Summary
In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.
Protocol
1. Druk een antilichaam Microarray voor de test
- Verdun alle antilichamen tot 0,5 mg / ml in fosfaatbuffer zoutoplossing, pH 7,2 (PBS).
- Aliquot 40 pi van elk antilichaam in het 384-wells bron plaat.
- Plaats de 384-wells source plaat op de Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
- Laad 20 PATH microarray dia's op de microarrayer als doel.
- Stel de microarrayer tot 48 identieke subarrays, waarin 27 antilichamen en controle eiwitten worden gespot in drievoud in een 9x9 patroon (figuur 1E, 1F) af te drukken.
- Start de microarrayer aan het antilichaam microarray dia's af te drukken.
- Verzamel het antilichaam microarray dia's, en bewaar ze in dia's cassette met droogmiddel. Vacuümafsluiting de cassette in een plastic zak met behulp van vacuumsealer (Foodsaver).
- Bewaar de gesloten microarray dia's bij 4 ° C in de koelkast.
2. Chemisch Blokkeer de Antilichaam Microarray tot GBP voorkomenBinding aan de Capture Antilichamen
De microarray test begint zodra de microarray dia's zijn chemisch geblokkeerd en duurt ongeveer 8 uur. Eenmaal begonnen de microarray test moet worden uitgevoerd (stap 2 tot 8).
- Neem de microarray schuift uit de koelkast, en evenwicht ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder de schuif van de doos en kort te spoelen in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,1% Tween 20 (PBST0.1) eenmaal een dia wastafel, en in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 met 0,1% Tween (CBT0 0,1) in een sequentiële wijze. Incubeer de glaasjes in CBT0.1 gedurende 10 minuten in een diaweergave wastafel.
- Bereid verse 150 mM NAIO 4 in 15 mM natriumacetaat buffer pH 5,0 (CB), en bewaar het in in een dia wastafel in de koelkast terwijl het vermijden van licht voor gebruik.
- Verwijder de dia in de CB, en zet hem in het bassin met vers NAIO 4 met het antilichaam kantnaar boven. Bedek de bekken met aluminiumfolie licht voorkomen en de schuif bekken incuberen gedurende 2 uur onder zacht schudden bij 4 ° C in de koelkast.
- Bereid 300 ml 10 mM hydrazide glutaminezuur (de blokker) in CB.
- Verwijder de dia in de bekken, en kort te spoelen in CB 3 keer gedurende 5 minuten per keer in slide wastafel.
- Incubeer de glaasjes in de blokkering in een wastafel 2 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Verwijder de dia's van het bekken, en was ze met PBST0.1 gedurende 3 minuten.
3. Blokkeren Niet-specifieke banden van de Microarray met Bovine Serum Albumine (BSA)
- Bereid 300 ml 1% BSA in fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7,2 met 0,5% Tween (PBST0.5) in een dia wastafel, en incuberen de microarray schuif in het bassin 1 uur bij kamertemperatuur zacht schudden.
- Spoel de dia's in PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
- Zet de schuifop een dia rek, en spin op 1.200 xg op een centrifugatie gedurende 2 minuten op de microarray slide drogen.
4. Impressum Wax Grid op de Microarray Schuif aan elke subarray Scheid
- Voorverwarmen was imprinter bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
- Laad de geblokkeerde microarray dia in de was imprinter met antilichaam zijde aan de was. Trek de hendel te prenten was in de dia gelijkmatig.
5. Breng serummonsters op de Microarray Slide
- Tijdens Stap 2.4, voor te bereiden serummonsters voor een van beide glyco profilering test in een monster (5.1.1), of enkele glyco epiptope meting met meerdere samples (5.1.2).
- In een experiment voor de glycaan profileringen van meerdere serum glycoproteïnen in een serum monster door het gebruik van meerdere euro's (zie voorbeeld experiment 1), zal een serummonsters worden toegepast op alle subarrays. In dit geval wordt 40 pi serum voldoende verdund in 360 pi PBS die 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG, 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 pi serum verdunde oplossing op elke deelgroepering.
- In een experiment voor de een glycan meting op meerdere serum-eiwitten met meerdere serummonsters met behulp van een GBP detecties (zie voorbeeld experiment 2). In dit geval wordt een pi serum voldoende verdund in 9 pi PBS die 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml muis IgG, 100 pg / ml rat IgG, 100 pg / ml konijn IgG , 100 pg / ml geit IgG en 100 pg / ml ezel IgG. Deze hoeveelheid is voldoende voor toepassing 6 ul verdund serum oplossing op elke deelgroepering.
- Na wax opdruk in stap 4, zorgvuldig toe te passen 6 pl van de verwaterde monster of controlemonsters (PBST0.1) aan elke subarray van de dia. Incubeer de dia in een vochtige cassette met natte papieren handdoeken bij kamertemperatuurgedurende 1 uur.
- Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
- Droog de dia door spinnen bij 1200 g gedurende 2 minuten.
6. Breng Gebiotinyleerde GBP (Lectin of Anti-glycaan antilichaam) op de Slide
- Tijdens Stap 2,4, voor te bereiden 10μg/ml van gebiotinyleerde lectinen / Gbps in PBST0.1.
- In glycaan profilering experiment dat sonde een monster met meerdere lectines (sample experiment 1), voor te bereiden 350 ul van gebiotinyleerd lectine dat is voldoende voor alle subarrays.
- In een glycan epitoop / biomarker screening in meerdere monsters met verschillende lectines bereiden 10 pi van elke gebiotinyleerde lectine dat voldoende is voor een deelgroepering.
- Breng 6 pi van het verdunde gebiotinyleerde lectine (s) elk subarray van de slede en incuberen in de bevochtigde preparaatdozen natte papieren handdoekjes bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel de dia's met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten elke time.
- Droog de foto door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.
7. Breng Dye Labeled NeutrAvidin voor fluorescentie detectie
- Bereid 350 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin dat is voldoende voor alle subarrays.
- Breng 6 pl van Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin op elk subarray, en incubeer de dia in de bevochtigde slide cassette bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel de dia met PBST0.1 drie keer gedurende 3 minuten per keer.
- Droog de glijbaan door het draaien van het op 1200 xg in centrifuge voor 2 minuten.
8. Zorg voor Microarray Slide Image by Het scannen van de Slide
- Scan de foto met behulp van een fluorescentie microarray scanner op 10 micrometer resolutie. De laser PMT instellingen zijn zo sterk mogelijk, maar geen verzadiging spot wordt waargenomen.
9. Data-extractie en analyse
- Open de afbeelding in ArrayPro 3.2. Stel de array template op basis van de array kaart die het antilichaam plekken locaties laat zien. Lijn elke sjabloon cirkel op de bijbehorende plek in de afbeelding.
- Pak de intensiteit van elke plek in een Excel-bestand voor verdere analyse.
10. Representatieve resultaten
Voorbeeld Experiment 1
Glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in hepatocellulair carcinoom patiënten serum monster volgens chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectinen detectie.
Het doel van dit experiment is om de individuele glycosylatieprofiel van 20 glycoproteïnen ontdekken in hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënt serummonster met behulp van chemisch geblokkeerd antilichaam microarray met lectine-detectie. Een antilichaam microarray, dat 48 identieke subarrays waarvan 26 antilichamen en biotine-BSA onder meer bevat, is ontworpen en vervaardigd, zoals beschreven in Stap 1. Deze 26 antilichamen waren tegen 20 serum glycoproteïnen dat geïdentificeerd als veelbelovend vroege diagnose waarde HCC patiënten met lectine basis immunoprecipitatie gecombineerd met massaspectrometrie proteïne-identificatie 12, 32 zoals weergegeven in tabel 1. Het patroon en opstelling van het antilichaam spots gedrukt in drievoud in een representatief subarray worden getoond in figuur 1E en 1F respectievelijk. Twee identieke microarray dia's, een niet chemisch geblokkeerd (figuur 1A), terwijl de andere was (figuur 1B) werden gebruikt voor het uitvoeren van hetzelfde experiment glycosylering profilering om het belang van de chemisch te blokkeren procedure tonen de analyse. Voor het chemisch geblokkeerd dia (figuur 1B), het experiment begon op de Stap 2, want het geen chemisch geblokkeerd slide (Figuur 1A), het experiment gestart vanaf Stap 3. Het experiment werd uitgevoerd door following alle stappen beschreven in het protocol, behalve voor stap 5.1.2 en 6.1.2. In de stap 5,2, werd een PBST0.1 controlemonster aangebracht op subarrays in kolom 1 en 3, en samengevoegd HCC serummonster werd aangebracht op subarrays in kolom 2 en 4, respectievelijk (zie figuur 1G). Deze vergelijking is de doeltreffendheid, efficiëntie van de procedure, als de antigeen-bindende affiniteit van de antilichamen vertonen na chemisch te blokkeren. 22 gebiotinyleerd lectines (zie tabel 1) die specifiek zijn voor verschillende glycanen 18, 20 toegepast op elke deelgroepering zoals afgebeeld in figuur 1G voor glycosylering profilering. Beelden van de chemisch geblokkeerd (Figuur 1B) en niet-chemisch geblokkeerd (Figuur 1A) microarrays na de glycosylering profilering test door het volgen van het protocol. Zoals in de deelgroeperingen in kolom 1 en 3 niet-chemisch geblokkeerd microarrays (figuur 1A en figuur 1C), waarinAlleen PBST0.1 toegepast meeste lectines gebonden antilichamen vangen en bleek zeer hoge achtergrond die vergelijkbaar zijn met die van vlakjes in kolom 2 en 4, waarop het serum monster werd aangebracht. Het is onmogelijk om glycosyleringsprofiel informatie te verkrijgen uit deze microarray dia. Integendeel, bij hetzelfde experiment werd uitgevoerd op een chemisch geblokkeerde antilichaam microarray dia de vlakjes in kolom 1 en 3, waarin alleen PBST0.1 werd toegepast meeste lectines heeft weinig of geen binding aan antilichamen te vangen, terwijl hoge antigen bindings nog waargenomen subarrays in kolom 2 en 4, waarop serum monster werd aangebracht (figuur 1B en 1D). Deze resultaten toonde de chemisch te blokkeren procedure was een cruciale stap voorgrond het meten van de glycanen op de antilichaam-gevangen glycoproteïnen. Door het volgen van het protocol, kan glycosylering profielen van 22 glycoproteïnen in HCC serum worden verkregen.
Experiment 2
Scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers om gediscrimineerd levercirrose en hepatocellulair carcinoom patiënten.
Het doel van dit experiment is om te screenen op gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die levercirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC) patiënten discrimineren. Anders dan de Experiment 1, waarbij slechts een serummonster werd aangebracht op elk van vlakjes en gemerkt met verschillende lectines, in deze assay totaal 40 verschillende serummonsters van HCC cirrosepatiënten toegepast op elke deelgroepering en gehybridiseerd met een lectine (AAL ). Statistische analyse, zoals T-test, ontvanger-operating characteristic (ROC) curve, is gedaan om de uitkeringen of diagnostische prestaties van de glycan epiptope / biomarker op elke individuele eiwitten in alle serummonsters te evalueren. We gebruiken het antilichaam microarray vervaardigd Experiment 1, behalve anti-CA19-9 en anti-Lewis X antilichamen in deze studie. De expertiserimentele vond plaats van 2 tot 09 september stap, behalve voor de Step 5.1.1 en 6.1.1. Totaal 40 serum monsters van 20 levercirrose en 20 HCC patiënten bij willekeurig subarray van vlakjes 48 met de controle PBS monsters als negatieve controle. Fucosylation van elk van de gevangen eiwitten werd gedetecteerd met gebiotinyleerd Fucose specifieke lectine. De microarray beeld van figuur 1 blijkt het lectine AAL slechts gebonden serumeiwitten gevangen op de microarray (Figuur 2D) in plaats van gevangen antilichamen (figuur 2E). De AAL-binding intensiteiten van alle plaatsen werden vervolgens geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van T-test en ROC curves om de prestaties van de fucosylation (AAL binding intensiteit) van elk serum eiwit op de discriminatie tussen de HCC en cirrose groepen te evalueren. De resultaten toonden aan dat de fucosylation van GP73 eiwit de beste discriminatie tussen de twee groepen gegeven met een p = 0,03 en het gebied ondercurve van de ROC curve is gelijk aan 0,72. Dit experiment toonde deze procedure is een snelle, efficiënte methode voor het glycan epitoop / biomarker screening op meerdere monsters in meerdere eiwitten.
ID | Naam van het serum | Afkorting | Vennootschap | Catalog # |
L1 | Gebiotinyleerde Concanavaline A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L2 | Gebiotinyleerd Sambucus nigra Lectin | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
L3 | Gebiotinyleerd Lens Culinaris agglutinine | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L4 | Gebiotinyleerd Ricinus Communis agglutinine I | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L5 | Gebiotinyleerd Aleuria aurantia Lectin | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
L6 | Gebiotinyleerd Erythrina Cristagalli Lectin | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L7 | Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
L8 | Gebiotinyleerd Wheat Germ agglutinine | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L9 | Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
L10 | Gebiotinyleerd Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
L11 | Biotinylated Peanut agglutinine | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L12 | Gebiotinyleerd Pisum sativum agglutinine | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L13 | Gebiotinyleerd Dolichos Biflorus agglutinine | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L14 | Gebiotinyleerd Datura stramonium Lectin | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L15 | Gebiotinyleerd Sophora Japonica agglutinine | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L16 | Gebiotinyleerd Soja agglutinine | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L17 | Gebiotinyleerd Solanum tuberosum (aardappel) Lectin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ Td> |
L18 | Gebiotinyleerd Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I | GSL I | Vector Laboratories | BK-2000 |
L19 | Gebiotinyleerd Vicia villosa Lectin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
L20 | Gebiotinyleerd Lycopersicon esculentum (tomaat) Lectin | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L21 | Gebiotinyleerd Ulex europaeus agglutinine I | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
L22 | Gebiotinyleerd Jacalin | JACALIN | Vector Laboratories | BK-3000 |
A1 | Geit F (ab ') 2 Fragment anti-humaan IgM, Fc5μ antilichaam | IgM | Jackson Immuno Onderzoek | 109-006-129 |
A2 | Donkey F (ab ') 2Frag anti-humaan IgG (H + L) antilichaam | AB1 | Jackson Immuno Onderzoek | 709-006-149 |
A3 | Muis anti-humaan IgG F (ab ') 2 monoklonaal antilichaam | AB3 | Jackson Immuno Onderzoek | 209-005-097 |
A4 | Geit anti-humaan alpha 2 macroglobuline polyklonaal antilichaam | A2M | GeneTex | GTX62924 |
A5 | Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
A6 | Muis anti-humaan alfa-1-antitrypsine monoklonaal antilichaam | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
A7 | Konijn anti-humaan alfa-1-antitrypsine polyklonaal antilichaam | ACT | NeoMarkers | RB-367-A1 |
A8 | Konijn anti-humaan alfa-1-antichymotrypsin polyklonaal antilichaam | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
A9 | Muis anti-humaan transferrine monoklonaal antilichaam | Transferrine | GeneTex | GTX101035 |
A10 | Konijn anti-humaan transferrine polyklonaal antilichaam | Transferrine | GeneTex | GTX77130 |
A11 | Geit anti-humaan apolipoproteïne J polyklonaal antilichaam | ApoJ | Abcam | ab7610 |
A12 | Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
A13 | Muis anti-humaan GP73 monoklonaal antilichaam | GP73 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIE INC | sc-101275 |
A14 | Konijn anti-humaan alpha-1 foetoproteïne polyklonaal antilichaam | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
A15 | Muis anti-humaan alpha-1-fetoproteïne monoklonaal antilichaam | AFP | Fitzgerald | 10 A05A |
A16 | Muis anti-humaan hemopexin monoklonaal antilichaam | Hemopexin | Assaypro | 60,190 tot 05.011 |
A17 | Muis anti-humaan glypican-3 (1G12) monoklonaal antilichaam | GPLv3 | Santa Cruz Bio | sc-65443 |
A18 | Muis anti-humaan kininogen (LMW) monoklonaal antilichaam | Kininogen | Assaypro | 20333 tot 05011 |
A19 | Konijn anti-humaan MMP-21 monoklonaal antilichaam | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
A20 | Muis anti-humaan CEACAM-een monoklonaal antilichaam | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
Een21 | Rat anti-humaan DPPIV/CD26 monoklonaal antilichaam | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
A22 | Muis anti-humaan PIVKA II monoklonaal antilichaam | PIVICA | Crystal chem | 8040 |
A23 | Muis anti-carcino-embryonaal antigeen | CEA | Amerikaanse biologische | C1300 |
A24 | Muis anti-CA125 Cancer Antigen | CA125 | Amerikaanse biologische | C0050-01D |
A25 | Muis anti-CA19-9 kanker antigeen | CA19-9 | Amerikaanse biologische | C0075-18 |
A26 | Muis anti-Lewis x monoklonaal antilichaam | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
bio | Gebiotinyleerd BSA (positieve controle) | Bio | Huisgemaakte | N / A |
Tabel 1. Lijst van lectinen en antistoffen die in dit protocol.
Naam van / het reagens s apparatuur | Vennootschap | Catalogusnummer |
Niet contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
384 microplaat | Visser | 14-230-243 |
Foodsaver | Foodsaver | V3835 |
Ultradunne nitrocellulose coate microarray schuift | Gentel | PATH |
Slide Imprinter (optioneel) | De Gel Company | WSP60-1 |
Shaker | Visser | 15-453-211 |
Centrifugeer | Eppendorf | 5804 000.013 |
Schuif wastafel / Slide Staining Dish wie Verwijderbare Rack | Visser | 08-812 |
Slide incubatiekamer / microscoopglaasje box | Visser | 03-448-5 |
Brij 35, 30 w / v% oplossing in water | Acros Organics | AC32958-0025 |
Tween-20 | Visser | P337-100 |
Natriumperjodaat (NAIO 4) | Sigma | 311448 |
L-Glutaminezuur γ-hydrazide | Sigma | G-7257 |
Natriumacetaat watervrij (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Lampire Biologische Labs | 7500804 |
Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) (10X) | Denville Wetenschappelijk | CP4390-48 |
Dylight 549 geconjugeerd NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
Proteaseremmer Cocktail Tabletten | Roche | 4693159001 |
ChromPure humaan IgG, Fc-fragment | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
ChromPure humaan IgG, volledige molecuul | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
ChromPure muis IgG, volledige molecuul | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
ChromPure muis IgG, Fc fragment | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
ChromPure konijn IgG, volledige molecuul | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
ChromPure Donkey IgG, hele molecuul | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
Microarray scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tabel 2. Lijstvan apparatuur en reagentia die in dit protocol.
Schema 1 Een schema met de lectine antilichaam microarray gebaseerd glycan ontdekking van biomarkers proces 1 (stap 2 tot 4): Blokkeer het antilichaam microarray met de blokker (Glu-hydrazide) en BSA, 2 (stap 5):.. Van toepassing serummonsters en vast te leggen specifieke glycoproteïnen met specifieke antilichamen, 3 (stap 6): van toepassing gebiotinyleerd lectine (s), 4 (stap 7): Probe de gebiotinyleerde AAL met Dylight 549 gelabeld NeutrAvidin voor microarray imaging.
Figuur 1. Microarray-beelden van de Sample Experiment 1 glycosylering profilering van meerdere serum glycoproteïnen in HCC patiënt serum monster volgens chemiebondgenoot geblokkeerd antilichaam microarray met meerdere lectine detectie. Twee identieke microarray dia (A) geen chemisch geblokkeerd of (B) chemisch geblokkeerd zoals beschreven in Stap 2, beide ging alle stappen 2-9 voor glycosylering profilering, en vergelijkingsdoeleinden. (A) en (B) worden de microarray afbeeldingen die gescand zijn Stap 8 in een resolutie van 10 micron. (C) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van het geen chemisch geblokkeerd microarray glijbaan (A); (D) het inzoomen beeld van de eerste twee rijen van de niet chemisch geblokkeerd microarray slide (B)), (E) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (F)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (G) Serum monster en lectine locatie: een diagram laat zien welke subarray elk serum monster en lectine werd aangebracht op.
Figuur 2. Microarray-beelden van desample experiment 2 scherm voor gewijzigde fucosylation op specifieke serum glycoproteïnen als biomarkers die discrimineren levercirrose en HCC patiënten. De microarray assay werd uitgevoerd zoals beschreven in Voorbeeld Experiment 2 sectie. (A) Het hele slide beeld van de microarray dia uit Stap 8; (B) het schema van het antilichaam regeling binnen elke subarray; (C)-array kaarten: de locatie van elk antilichaam binnen de subarray, elk antilichaam naam staat voor 3 spots; (D) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met serum monster; (E) een zoom-in beeld van een subarray die werden geïncubeerd met PBS controle.
Figuur 3. Glycaan profilering resultaten van voorbeeld experiment 1. Elke staaf grafiek vertegenwoordigen lectine bindend profiel (of glycaan profielen) van een van de 20 geteste eiwit. Totaal 22 verschillende lectines werden gebruikt om e analyserene glycosyleringsprofiel van elke proteïne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Target eiwit-en capture-antilichaam selectie
Voorafgaand aan het antilichaam microarray test sommige reagentia en materialen nodig geacht en bereid. Om een antilichaam microarray voor glycaan profileren of glycan biomarker screening, een panel van antilichamen die specifiek glycoproteïne kandidaten te ontwerpen moet worden bepaald op basis van de literatuur of van eerdere resultaten. Deze antilichamen werden meestal gekocht van verschillende leveranciers, zoals R & D Systems, etc. IgGs de voorkeur capture antilichamen sinds onze vorige tests is gebleken dat een aantal IgM en IgE volledig kunnen hun antigeen-bindende affiniteiten te verliezen na de chemische modificatie.
2. Ontwerp en productie van antilichamen microarray
Productie van het antilichaam microarray is een optionele stap die professioneel en duur microarrayer, en goed opgeleid personeel voor de bediening nodig heeft. Echter, op maat gemaakte antilichamen microarray fabrikanttuur kan gemakkelijk worden gedaan vanaf een dienstverlener als Serome Biosciences Inc Voor een robuust resultaat, raden wij een non-contact microarrayer, zoals de Scienion sciFLEXARRAYER ultra laag volume non-contact microarrayer die werd gebruikt in onze antilichaam microarray productie. Hoge bindingscapaciteit microarray dia's, zoals PATH (Gentel Bio Inc WI) of Dia H (Shott, PA).
3. Selecteer en glycaan bindende eiwitten (Gbps) Bereid je voor op glycosylering profilering
Gbps deze doelstelling verschillende mono-of oligosacchariden kunnen worden gevonden in de literatuur en via een zoekmachine ontwikkeld door Haab laboratorium 29 en gehandhaafd op de translationele Genomics Institute Om te selecteren Gbps met een hoge specificiteit en affiniteit metde beoogde glycan epitopen, selecteert u het motief (epitoop) uit het drop down menu, en klik op "zoeken." De Gbps specifieke dit motief (epitoop) zal worden opgenomen naar hun logP waarde van hoog naar laag om. Hogere logP duidt op een sterkere bindingsaffiniteit en specificiteit van de glycan motief / epitoop. Inherent aan het niet-specifieke binding probleem van lectine deze methode nog niet zo optimaal het antilichaam gebaseerde assay. Daarom raden wij aan dat anti-glycaan antilichamen worden gebruikt, zoals anti-Lewis x of anti-sialyl Lewis een antistoffen, indien deze beschikbaar zijn. Het gebruik van meerdere Gbps voor de detectie is een andere strategie om over te steken controleren op verschillende binding profielen en om betrouwbare gegevens te verkrijgen bindend.
4. Data analyse
Omdat deze methode wordt gebruikt om inheemse serumeiwitten te detecteren, kan eiwit-eiwit-complexen worden opgevangen en gedetecteerd. Western blot of massa-spectrometrie is goed methoden om de microarray data te valideren. Inmiddels, Detectie van proteïne met dezelfde niveaus microarray is een andere methode om de gegevens van de glycosylering wijziging van het eiwit, zoals of veranderingen toe te schrijven aan het totale eiwitgehalte wijziging of alleen die glycosylering niveau verhoogd elk van de eiwitten leren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Instituut voor Hepatitis en Virus Research.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. |
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).