Summary
I denne studien, beskriver vi en bedre protokoll for en multiplekset høy gjennomstrømning antistoff microarray med lektin påvisning metode som kan brukes i glykosylering profilering av spesifikke proteiner. Denne protokollen inneholder nye pålitelige reagenser og reduserer tid, kostnad, og lab utstyr krav i forhold til forrige prosedyren.
Protocol
1. Skrive ut et antistoff Microarray til analysen
- Fortynn alle antistoffer til 0,5 mg / ml i fosfatbuffer saltvann, 7,2 pH (PBS).
- Delmengde 40 mL av hver antistoff inn i 384-brønnen kilde plate.
- Legg 384-brønnen kilde plate på Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer.
- Load 20 PATH microarray lysbilder på microarrayer som mål.
- Sett microarrayer å skrive ut 48 identiske subarrays, der 27 antistoffer og kontroll proteiner er oppdaget i tre eksemplarer i en 9x9 mønster (Figur 1E, 1F).
- Start microarrayer å skrive ut antistoff microarray lysbildene.
- Samle antistoff microarray lysbildene, og lagre dem i lysbilder kassett med tørkemiddel. Vakuumforseglingen kassetten i en plastpose ved hjelp av vakuum sealer (Foodsaver).
- Oppbevar de forseglede microarray lysbildene ved 4 ° C i kjøleskap.
2. Kjemisk Blokker Antistoff Microarray å forebygge GBPBinding til Capture Antistoffer
Den microarray-analysen starter når microarray lysbildene er kjemisk blokkert og varer i ca 8 timer. Når startet microarray analysen har ferdigstilt (trinn 2 til 8).
- Ta microarray glir ut av kjøleskapet, og likevekt dem til romtemperatur i 30 minutter.
- Fjern lysbildet fra oppbevaringsboks og kort skyll dem i fosfatbuffer saltvann pH 7,2 med 0,1% Tween 20 (PBST0.1) en gang i et lysbilde vask bassenget, og deretter i 15 mm natriumacetat buffer pH 5,0 med 0,1% Tween (CBT0 0.1) i en sekvensiell måte. Inkuber lysbilder i CBT0.1 i 10 minutter i lysbilde vask bassenget.
- Forbered fersk 150 mm NaIO 4 i 15 mM natriumacetat buffer pH 5,0 (CB), og holde den i inn i et lysbilde vask bassenget i kjøleskap og samtidig unngå lys før bruk.
- Fjern lysbildet fra CB, og sette det inn i bassenget inneholder frisk NaIO 4 med antistoffet sidenvendt opp. Dekk til bassenget med aluminiumsfolie for å unngå lys, og inkuber lysbildet bassenget i 2 timer med forsiktig risting ved 4 ° C i kjøleskap.
- Forbered 300 ml 10 mM hydrazide glutaminsyre (blokkeren) i CB.
- Fjern lysbildet fra bassenget, og kort skyll den i CB 3 ganger i 5 minutter hver gang i lysbilde vask bassenget.
- Inkuber lysbildene i blocker i en vask bassenget i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Fjern lysbilder fra bassenget, og vask dem med PBST0.1 i 3 minutter.
3. Blokker Uspesifikke Bindinger til Microarray med bovint serumalbumin (BSA)
- Forbered 300 ml 1% BSA i fosfatbuffer saltvann pH 7,2 med 0,5% Tween (PBST0.5) i et lysbilde vask bassenget, og Inkuber microarray lysbildet i bassenget i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting.
- Skyll lysbildene i PBST0.1 tre ganger i 3 minutter hver gang.
- Sett rasetpå et lysbilde rack, og spinn ved 1200 xg på en sentrifugering i 2 minutter å tørke microarray lysbildet.
4. Imprint Wax Grid på Microarray Slide for å skille hver Subarray
- Pre-oppvarming voks Imprinter ved 70 ° C i 5 minutter.
- Legg blokkert microarray lysbilde i voks Imprinter med antistoff vendt til voksen. Trekk forsiktig i håndtaket til forlaget voks på lysbildet jevnt.
5. Påfør Serumprøver på Microarray Slide
- Under Trinn 2.4, forberede serumprøver for enten glyco profilering analysen i én prøve (5.1.1), eller enkelt glyco epiptope måling blant flere prøver (5.1.2).
- I et eksperiment for glykan profilings av flere serum glykoproteiner i en serumprøve ved hjelp av flere euro (se eksempel eksperiment 1), vil man serumprøver påføres alle subarrays. I dette tilfellet er 40 mL serum rikelig fortynnet i 360 mL PBS som inneholder 0,1%Tween-20, 0,1% 35 Brij, 100 mikrogram / ml mus IgG, 100 mikrogram / ml rotte IgG, 100 mikrogram / ml kanin IgG, 100 mikrogram / ml av geit IgG og 100 mikrogram / ml esel IgG. Dette volumet er tilstrekkelig for å anvende 6 mL fortynnet serum løsning på hver subarray.
- I et eksperiment for en glykan måling på flere serumproteiner mellom flere serumprøver ved hjelp av én GBP deteksjoner (se eksempel eksperiment 2). I dette tilfellet er en mL serum rikelig fortynnet i 9 mL PBS som inneholder 0,1% Tween-20, 0,1% 35 Brij, 100 mikrogram / ml mus IgG, 100 mikrogram / ml rotte IgG, 100 mikrogram / ml av kanin IgG , 100 mikrogram / ml av geit IgG og 100 mikrogram / mL esel IgG. Dette volumet er tilstrekkelig for å anvende 6 mL fortynnet serum løsning på hver subarray.
- Etter voks avtrykk i trinn 4, nøye gjelde 6 mL fortynnet prøve eller kontrollprøver (PBST0.1) til hver subarray av lysbildet. Inkuber lysbilde i en fuktet kassett med våte tørkepapir ved romtemperaturi 1 time.
- Skyll lysbildet med PBST0.1 tre ganger for 3 minutter hver gang.
- Tørk lysbildet ved å spinne den på 1200 xg for 2 minutt.
6. Påfør Biotinylated GBP (lektin eller Anti-glykan antistoff) på Slide
- Under Trinn 2.4, forberede 10μg/ml av biotinylated lectins / Gbps i PBST0.1.
- I glykan profilering eksperiment som sonde en prøve med flere lectins (prøve eksperiment 1), forberede 350 mL av biotinylated lektin som er tilstrekkelig for alle subarrays.
- I singel glykan epitop / biomarkør screening i flere prøver ved hjelp av flere lectins, forberede 10 mL av hver biotinylated lektin som er tilstrekkelig for en subarray.
- Påfør 6 mL av den fortynnede biotinylated lektin (e) til hver subarray av raset, og inkuber i fuktet lysbildet boksen med våte tørkepapir i romtemperatur i 1 time.
- Skyll lysbildene med PBST0.1 tre ganger i 3 minutter hver Timeg.
- Tørk lysbildet ved å spinne den på 1200 xg i sentrifuger i 2 minutt.
7. Påfør Dye Merket NeutrAvidin for Fluorescence Detection
- Forbered 350 mL av Dylight 549 merket NeutrAvidin som er tilstrekkelig for alle subarrays.
- Påfør 6 mL av Dylight 549 merket NeutrAvidin på hver subarray, og inkuber lysbildet i fuktet lysbildet kassetten ved romtemperatur i 1 time.
- Skyll lysbildet med PBST0.1 tre ganger for 3 minutter hver gang.
- Tørk lysbilde ved å snurre den ved 1200 xg i sentrifuger i 2 minutt.
8. Skaff Microarray Slide Bilde av Skanning Slide
- Skann lysbildet ved hjelp av en fluorescens microarray scanner på 10 mikrometer oppløsning. Laser og PMT innstillingene skal være så sterk som mulig, men ingen metning sted er observert.
9. Datauttrekk og analyse
- Åpne bildet i ArrayPro 3.2. Sett opp matrisen malen i henhold til matrisen kart som viser de antistoff flekker steder. Nøye justere hver mal sirkel på tilsvarende sted i bildet.
- Pakk intensiteten av hver spot til en Excel-fil for videre analyse.
10. Representative Resultater
Eksempel Forsøk 1
Glykosylering profilering av flere serum glykoproteiner i hepatocellulært karsinom pasient serumprøve ved hjelp kjemisk blokkert antistoff microarray med flere lectins deteksjon.
Målet med dette eksperimentet er å utforske den enkelte glykosyleringsprofil 20 glykoproteiner i hepatocellulært karsinom (HCC) pasient serumprøve ved hjelp av kjemisk blokkert antistoff microarray med lektin deteksjon. Et antistoff microarray, som inneholder 48 identiske subarrays som inkluderer 26 antistoffer og biotin-BSA, ble designet og produsert som beskrevet i STEP en. Disse 26 antistoffene var mot 20 serum glykoproteiner som identifiserte som lovende tidlig diagnose verdi for HCC pasienter med lektin baserte immunoprecipitation kombinert med massespektrometrisk protein identifikasjon 12, 32 som vist i Tabell 1. Mønsteret og arrangement av antistoff flekker trykt i tre eksemplarer i én representant subarray er vist i figur 1E og 1F, henholdsvis. To identiske microarray lysbilder, var man ikke kjemisk blokkert (figur 1A), mens den andre ble (figur 1B), ble brukt til å utføre den samme glykosylering profilering eksperiment for å vise betydningen av kjemisk blokkerer fremgangsmåten til analysen. For kjemisk blokkert lysbilde (figur 1B), startet eksperimentet ved trinn 2, for ingen kjemisk blokkert lysbilde (figur 1A), forsøket startet fra Trinn 3. Forsøket ble gjennomført ved following alle trinnene beskrevet i protokollen bortsett Step 5.1.2 og 6.1.2. I trinn 5.2, ble en PBST0.1 kontrollutvalget påføres subarrays i kolonne 1 og 3, og en samlet HCC serumprøve ble påføres subarrays i kolonne 2 og 4, henholdsvis (som vist i Figur 1G). Denne sammenligningen er å vise effektiviteten, effektivitet av prosedyren, samt antigen bindingsaffinitet av antistoffer etter kjemisk blokkering. 22 biotinylated lectins (som vist i tabell 1) som er spesifikk for ulike glykaner 18, 20 ble brukt på hver subarray som vist i Figur 1G for glykosylering profilering. Bilder av kjemisk blokkerte (figur 1B) og ikke-kjemisk blokkert (Figur 1a) microarrays etter glykosylering profilering analysen ved å følge protokollen. Som vist i subarrays i kolonne 1 og 3 i ikke-kjemisk blokkerte mikromatriser (Figur 1a og figur 1c), sombare PBST0.1 ble brukt, de fleste lectins bundet til fange antistoffer, og viste meget høy bakgrunn som kan sammenlignes med de subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøve ble brukt. Det er umulig å få glykan profil informasjon fra denne microarray lysbilde. Tvert imot, når det samme eksperimentet ble gjort på en kjemisk blokkert antistoff microarray raset, de subarrays i kolonne 1 og 3, som bare PBST0.1 ble brukt, viste de fleste lectins ingen eller svært lav bindingene til fange antistoffer, mens høy antigen bindinger ble fortsatt observert i subarrays i kolonne 2 og 4, hvor serumprøve ble brukt (Figur 1B og 1D). Disse Resultatet viste kjemisk blokkering prosedyren var et kritisk punkt derfor måling av glykaner på antistoff-fangede glykoproteiner. Ved å følge protokollen, kan glykosylering profiler av 22 glykoproteiner i HCC serum oppnås.
Eksperiment 2
Screen etter endrede fucosylation på spesifikke serum glykoproteiner som biomarkører til diskriminert skrumplever og leverkreft pasienter.
Målet med dette eksperimentet er å screene for endrede fucosylation på bestemte serum glykoproteiner som biomarkører som diskriminerer skrumplever og leverkreft (HCC) pasienter. Forskjellig fra Experiment 1, der bare en serumprøve ble brukt på hver subarrays og analysert med ulike lectins, i denne analysen, totalt 40 forskjellige serumprøver fra HCC og cirrhose pasienter ble brukt på hver subarray, og analysert med en lektin (AAL ). Statistisk analyse, for eksempel t-test, mottaker-operativ karakteristikk (ROC) kurve, ble gjort for å evaluere fordelinger eller diagnostisk ytelse av glykan epiptope / biomarkør på hver enkelt protein i alle serumprøver. Vi brukte den samme antistoff microarray produsert i Forsøk 1 unntatt for anti-CA19-9 og anti-Lewis X antistoffer i denne studien. Den kompetanseiment ble gjennomført fra 02.09 til trinn 9. bortsett Step 5.1.1 og 6.1.1. Totalt 40 serumprøver fra 20 skrumplever og 20 HCC pasienter ble anvendt på tilfeldig subarray av de 48 subarrays sammen med kontrolltastene PBS prøvene som negativ kontroll. Fucosylation av hver de fangede proteinene ble da oppdaget ved hjelp biotinylated Fucose-spesifikk lektin. Den microarray Bildet er vist i figur 1 viste lektin AAL bare bundet til serumproteiner fanget på microarray (Figur 2D) i stedet for fangede antistoffer (figur 2E). De AAL bindende intensiteter av alle stedene ble deretter hentet, og analysert ved hjelp av t-test og ROC kurver for å evaluere ytelsen til fucosylation (AAL bindende intensitet) av hver serum protein på diskriminering mellom HCC og skrumplever grupper. Resultatene viste at fucosylation av GP73 protein gav den beste diskriminering mellom de to gruppene med en p = 0,03 og areal-under-kurve av ROC kurven tilsvarer 0,72. Dette eksperimentet demonstrerte denne prosedyren er en rask, effektiv metode for glykan epitop / biomarkør screening på flere prøver i flere proteiner.
| ID | Navn på reagensen | Forkortelse | Firma | Catalog # |
| L1 | Biotinylated Concanavalin A | Cona | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | Biotinylated Sambucus Nigra lektin | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Biotinylated Ricinus communis Agglutinin jeg | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Biotinylated Aleuria Aurantia lektin | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Biotinylated Erythrina Cristagalli lektin | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lektin II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Biotinylated hvetekim Agglutinin | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | Biotinylated Peanut Agglutinin | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | Biotinylated Pisum sativum Agglutinin | Ptil | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Biotinylated Datura Stramonium lektin | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Biotinylated Soybean Agglutinin | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Biotinylated Solanum tuberosum (Potet) lektin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ Td> |
| L18 | Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia lektin jeg | GSL jeg | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Biotinylated Vicia villosa lektin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Biotinylated Lycopersicon esculentum (Tomato) lektin | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | Biotinylated Ulex europaeus Agglutinin jeg | UEA jeg | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Biotinylated Jacalin | JACALIN | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | Goat F (ab ') 2 fragmenter anti-human IgM, Fc5μ antistoff | IgM | Jackson Immuno Forskning | 109-006-129 |
| A2 | Donkey F (ab ') 2Frag anti-human IgG (H + L) antistoff | AB1 | Jackson Immuno Forskning | 709-006-149 |
| A3 | Mus anti-human IgG F (ab ') 2 monoklonalt antistoff | AB3 | Jackson Immuno Forskning | 209-005-097 |
| A4 | Goat anti-human alfa 2 makroglobulin polyklonale antistoff | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | Rabbit anti-human alfa-1-antitrypsin polyklonale antistoff | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | Mus anti-human alfa-1-antitrypsin monoklonalt antistoff | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | Rabbit anti-human alfa-1-antitrypsin polyklonale antistoff | ACT | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | Rabbit anti-human alfa-1-antikkhymotrypsin polyklonale antistoff | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Mus anti-human transferrin monoklonalt antistoff | Transferrin | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | Rabbit anti-human transferrin polyklonale antistoff | Transferrin | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | Goat anti-human apolipoprotein J polyklonale antistoff | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | Mus anti-human GP73 monoklonalt antistoff | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | Mus anti-human GP73 monoklonalt antistoff | GP73 | SANTA CRUZ bioteknologi INC | SC-101 275 |
| A14 | Rabbit anti-human alfa-1 fetoprotein polyklonale antistoff | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | Mus anti-human alfa-1 fetoprotein monoklonalt antistoff | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Mus anti-human hemopexin monoklonalt antistoff | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | Mus anti-human glypican-3 (1G12) monoklonalt antistoff | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65443 |
| A18 | Mus anti-human Kininogen (LMW) monoklonalt antistoff | Kininogen | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | Rabbit anti-human MMP-21 monoklonalt antistoff | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Mus anti-human CEACAM-1 monoklonalt antistoff | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| A21 | Rat anti-human DPPIV/CD26 monoklonalt antistoff | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Mus anti-human PIVKA II monoklonalt antistoff | PIVICA | Crystal Chem | 8040 |
| A23 | Mus anti-carcinoembryonic antigen | CEA | USA biologisk | C1300 |
| A24 | Mus anti-ca125 Cancer Antigen | Ca125 | USA biologisk | C0050-01D |
| A25 | Mus anti-CA19-9 Cancer antigen | CA19-9 | USA biologisk | C0075-18 |
| A26 | Mus anti-Lewis x monoklonalt antistoff | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
| bio | Biotinylated BSA (positiv kontroll) | Bio | Hjemmelaget | N / A |
Tabell 1. Liste over lectins og antistoffer som brukes i denne protokollen.
| Navn på reagensbeholdere s / utstyr | Firma | Katalognummer |
| Ikke kontakt microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| 384 mikroplate | Fisher | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Supertynn nitrocellulose coate microarray glir | Gentel | PATH |
| Slide Imprinter (valgfritt) | Gel Selskapet | WSP60-1 |
| Shaker | Fisher | 15-453-211 |
| Sentrifuger | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Skyv vask bassenget / Slide Farging Dish with Avtakbart Rack | Fisher | 08-812 |
| Slide inkubasjon kammer / objektglass boks | Fisher | 03-448-5 |
| 35 Brij, 30 w / v% løsning i vann | ACROS Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Fisher | P337-100 |
| Sodium Periodate (NaIO 4) | Sigma | 311448 |
| L-glutaminsyre γ-hydrazide | Sigma | G-7257 |
| Natriumacetat vannfri (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Lampire Biologisk Labs | 7500804 |
| Fosfatbuffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 |
| Dylight 549 konjugert NeutrAvidin | Thermo | 22837 |
| Proteasehemmer Cocktail tabletter | Roche | 4693159001 |
| ChromPure human IgG, Fc fragment | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure human IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure Mouse IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure Rabbit IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure Donkey IgG, hel molekyl | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray Scanner | TECAN | LS Reloaded |
Tabell 2. Listav utstyr og reagenser som brukes i denne protokollen.
Scheme 1 A ordningen viser lektin antistoffet microarray basert glykan biomarkører prosess 1 (trinn 2-4): Blokker antistoff microarray med blokkeren (Glu-hydrazide) og BSA, 2 (Trinn 5):.. Gjelde serumprøver og fange spesifikke glykoproteiner med spesifikke antistoffer, 3 (Trinn 6): anvendelse biotinylated lektin (r), 4 (trinn 7): Probe den biotinylated AAL med Dylight 549 merket NeutrAvidin for microarray bildebehandling.
Figur 1. Microarray bilder av utvalget Experiment en glykosylering profilering av flere serum glykoproteiner i HCC pasient serumprøve ved hjelp Chemicalliert blokkert antistoff microarray med flere lektin deteksjon. To identiske microarray lysbilder, (A) ingen kjemisk blokkert, eller (B) kjemisk blokkert som beskrevet i trinn 2, gikk begge gjennom alle trinnene fra 2 til 9 for glykosylering profilering, samt sammenligning formål. (A) og (B) blir microarray bildene skannes på Trinn 8 i en oppløsning på 10 mikron. (C) zoom i bildet av de to første radene i ingen kjemisk blokkert microarray lysbilde (A), (D) zoom i bildet av de to første radene i non kjemisk blokkert microarray lysbilde (B)); (E) diagrammet av antistoffet ordningen innenfor hver subarray, (F) array-kart: plasseringen av hver antistoff i subarray, representerer hver antistoff navn 3 spots, (G) serumprøve og lektin sted: Et diagram viser hvilke subarray hver serumprøve og lektin ble brukt på.
Figur 2. Microarray bilder avUtvalget eksperiment 2-skjermen for endret fucosylation på bestemte serum glykoproteiner som biomarkører som diskriminerer skrumplever og HCC pasienter. Den microarray-analysen ble gjennomført som beskrevet i Eksempel Experiment § 2. (A) Hele lysbilde Bildet av microarray lysbildet fra Trinn 8, (B) diagrammet av antistoffet ordningen innenfor hver subarray, (C) array-kart: plasseringen av hver antistoff i subarray, representerer hver antistoff navn 3 spots; (D) en zoom-in bilde av en subarray som ble inkubert med serumprøve, (E) en zoom-in bilde av en subarray som ble inkubert med PBS kontroll.
Figur 3. Glykan profilering resultatene fra prøven eksperiment en. Hver søylediagram representere lektin bindende profil (eller glykan profiler) av en av de 20 testede protein. Totalt 22 forskjellige lectins ble brukt til å analysere the glykan profilen hvert protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Target protein og fangst antistoff utvalg
Før antistoffet microarray-analysen, er noen reagenser og materialer for å bli vurdert og forberedt. Å designe et antistoff microarray for glykan profilering eller glykan biomarkør screening, et panel av antistoffer som er spesifikke for glykoprotein kandidater bør fastsettes i henhold til litteraturen eller fra tidligere resultater. Disse antistoffene ble vanligvis kjøpt fra ulike leverandører som R & D Systems etc. IgGs foretrekkes capture antistoffer siden våre tidligere tester viste at noen IgM og IgE kan helt miste sine antigen bindende slektskap etter kjemisk modifisering.
2. Design og produksjon av antistoff microarray
Produksjon av antistoff microarray trinnet er valgfritt som trenger profesjonell og dyre microarrayer, og godt utdannet personell for drift. Men tilpasset antistoff microarray fabrikatTure kan lett gjøres fra en tjenesteleverandør som Serome biovitenskap Inc. For en robust resultat, anbefaler vi en ikke-kontakt microarrayer, som Scienion sciFLEXARRAYER ultra lavt volum ikke-kontakt microarrayer som ble brukt i vår antistoff microarray produksjon. Høye bindende kapasitet microarray lysbilder, for eksempel PATH (Gentel Bio Inc. WI) eller Slide H (Shott, PA).
3. Velg og Forbered glykan bindende proteiner (Gbps) for glykosylering profilering
Euro som mål forskjellig mono-eller oligosakkarider kan finnes i litteraturen og gjennom en søkemotor utviklet av Haab laboratoriet 29 og opprettholdt på Translasjonell Genomics Institute Slik velger euro med høy spesifisitet og affinitet tilde målrettede glykan epitoper, velg motiv (epitop) fra rullegardinmenyen, og klikk "søk". Den euro spesifikke for dette motivet (epitop) vil bli listet opp i henhold til deres logP verdi fra høy til lav orden. Høyere logP indikerer en sterkere binding affinitet og spesifisitet til glykan motivet / epitop. På grunn av den iboende ikke-spesifikk binding problemet fra lektin, er denne metoden fortsatt ikke så optimal som antistoff baserte analysen. Derfor anbefaler vi sterkt, er at anti-glykan antistoffer brukes, for eksempel anti-Lewis X eller anti-sialyl Lewis noen antistoffer, hvis de er tilgjengelige. Bruk av flere Gbps for deteksjon er en annen strategi for å krysse sjekke ulike bindende profiler og å få pålitelige data bindende.
4. Dataanalyse
Fordi denne metoden brukes til å oppdage innfødte serumproteiner, kan protein-protein komplekser bli fanget og registrert. Western blot eller massespektrometri er gode metoder for å validere de mikroarray data. I mellomtiden, Påvisning av protein nivå med samme microarray er en annen metode for å lære detaljene i glykosylering endring av protein, for eksempel om endringene skyldtes det totale protein nivået endring eller bare at glykosylering nivået økt på hver av proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institutt for hepatitt og Virus Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
| Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
| Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
| Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
| Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
| Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
| Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
| Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
| Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
| Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
| Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
| Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
| Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
| Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
| Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
| Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
| Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
| Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
| Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
| Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
| Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
| Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
| Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
| Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
| Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
| Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
| Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
| Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
| Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
| Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
| Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
| Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
| Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
| Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
| Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
| Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
| Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
| Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
| Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
| Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
| Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
| Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
| Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
| Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
| Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
| Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
| 384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
| Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
| Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
| Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
| Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
| Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
| Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
| Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
| L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
| Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
| Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
| ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
| ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
| Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
| Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. | |||
References
- Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
- Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
- Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
- Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
- Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
- Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
- Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
- Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
- Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
- Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
- Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
- Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
- Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
- Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
- Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
- Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
- Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
- Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
- Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
- Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
- Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
- Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
- Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
- Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
- Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
- Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
- Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
- Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
- Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
- Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
- Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).
