Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Druk een antilichaam Microarray voor de test

  1. Verdun alle antilichamen tot 0,5 mg / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing, pH 7,2 (PBS).
  2. Aliquot 40 pi van elk antilichaam in het 384-wells bron plaat.
  3. Plaats de 384-wells source plaat op de Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
  4. Laad 20 PATH microarray dia's op de microarrayer als doel.
  5. Stel de microarrayer tot 48 identieke subarrays, waarin 27 antilichamen en controle eiwitten worden gespot in drievoud in een 9x9 patroon (figuur 1E, 1F) af te drukken.
  6. Start de microarrayer aan het antilichaam microarray dia's af te drukken.
  7. Verzamel het antilichaam microarray dia's, en bewaar ze in dia's cassette met droogmiddel. Vacuümafsluiting de cassette in een plastic zak met behulp van vacuumsealer (Foodsaver).
  8. Bewaar de gesloten microarray dia's bij 4 ° C in de koelkast.

2. Chemisch Blokkeer de Antilichaam Microarray tot GBP voorkomenBinding aan de Capture Antilichamen

De microarray test begint zodra de microarray dia's zijn chemisch geblokkeerd en duurt ongeveer 8 uur. Eenmaal begonnen de microarray test moet worden uitgevoerd (stap 2 tot 8).

  1. Neem de microarray schuift uit de koelkast, en evenwicht ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  2. Verwijder de schuif van de doos en kort te spoelen in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,1% Tween 20 (PBST0.1) eenmaal een dia wastafel, en in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 met 0,1% Tween (CBT0 0,1) in een sequentiële wijze. Incubeer de glaasjes in CBT0.1 gedurende 10 minuten in een diaweergave wastafel.
  3. Bereid verse 150 mM NAIO 4 in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 (CB), en bewaar het in in een dia wastafel in de koelkast terwijl het vermijden van licht voor gebruik.
  4. Verwijder de dia in de CB, en zet hem in het bassin met vers NAIO 4 met het antilichaam kantnaar boven. Bedek de bekken met aluminiumfolie licht voorkomen en de schuif bekken incuberen gedurende 2 uur onder zacht schudden bij 4 ° C in de koelkast.
  5. Bereid 300 ml 10 mM hydrazide glutaminezuur (de blokker) in CB.
  6. Verwijder de dia in de bekken, en kort te spoelen in CB 3 keer gedurende 5 minuten per keer in slide wastafel.
  7. Incubeer de glaasjes in de blokkering in een wastafel 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
  8. Verwijder de dia's van het bekken, en was ze met PBST0.1 gedurende 3 minuten.

3. Blokkeren Niet-specifieke banden van de Microarray met Bovine Serum Albumine (BSA)

  1. Bereid 300 ml 1% BSA in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,5% Tween (PBST0.5) in een dia wastafel, en incuberen de microarray schuif in het bassin 1 uur bij kamertemperatuur zacht schudden.
  2. Spoel de dia's in PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
  3. Zet de schuifop een dia rek, en spin op 1.200 xg op een centrifugatie gedurende 2 minuten op de microarray slide drogen.

4. Impressum Wax Grid op de Microarray Schuif aan elke subarray Scheid

  1. Voorverwarmen was imprinter bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
  2. Laad de geblokkeerde microarray dia in de was imprinter met antilichaam zijde aan de was. Trek de hendel te prenten was in de dia gelijkmatig.

5. Breng serummonsters op de Microarray Slide

  1. Tijdens Stap 2.4, voor te bereiden serummonsters voor een van beide glyco profilering test in een monster (5.1.1), of enkele glyco epiptope meting met meerdere samples (5.1.2).
    1. In een experiment voor de glycaan profileringen van meerdere serum glycoproteïnen in een serum monster door het gebruik van meerdere euro's (zie voorbeeld experiment 1), zal een serummonsters worden toegepast op alle subarrays. In dit geval wordt 40 pi serum voldoende verdund in 360 pi PBS die 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG, 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 pi serum verdunde oplossing op elke deelgroepering.
    2. In een experiment voor de een glycan meting op meerdere serum-eiwitten met meerdere serummonsters met behulp van een GBP detecties (zie voorbeeld experiment 2). In dit geval wordt een pi serum voldoende verdund in 9 pi PBS die 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG , 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 ul verdund serum oplossing op elke deelgroepering.
  2. Na wax opdruk in stap 4, zorgvuldig toe te passen 6 pl van de verwaterde monster of controlemonsters (PBST0.1) aan elke subarray van de dia. Incubeer de dia in een vochtige cassette met natte papieren handdoeken bij kamertemperatuurgedurende 1 uur.
  3. Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
  4. Droog de dia door spinnen bij 1200 g gedurende 2 minuten.

6. Breng Gebiotinyleerde GBP (Lectin of Anti-glycaan antilichaam) op de Slide

  1. Tijdens Stap 2,4, voor te bereiden 10μg/ml van gebiotinyleerde lectinen / Gbps in PBST0.1.
    1. In glycaan profilering experiment dat sonde een monster met meerdere lectines (sample experiment 1), voor te bereiden 350 ul van gebiotinyleerd lectine dat is voldoende voor alle subarrays.
    2. In een glycan epitoop / biomarker screening in meerdere monsters met verschillende lectines bereiden 10 pi van elke gebiotinyleerde lectine dat voldoende is voor een deelgroepering.
  2. Breng 6 pi van het verdunde gebiotinyleerde lectine (s) elk subarray van de slede en incuberen in de bevochtigde preparaatdozen natte papieren handdoekjes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  3. Spoel de dia's met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten elke time.
  4. Droog de foto door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.

7. Breng Dye Labeled NeutrAvidin voor fluorescentie detectie

  1. Bereid 350 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin dat is voldoende voor alle subarrays.
  2. Breng 6 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin op elk subarray, en incubeer de dia in de bevochtigde slide cassette bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  3. Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
  4. Droog de glijbaan door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.

8. Zorg voor Microarray Slide Image by Het scannen van de Slide

  1. Scan de foto met behulp van een fluorescentie microarray scanner op 10 micrometer resolutie. De laser PMT instellingen zijn zo sterk mogelijk, maar geen verzadiging spot wordt waargenomen.

9. Data-extractie en analyse

  1. Open de afbeelding in ArrayPro 3.2. Stel de array template op basis van de array kaart die het antilichaam plekken locaties laat zien. Lijn elke sjabloon cirkel op de bijbehorende plek in de afbeelding.
  2. Pak de intensiteit van elke plek in een Excel-bestand voor verdere analyse.

10. Representatieve resultaten

Voorbeeld Experiment 1

Glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in hepatocellulair carcinoom patiënten serum monster volgens chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectinen detectie.

Het doel van dit experiment is om de individuele glycosylatieprofiel van 20 glycoproteïnen ontdekken in hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënt serummonster met behulp van chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met lectine-detectie. Een antilichaam microarray, dat 48 identieke subarrays waarvan 26 antilichamen en biotine-BSA onder meer bevat, is ontworpen en vervaardigd, zoals beschreven in Stap 1. Deze 26 antilichamen waren tegen 20 serum glycoproteïnen dat geïdentificeerd als veelbelovend vroege diagnose waarde HCC patiënten met lectine basis immunoprecipitatie gecombineerd met massaspectrometrie proteïne-identificatie 12, 32 zoals weergegeven in tabel 1. Het patroon en opstelling van het antilichaam spots gedrukt in drievoud in een representatief subarray worden getoond in figuur 1E en 1F respectievelijk. Twee identieke microarray dia's, een niet chemisch geblokkeerd (figuur 1A), terwijl de andere was (figuur 1B) werden gebruikt voor het uitvoeren van hetzelfde experiment glycosylering profilering om het belang van de chemisch te blokkeren procedure tonen de analyse. Voor het chemisch geblokkeerd dia (figuur 1B), het experiment begon op de Stap 2, want het geen chemisch geblokkeerd slide (Figuur 1A), het experiment gestart vanaf Stap 3. Het experiment werd uitgevoerd door following alle stappen beschreven in het protocol, behalve voor stap 5.1.2 en 6.1.2. In de stap 5,2, werd een PBST0.1 controlemonster aangebracht op subarrays in kolom 1 en 3, en samengevoegd HCC serummonster werd aangebracht op subarrays in kolom 2 en 4, respectievelijk (zie figuur 1G). Deze vergelijking is de doeltreffendheid, efficiëntie van de procedure, als de antigeen-bindende affiniteit van de antilichamen vertonen na chemisch te blokkeren. 22 gebiotinyleerd lectines (zie tabel 1) die specifiek zijn voor verschillende glycanen 18, 20 toegepast op elke deelgroepering zoals afgebeeld in figuur 1G voor glycosylering profilering. Beelden van de chemisch geblokkeerd (Figuur 1B) en niet-chemisch geblokkeerd (Figuur 1A) microarrays na de glycosylering profilering test door het volgen van het protocol. Zoals in de deelgroeperingen in kolom 1 en 3 niet-chemisch geblokkeerd microarrays (figuur 1A en figuur 1C), waarinAlleen PBST0.1 toegepast meeste lectines gebonden antilichamen vangen en bleek zeer hoge achtergrond die vergelijkbaar zijn met die van vlakjes in kolom 2 en 4, waarop het serum monster werd aangebracht. Het is onmogelijk om glycosyleringsprofiel informatie te verkrijgen uit deze microarray dia. Integendeel, bij hetzelfde experiment werd uitgevoerd op een chemisch geblokkeerde antilichaam microarray dia de vlakjes in kolom 1 en 3, waarin alleen PBST0.1 werd toegepast meeste lectines heeft weinig of geen binding aan antilichamen te vangen, terwijl hoge antigen bindings nog waargenomen subarrays in kolom 2 en 4, waarop serum monster werd aangebracht (figuur 1B en 1D). Deze resultaten toonde de chemisch te blokkeren procedure was een cruciale stap voorgrond het meten van de glycanen op de antilichaam-gevangen glycoproteïnen. Door het volgen van het protocol, kan glycosylering profielen van 22 glycoproteïnen in HCC serum worden verkregen.

Experiment 2

Scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers om gediscrimineerd levercirrose en hepatocellulair carcinoom patiënten.

Het doel van dit experiment is om te screenen op gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die levercirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënten discrimineren. Anders dan de Experiment 1, waarbij slechts een serummonster werd aangebracht op elk van vlakjes en gemerkt met verschillende lectines, in deze assay totaal 40 verschillende serummonsters van HCC cirrosepatiënten toegepast op elke deelgroepering en gehybridiseerd met een lectine (AAL ). Statistische analyse, zoals T-test, ontvanger-operating characteristic (ROC) curve, is gedaan om de uitkeringen of diagnostische prestaties van de glycan epiptope / biomarker op elke individuele eiwitten in alle serummonsters te evalueren. We gebruiken het antilichaam microarray vervaardigd Experiment 1, behalve anti-CA19-9 en anti-Lewis X antilichamen in deze studie. De expertiserimentele vond plaats van 2 tot 09 september stap, behalve voor de Step 5.1.1 en 6.1.1. Totaal 40 serum monsters van 20 levercirrose en 20 HCC patiënten bij willekeurig subarray van vlakjes 48 met de controle PBS monsters als negatieve controle. Fucosylation van elk van de gevangen eiwitten werd gedetecteerd met gebiotinyleerd Fucose specifieke lectine. De microarray beeld van figuur 1 blijkt het lectine AAL slechts gebonden serumeiwitten gevangen op de microarray (Figuur 2D) in plaats van gevangen antilichamen (figuur 2E). De AAL-binding intensiteiten van alle plaatsen werden vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van T-test en ROC curves om de prestaties van de fucosylation (AAL binding intensiteit) van elk serum eiwit op de discriminatie tussen de HCC en cirrose groepen te evalueren. De resultaten toonden aan dat de fucosylation van GP73 eiwit de beste discriminatie tussen de twee groepen gegeven met een p = 0,03 en het gebied ondercurve van de ROC curve is gelijk aan 0,72. Dit experiment toonde deze procedure is een snelle, efficiënte methode voor het glycan epitoop / biomarker screening op meerdere monsters in meerdere eiwitten.

ID Naam van het serum Afkorting Vennootschap Catalog #
L1 Gebiotinyleerde Concanavaline A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Gebiotinyleerd Sambucus nigra Lectin SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Gebiotinyleerd Lens Culinaris agglutinine LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Gebiotinyleerd Ricinus Communis agglutinine I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Gebiotinyleerd Aleuria aurantia Lectin AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Gebiotinyleerd Erythrina Cristagalli Lectin ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Gebiotinyleerd Wheat Germ agglutinine WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Biotinylated Peanut agglutinine PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Gebiotinyleerd Pisum sativum agglutinine PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Gebiotinyleerd Dolichos Biflorus agglutinine DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Gebiotinyleerd Datura stramonium Lectin DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Gebiotinyleerd Sophora Japonica agglutinine SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Gebiotinyleerd Soja agglutinine SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Gebiotinyleerd Solanum tuberosum (aardappel) Lectin STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Gebiotinyleerd Vicia villosa Lectin VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Gebiotinyleerd Lycopersicon esculentum (tomaat) Lectin LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Gebiotinyleerd Ulex europaeus agglutinine I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Gebiotinyleerd Jacalin JACALIN Vector Laboratories BK-3000
A1 Geit F (ab ') 2 Fragment anti-humaan IgM, Fc5μ antilichaam IgM Jackson Immuno Onderzoek 109-006-129
A2 Donkey F (ab ') 2Frag anti-humaan IgG (H + L) antilichaam AB1 Jackson Immuno Onderzoek 709-006-149
A3 Muis anti-humaan IgG F (ab ') 2 monoklonaal antilichaam AB3 Jackson Immuno Onderzoek 209-005-097
A4 Geit anti-humaan alpha 2 macroglobuline polyklonaal antilichaam A2M GeneTex GTX62924
A5 Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Muis anti-humaan alfa-1-antitrypsine monoklonaal antilichaam A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Konijn anti-humaan alfa-1-antichymotrypsin polyklonaal antilichaam ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Muis anti-humaan transferrine monoklonaal antilichaam Transferrine GeneTex GTX101035
A10 Konijn anti-humaan transferrine polyklonaal antilichaam Transferrine GeneTex GTX77130
A11 Geit anti-humaan apolipoproteïne J polyklonaal antilichaam ApoJ Abcam ab7610
A12 Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam GP73 Abbott 14H4-23
A13 Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam GP73 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIE INC sc-101275
A14 Konijn anti-humaan alpha-1 foetoproteïne polyklonaal antilichaam AFP GenWay GWB-41C966
A15 Muis anti-humaan alpha-1-fetoproteïne monoklonaal antilichaam AFP Fitzgerald 10 A05A
A16 Muis anti-humaan hemopexin monoklonaal antilichaam Hemopexin Assaypro 60,190 tot 05.011
A17 Muis anti-humaan glypican-3 (1G12) monoklonaal antilichaam GPLv3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Muis anti-humaan kininogen (LMW) monoklonaal antilichaam Kininogen Assaypro 20333 tot 05011
A19 Konijn anti-humaan MMP-21 monoklonaal antilichaam MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Muis anti-humaan CEACAM-een monoklonaal antilichaam CEACAM R & D Systems MAB1180
Een21 Rat anti-humaan DPPIV/CD26 monoklonaal antilichaam DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Muis anti-humaan PIVKA II monoklonaal antilichaam PIVICA Crystal chem 8040
A23 Muis anti-carcino-embryonaal antigeen CEA Amerikaanse biologische C1300
A24 Muis anti-CA125 Cancer Antigen CA125 Amerikaanse biologische C0050-01D
A25 Muis anti-CA19-9 kanker antigeen CA19-9 Amerikaanse biologische C0075-18
A26 Muis anti-Lewis x monoklonaal antilichaam Lewis X Calbiochem 434631
bio Gebiotinyleerd BSA (positieve controle) Bio Huisgemaakte N / A

Tabel 1. Lijst van lectinen en antistoffen die in dit protocol.

Naam van / het reagens s apparatuur Vennootschap Catalogusnummer
Niet contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplaat Visser 14-230-243
Foodsaver Foodsaver V3835
Ultradunne nitrocellulose coate microarray schuift Gentel PATH
Slide Imprinter (optioneel) De Gel Company WSP60-1
Shaker Visser 15-453-211
Centrifugeer Eppendorf 5804 000.013
Schuif wastafel / Slide Staining Dish wie Verwijderbare Rack Visser 08-812
Slide incubatiekamer / microscoopglaasje box Visser 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% oplossing in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Visser P337-100
Natriumperjodaat (NAIO 4) Sigma 311448
L-Glutaminezuur γ-hydrazide Sigma G-7257
Natriumacetaat watervrij (CH 3 COONa) Sigma S2889
Bovine Serum Albumine (BSA) Lampire Biologische Labs 7500804
Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (10X) Denville Wetenschappelijk CP4390-48
Dylight 549 geconjugeerd NeutrAvidin Thermo 22837
Proteaseremmer Cocktail Tabletten Roche 4693159001
ChromPure humaan IgG, Fc-fragment Jackson Immunoresearch 009-000-008
ChromPure humaan IgG, volledige molecuul Jackson Immunoresearch 009-000-003
ChromPure muis IgG, volledige molecuul Jackson Immunoresearch 015-000-003
ChromPure muis IgG, Fc fragment Jackson Immunoresearch 015-000-008
ChromPure konijn IgG, volledige molecuul Jackson Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, hele molecuul Jackson Immunoresearch 017-000-003
Microarray scanner Tecan LS Reloaded

Tabel 2. Lijstvan apparatuur en reagentia die in dit protocol.

Schema 1
Schema 1 Een schema met de lectine antilichaam microarray gebaseerd glycan ontdekking van biomarkers proces 1 (stap 2 tot 4): Blokkeer het antilichaam microarray met de blokker (Glu-hydrazide) en BSA, 2 (stap 5):.. Van toepassing serummonsters en vast te leggen specifieke glycoproteïnen met specifieke antilichamen, 3 (stap 6): van toepassing gebiotinyleerd lectine (s), 4 (stap 7): Probe de gebiotinyleerde AAL met Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin voor microarray imaging.

Figuur 1
Figuur 1. Microarray-beelden van de Sample Experiment 1 glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in HCC patiënt serum monster volgens chemiebondgenoot geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectine detectie. Twee identieke microarray dia (A) geen chemisch geblokkeerd of (B) chemisch geblokkeerd zoals beschreven in Stap 2, beide ging alle stappen 2-9 voor glycosylering profilering, en vergelijkingsdoeleinden. (A) en (B) worden de microarray afbeeldingen die gescand zijn Stap 8 in een resolutie van 10 micron. (C) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van het geen chemisch geblokkeerd microarray glijbaan (A); (D) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van de niet chemisch geblokkeerd microarray slide (B)), (E) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (F)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (G) Serum monster en lectine locatie: een diagram laat zien welke subarray elk serum monster en lectine werd aangebracht op.

Figuur 2
Figuur 2. Microarray-beelden van desample experiment 2 scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die discrimineren levercirrose en HCC patiënten. De microarray assay werd uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld Experiment 2 sectie. (A) Het hele slide beeld van de microarray dia uit Stap 8; (B) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (C)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (D) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met serum monster; (E) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met PBS controle.

Figuur 3
Figuur 3. Glycaan profilering resultaten van voorbeeld experiment 1. Elke staaf grafiek vertegenwoordigen lectine bindend profiel (of glycaan profielen) van een van de 20 geteste eiwit. Totaal 22 verschillende lectines werden gebruikt om e analyserene glycosyleringsprofiel van elke proteïne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Target eiwit-en capture-antilichaam selectie

Voorafgaand aan het antilichaam microarray test sommige reagentia en materialen nodig geacht en bereid. Om een ​​antilichaam microarray voor glycaan profileren of glycan biomarker screening, een panel van antilichamen die specifiek glycoproteïne kandidaten te ontwerpen moet worden bepaald op basis van de literatuur of van eerdere resultaten. Deze antilichamen werden meestal gekocht van verschillende leveranciers, zoals R & D Systems, etc. IgGs de voorkeur capture antilichamen sinds onze vorige tests is gebleken dat een aantal IgM en IgE volledig kunnen hun antigeen-bindende affiniteiten te verliezen na de chemische modificatie.

2. Ontwerp en productie van antilichamen microarray

Productie van het antilichaam microarray is een optionele stap die professioneel en duur microarrayer, en goed opgeleid personeel voor de bediening nodig heeft. Echter, op maat gemaakte antilichamen microarray fabrikanttuur kan gemakkelijk worden gedaan vanaf een dienstverlener als Serome Biosciences Inc Voor een robuust resultaat, raden wij een non-contact microarrayer, zoals de Scienion sciFLEXARRAYER ultra laag volume non-contact microarrayer die werd gebruikt in onze antilichaam microarray productie. Hoge bindingscapaciteit microarray dia's, zoals PATH (Gentel Bio Inc WI) of Dia H (Shott, PA).

3. Selecteer en glycaan bindende eiwitten (Gbps) Bereid je voor op glycosylering profilering

Gbps deze doelstelling verschillende mono-of oligosacchariden kunnen worden gevonden in de literatuur en via een zoekmachine ontwikkeld door Haab laboratorium 29 en gehandhaafd op de translationele Genomics Institute Om te selecteren Gbps met een hoge specificiteit en affiniteit metde beoogde glycan epitopen, selecteert u het motief (epitoop) uit het drop down menu, en klik op "zoeken." De Gbps specifieke dit motief (epitoop) zal worden opgenomen naar hun logP waarde van hoog naar laag om. Hogere logP duidt op een sterkere bindingsaffiniteit en specificiteit van de glycan motief / epitoop. Inherent aan het niet-specifieke binding probleem van lectine deze methode nog niet zo optimaal het antilichaam gebaseerde assay. Daarom raden wij aan dat anti-glycaan antilichamen worden gebruikt, zoals anti-Lewis x of anti-sialyl Lewis een antistoffen, indien deze beschikbaar zijn. Het gebruik van meerdere Gbps voor de detectie is een andere strategie om over te steken controleren op verschillende binding profielen en om betrouwbare gegevens te verkrijgen bindend.

4. Data analyse

Omdat deze methode wordt gebruikt om inheemse serumeiwitten te detecteren, kan eiwit-eiwit-complexen worden opgevangen en gedetecteerd. Western blot of massa-spectrometrie is goed methoden om de microarray data te valideren. Inmiddels, Detectie van proteïne met dezelfde niveaus microarray is een andere methode om de gegevens van de glycosylering wijziging van het eiwit, zoals of veranderingen toe te schrijven aan het totale eiwitgehalte wijziging of alleen die glycosylering niveau verhoogd elk van de eiwitten leren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Hepatitis en Virus Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter