kreis auf die entsprechende Stelle im Bild.
  2. Entpacken Sie die Intensität jedes Spots in eine Excel-Datei zur weiteren Analyse.

10. Repräsentative Ergebnisse

Probe Experiment 1

Glykosylierung Profilierung von mehreren Serumglycoproteinen in hepatozellulären Karzinoms Patientenserum Beispiel mithilfe von chemisch blockiert Antikörper-Mikroarray mit mehreren Lektine Erkennung.

Das Ziel dieses Experiments ist es, die einzelnen Glycosylierungsprofil von 20 Glykoproteine ​​in hepatozellulären Karzinoms (HCC) Patientenproben untersuchen mit Hilfe chemisch blockiert Antikörper-Mikroarray mit Lektin-Erkennung. Ein Antikörper-Mikroarray, der 48 identischen Untergruppen, die 26-Antikörpern und Biotin-BSA zählen enthält, wurde entwickelt und gebaut wie in S beschriebenTEP-1. Diese 26 Antikörper wurden gegen 20 Serumglycoproteinen, die als erste vielversprechende Diagnose Wert für HCC-Patienten unter Verwendung Lectin basierten Immunpräzipitation mit massenspektrometrischen Proteinidentifizierung 12, 32, wie in Tabelle 1 gezeigt kombiniert identifiziert. Das Muster und die Anordnung der Antikörper Stellen in dreifacher Ausfertigung in einer repräsentativen Subarray gedruckt werden in 1E und 1F gezeigt. Zwei identische Microarray Substrate, war eine nicht chemisch blockiert (1A), während die andere wurde (1B), wurden verwendet, um die Durchführung der gleichen Glykosylierung Profilierung Experiment, um die Bedeutung der chemisch blockiert Verfahren zur Analyse nachweisen. Für die chemisch blockiert Schieber (Abbildung 1B), begann das Experiment an der Stufe 2, für die keine chemisch blockiert Schieber (Abbildung 1A), begann das Experiment ab Schritt 3. Das Experiment wurde durchgeführt, indem following alle Schritte in dem Protokoll mit Ausnahme von Schritt 5.1.2 und 6.1.2 beschrieben. Im Schritt 5.2 wurde eine Kontrollprobe PBST0.1 auf Subarrays in Spalte 1 und 3 angelegt und eine gepoolte HCC Serumprobe wurde auf Teilfelder in Spalte 2 bzw. 4 aufgetragen (wie in Figur 1G gezeigt). Dieser Vergleich ist es, die Effektivität, Effizienz des Verfahrens, sowie die Antigen-Bindungsaffinität der Antikörper nach der chemisch blockiert zeigen. 22 biotinylierten Lektine (wie in Tabelle 1 gezeigt), die speziell für verschiedene Glykane 18, 20 auf jeder Teilmatrix angewendet wurden, wie in 1G für die Glycosylierung Profilierung gezeigt. Bilder der chemisch blockiert (Abbildung 1B) und nicht-chemisch blockiert (Abbildung 1A) Microarrays nach der Glykosylierung Profiling-Test, indem Sie das Protokoll. Wie in den Subarrays in Spalte 1 und 3 in nicht-chemisch blockiert Mikroarrays (1A und 1C), gezeigt, auf demnur PBST0.1 angelegt wurde, die meisten Lektine gebunden an Antikörper zu erfassen, und zeigten eine sehr hohe Hintergrund vergleichbar mit den Sub-Arrays in Spalte 2 und 4, auf dem der Serum-Probe wurde aufgetragen. Es ist unmöglich, Glykan Profilinformationen ins Mikroarray Folie zu erhalten. Im Gegenteil, wenn das gleiche Experiment auf einem chemisch blockiert Antikörper Microarray Objektträger wurde durchgeführt, die Sub-Arrays in Spalte 1 und 3, auf denen nur PBST0.1 angelegt wurde, zeigten die meisten Lektine keine oder nur geringe Bindungen an Antikörper zu erfassen, während hohe Antigen Bindungen wurden noch in Untergruppen in Spalte 2 und 4 beobachtet, an dem Serumprobe angewandt wurde (1B und 1D). Diese Ergebnisse zeigten, das chemisch blockiert Verfahren war ein entscheidender Schritt Vordergrund der Messung der Antikörper-Glykane auf Glykoproteinen eingefangen. Mit dem Anschluss an das Protokoll, kann Glycosylierungsprofilen von 22 Glykoproteine ​​in HCC Serum gewonnen werden.

Experiment 2

Screen für veränderte fucoslierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker für diskriminiert Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom-Patienten.

Das Ziel dieses Experiments ist es, Bildschirm für veränderte Fucosylierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker, die Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom (HCC) Patienten zu diskriminieren. Verschiedene aus dem Experiment 1, die nur ein Serumprobe auf alle Untergruppen angewendet wurde und sondiert mit verschiedenen Lectinen, in diesem Assay, insgesamt 40 verschiedene Serumproben von Patienten mit Leberzirrhose und HCC wurden auf jede Untergruppe angelegt, und sondiert mit einem Lektin (AAL ). Die statistische Analyse, wie T-Test, Receiver-Operating Characteristic (ROC)-Kurve, wurde durchgeführt, um die Verteilungen oder diagnostische Leistung des Glycans epiptope / Biomarker für jedes einzelne Protein in allen Serumproben zu bewerten. Wir verwendeten die gleichen Antikörper Mikroarray in Versuch 1 hergestellt, außer für anti-CA19-9 und anti-Lewis-X-Antikörper in dieser Studie. Das Knowiment wurde vom 2. September bis 9 durchgeführt, außer für den Schritt 5.1.1 und 6.1.1 fort. Insgesamt 40 Serumproben von 20 Leberzirrhose und 20 Patienten mit HCC wurden zufällig Untermatrix der 48 Subarrays zusammen mit den Steuerdaten PBS Proben als negative Kontrolle eingesetzt. Fukosylierung jedes der erfassten Proteine ​​wurde dann durch Verwendung von biotinylierten Fucose-spezifischen Lektin detektiert. Die Mikroarray-Bild in 1 gezeigt nachgewiesen das Lektin AAL nur Serumproteinen, auf dem Mikroarray (2D) anstelle von gebundenen Antikörper (2E) aufgenommen gebunden. Die AAL Bindung Intensitäten aller Punkte wurden dann extrahiert und analysiert unter Verwendung von T-Test und ROC-Kurven, um die Leistung des Fucosylierung (AAL Bindungsintensität) von jedem Serum-Protein auf der Diskriminierung zwischen den HCC und Zirrhose evaluieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fucosylierung von GP73-Protein die beste Diskriminierung zwischen den beiden Gruppen gab mit einem p = 0,03 und die Fläche unter-Kurve der ROC-Kurve ist gleich 0,72. Dieses Experiment zeigte, dieses Verfahren ist eine schnelle, effiziente Methode zur Glycan Epitop / Biomarker-Screening auf mehrere Proben innerhalb mehrerer Proteine.

Identifikation Name des Reagenzes Abkürzung Firma Katalog #
L1 Biotinyliertes Concanavalin A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinyliertes Sambucus nigra-Lectin SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinyliertes Lens culinaris Agglutinin LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinylierte Ricinus communis-Agglutinin I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinyliertes Aleuria aurantia-Lectin AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinyliertes Erythrina cristagalli Lektin ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinyliertes Weizenkeim-Agglutinin WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinyliertes Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Biobiotinylierte Erdnußagglutinin PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinylierte Pisum sativum Agglutinin PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinyliertes Dolichos biflorus Agglutinin DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinyliertes Datura Stramonium Lektin DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinyliertes Sophora Japonica Agglutinin SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Biotinyliertes Sojabohnen Agglutinin SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinyliertes Solanum tuberosum (Kartoffel) Lektin STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinyliertes Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lektin I GSL ich Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinylierte Vicia villosa-Lectin VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinyliertes Lycopersicon esculentum (Tomate) Lektin UEG Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinyliertes Ulex europaeus Agglutinin I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinyliertes Jacalin Jacalin Vector Laboratories BK-3000
A1 Ziegen-F (ab ') 2 Fragment Anti-Human-IgM, Antikörper Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Esel F (ab ') 2Frag Anti-Human-IgG (H + L) antibody AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Maus Anti-Human-IgG F (ab ') 2-Antikörpers AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Anti-Human-Alpha-2-Makroglobulin polyklonalen Antikörper A2M GeneTex GTX62924
A5 Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Maus Anti-Human-alpha-1-Antitrypsin monoklonalen Antikörper A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Kaninchen anti-Human-alpha-1-Antitrypsin polyklonaler Antikörper HANDELN NeoMarkers RB-367-A1
A8 Kaninchen anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyklonaler Antikörper HANDELN Fisher Scientific RB9213R7
A9 Maus Anti-Human-Transferrin monoklonalen Antikörper Transferrin GeneTex GTX101035
A10 Kaninchen anti-Human-Transferrin polyklonaler Antikörper Transferrin GeneTex GTX77130
A11 Anti-Human-Apolipoprotein J polyklonaler Antikörper ApoJ Abcam ab7610
A12 Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper GP73 Abbott 14H4-23
A13 Maus Anti-Human-GP73 monoklonalen Antikörper GP73 Santa Cruz Biotechnology INC sc-101275
A14 Kaninchen anti-Human-alpha-1 Fetoprotein polyklonaler Antikörper AFP GenWay GWB-41C966
A15 Maus Anti-Human-alpha-1 Fetoprotein monoklonalen Antikörper AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Maus Anti-Human-Hämopexin monoklonalen Antikörper Hämopexin Assaypro 60190-05011
A17 Maus Anti-Human-Glypican-3 (1G12) monoklonaler Antikörper GPL3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Maus Anti-Human-Kininogen (LMW) monoklonaler Antikörper Kininogen Assaypro 20333-05011
A19 Kaninchen anti-Human-MMP-21 monoklonalen Antikörpers MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Maus Anti-Human-CEACAM-1 monoklonalen Antikörper CEACAM R & D Systems MAB1180
Ein21 Ratten-Anti-Human-DPPIV/CD26 monoklonalen Antikörper DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Maus Anti-Human-PIVKA-II-monoklonalen Antikörpers PIVICA Kristall-chem 8040
A23 Maus anti-carcinoembryonales Antigen CEA US biologischen C1300
A24 Maus anti-CA125 Cancer Antigen CA125 US biologischen C0050-01D
A25 Maus anti-CA19-9 Cancer Antigen CA19-9 US biologischen C0075-18
A26 Maus Anti-Lewis-x monoklonalen Antikörper Lewis-X Calbiochem 434631
Bio Biotinyliertes BSA (positive Kontrolle) Bio Hausgemachte N / A

Tabelle 1. Liste der Lektine und Antikörper in diesem Protokoll verwendet.

Name des Reagenzes s / Ausrüstungen Firma Katalog-Nummer
Berührungslose Microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 Mikroplatte Fischer 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultradünne Nitrocellulose Coate Microarray-Slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) Das Gel Unternehmen WSP60-1
Shaker Fischer 15-453-211
Zentrifugieren Eppendorf 5804 000.013
Schieben Waschbecken / Glaszylinder, Schale with Wechselrahmen Fischer 08-812
Slide Inkubationskammer / Objektträger-Box Fischer 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% igen Lösung in Wasser Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fischer P337-100
Natriumperiodat (NaIO 4) Sigma 311448
L-Glutaminsäure-γ-hydrazid Sigma G-7257
Natriumacetat wasserfrei (CH 3 COONa) Sigma S2889
Rinderserumalbumin (BSA) Lampire Biologische Labs 7500804
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10X) Scientific Denville CP4390-48
DyLight 549 konjugierten NeutrAvidin Thermo 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4693159001
ChromPure Human-IgG, Fc-Fragment Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure Human-IgG, ganze Molekül Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure Maus-IgG, ganze Molekül Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc-Fragment Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, ganze Molekül Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, ganze Molekül Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabelle 2. Listevon Geräten und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet.

Schema 1
Schema 1 ein Schema, das Lektin Antikörper Microarray-Basis Glykan Biomarkern Prozess 1 (Schritt 2 bis 4): Blockieren Sie die Antikörper mit der Microarray-Blocker (Glu-hydrazid) und BSA; 2 (Schritt 5):.. Gelten Serumproben und erfassen spezifische Glykoproteine ​​mit spezifischen Antikörpern; 3 (Schritt 6): gelten biotinylierten Lektin (s); 4 (Schritt 7): Probe der biotinylierte AAL DyLight mit 549 beschriftet NeutrAvidin für Microarray-Bildgebung.

1
Abbildung 1. Microarray-Bilder der Probe Experiment 1 Glykosylierung Profilierung von mehreren Serumglycoproteinen in HCC Patienten Serumprobe mit ChemicVerbündeter blockiert Antikörper Microarray mit mehreren Lectin Detektion. Zwei identische Microarray Slides, (A) keine chemisch blockiert, oder (B) chemisch blockiert, wie in Schritt 2 beschrieben, beide gingen durch alle Schritte 2 bis 9 für die Glykosylierung Profiling, sowie Vergleich Zweck. (A) und (B) werden die Microarray-Bildern bei Schritt 8 in einer Auflösung von 10 Mikrometern gescannt. (D) die Zoom-Bild der ersten beiden Zeilen des nicht chemisch blockiert Mikroarray Folie (B));, (C) die Zoom-Bild der ersten zwei Zeilen der keine chemisch Mikroarray Folie (A) blockiert (E) Das Diagramm des Antikörpers Anordnung innerhalb jedes Sub-Arrays; (F)-Array-Karten: Die Lage der einzelnen Antikörper innerhalb der Subarray stellt jedes Antikörper-Name 3 Spots, (g) Serumprobe und Lektin Lage: Ein Diagramm zeigt, welche Subarray jeder Serumprobe und Lectin wurde auf aufgebracht.

2
Abbildung 2. Microarray-Bildern von derProbe Experiment 2 Bildschirm für veränderte Fucosylierung auf spezifische Serum-Glykoproteine ​​als Biomarker dass diskriminieren Leberzirrhose und HCC-Patienten. Die Microarray-Assay wurde wie im Sample-Experiment 2 beschrieben durchgeführt. (A) Die gesamte Folie Bild des Mikroarrays Folie aus Schritt 8, (B) die Darstellung der Antikörper-Anordnung innerhalb jedes Sub-Arrays, (C)-Array-Karten: Die Lage der einzelnen Antikörper innerhalb der Subarray stellt jedes Antikörper-Name 3 Spots; (D) ein Zoom-in-Bild einer Untermatrix, die mit Serumprobe inkubiert wurden, (E) ein Zoom-in-Bild einer Untermatrix, die mit PBS-Kontrolle inkubiert wurden.

Abbildung 3
Abbildung 3. Glycan Profiling-Ergebnisse von Probe-Experiment ein. Jedes Balkendiagramm darstellen Lectin Profil (oder Glykan Profile) von einem der 20 getesteten Proteins. Insgesamt 22 verschiedene Lektine wurden verwendet, um th zu analysierene Glykan Profil jedes Protein.

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Discussion

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1. Zielprotein und Fängerantikörper Auswahl

Vor der Antikörper-Mikroarray-Test werden einige Reagenzien und Materialien benötigt, um in Betracht gezogen werden und vorbereitet. Um einen Antikörper Microarray-Profiling für Glykan oder Glykan Biomarker-Screening, ein Gremium von spezifischen Antikörpern gegen Glykoprotein Kandidaten entwerfen sollte nach der Literatur oder von früheren Ergebnissen festgestellt werden. Diese Antikörper wurden in der Regel von verschiedenen Anbietern wie R & D Systems usw. IgGs gekauft werden bevorzugt Fänger-Antikörper, da unsere bisherigen Tests haben gezeigt, dass einige IgM und IgE kann vollständig verlieren ihre Antigen Bindungsaffinitäten nach der chemischen Modifizierung.

2. Entwurf und Herstellung von Antikörper-Mikroarray

Herstellung des Antikörpers Microarray ist ein optionaler Schritt, die professionelle und teure Microarrayer und gut ausgebildetes Personal für den Betrieb benötigt. Allerdings kundenspezifische Antikörper-Mikroarray Herstellertur leicht von einem Dienstleister wie Serome Biosciences Inc. Für ein robustes Ergebnis durchgeführt werden, empfehlen wir eine berührungslose Druckverfahren, wie der Scienion sciFLEXARRAYER Ultra Low Volume berührungslose Microarrayer, die in unserer Antikörper Microarray-Herstellung verwendet wurde. Hohe Bindungskapazität Microarray Slides, wie PATH (Gentel Bio Inc. WI) oder Slide H (Schott, PA).

3. Auswahl und Vorbereitung Glycan bindende Proteine ​​(-Euros) für die Glykosylierung Profiling

Ziel-Euros, dass verschiedene Mono-oder Oligosaccharide sind in der Literatur und über eine Suchmaschine durch den Haab Labor 29 entwickelt und gepflegt am Translational Genomics Institute gefunden werden So wählen Sie Gbps mit hoher Spezifität und Affinität zudie gezielte Glykan Epitope, wählen Sie das Motiv (Epitop) aus dem Dropdown-Menü, und klicken Sie auf "Suchen". Die-Euros spezifisch für dieses Motivs (Epitop) werden nach ihrer logP Wert von hohen zu niedrigen Reihenfolge aufgeführt werden. Höhere logP deutet auf eine stärkere Affinität und Spezifität an die Glykan Motiv / Epitop. Aufgrund der inhärenten nicht-spezifische Bindung Problem von Lectin, ist dieses Verfahren immer noch nicht so optimal wie der auf Antikörpern basierende Assay. Daher empfehlen wir dringend, dass die Anti-Glykan Antikörper verwendet werden, wie z. B. Anti-Lewis-x-oder Anti-Sialyl-Lewis-A-Antikörpern, wenn sie verfügbar sind. Verwendung von mehreren Gbps für Erkennung ist eine weitere Strategie zum Abgleich verschiedener Profile und verbindliche, verlässliche Daten zu erhalten bindend.

4. Datenanalyse

Da diese Methode wird verwendet, um nativen Serum-Proteine ​​erkennen können Protein-Protein-Komplexe erfasst und erkannt werden. Western-Blot oder Massenspektrometrie ist eine gute Methoden, um die Microarray-Daten zu validieren. Inzwischen, Nachweis von Protein-Spiegel unter Verwendung des gleichen Microarray ist eine weitere Methode, um die Details der Glykosylierung Veränderung des Proteins, z. B. ob die Änderungen waren aufgrund des gesamten Proteins zu ändern oder nur, dass die Glykosylierung auf jeder Ebene der Proteine ​​erhöht lernen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Institut für Hepatitis-Virus und Forschung gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

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References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples
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Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

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