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Biology

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

doi: 10.3791/3791 Published: May 4, 2012

Summary

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Protocol

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1. Stampare un Microarray dell'anticorpo per il test

  1. Diluire tutti gli anticorpi a 0,5 mg / ml in soluzione salina tampone fosfato, pH 7,2 (PBS).
  2. Aliquotare 40 pl di ciascun anticorpo nella piastra a 384 pozzetti sorgente.
  3. Caricare la piastra a 384 pozzetti sorgente sul micro-distributore sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. Caricare 20 vetrini microarray PATH sul micro-distributore come bersaglio.
  5. Impostare la micro-distributore per stampare 48 sottoarray identici, in cui sono macchiati 27 anticorpi e proteine ​​di controllo in triplice copia in una configurazione 9x9 (Figura 1E, 1F).
  6. Avviare il micro-distributore per stampare le diapositive anticorpi microarray.
  7. Raccogliere i vetrini microarray anticorpi, e conservarli in cassette diapositive con essiccante. Aspirare sigillare la cassetta in un sacchetto di plastica sottovuoto utilizzando saldatrice (Foodsaver).
  8. Memorizzare i vetrini microarray sigillati a 4 ° C in frigorifero.

2. Chimicamente Bloccare il Microarray anticorpo per prevenire GBPIl legame con i anticorpi di cattura

Il dosaggio microarray inizia una volta che i vetrini microarray sono chimicamente bloccati e dura per circa 8 ore. Una volta avviato il saggio microarray deve essere completata (Procedura 2 a 8).

  1. Prendere il microarray scorre fuori dal frigorifero, ed equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti.
  2. Rimuovere il vetrino dal contenitore e brevemente sciacquare in soluzione salina tampone fosfato pH 7,2 con 0,1% Tween 20 (PBST0.1) una volta in una diapositiva lavabo, e poi in 15 mM tampone pH sodio acetato 5,0% di Tween 0,1 (CBT0 .1) in modo sequenziale. Incubare i vetrini in CBT0.1 per 10 minuti in vasca scorrevole lavaggio.
  3. Preparare fresca 150 mM Naio 4 in 15 mM tampone di acetato di sodio pH 5.0 (CB), e tenerlo in in una diapositiva lavandino in frigorifero, evitando la luce prima dell'uso.
  4. Rimuovere il vetrino dalla CB, e metterlo nella vasca contenente fresca Naio 4 con il lato anticorporivolto verso l'alto. Coprire il bacino con foglio di alluminio per evitare la luce, e incubare il bacino vetrino per 2 ore con delicata agitazione a 4 ° C in frigorifero.
  5. Preparare 300 ml di 10 mM di acido glutammico idrazide (il blocco) in CB.
  6. Rimuovere il vetrino dal bacino, e brevemente sciacquarlo in CB 3 volte per 5 minuti ogni volta in bacino diapositive lavaggio.
  7. Incubare le diapositive il blocco in una vasca di lavaggio per 2 ore a temperatura ambiente con delicata agitazione.
  8. Rimuovere i vetrini dal bacino, e lavarli con PBST0.1 per 3 minuti.

3. Blocco non specifici Associazioni per la Microarray con albumina sierica bovina (BSA)

  1. Preparare 300 ml di 1% BSA in tampone fosfato pH 7,2 con soluzione salina 0,5% Tween (PBST0.5) in un bacino diapositiva lavaggio, e incubare il vetrino microarray nel bacino per 1 ora a temperatura ambiente agitando delicatamente.
  2. Sciacquare i vetrini in PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  3. Mettere il vetrinosu un rack scorrevole, e centrifugare a 1200 xg su una centrifugazione per 2 minuti per asciugare il vetrino microarray.

4. Imprint Griglia Cera sul vetrino Microarray per separare ogni sottomatrice

  1. Pre-riscaldamento del imprinter cera a 70 ° C per 5 minuti.
  2. Caricare il vetrino microarray bloccato nella imprinter cera con il lato di anticorpi rivolto verso la cera. Estrarre delicatamente la maniglia a cera imprimere sul vetrino in modo uniforme.

5. Applicare campioni di siero sul vetrino Microarray

  1. Durante la fase 2.4, preparare i campioni di siero per entrambi i test profiling glico in un campione (5.1.1), o singola glico misura epiptope tra campioni multipli (5.1.2).
    1. In un esperimento per le profilature glycan di più glicoproteine ​​del siero in un unico campione di siero utilizzando più Sterline (vedi esperimento campione 1), uno i campioni di siero sarà applicato su tutti i sottoarray. In questo caso, 40 microlitri ampio siero viene diluito in 360 microlitri di PBS contenente 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml di IgG di topo, 100 pg / ml di IgG di ratto, 100 pg / ml di IgG di coniglio, 100 pg / ml di IgG di capra e 100 pg / ml di asino IgG. Questo volume è sufficiente per l'applicazione di 6 microlitri di una soluzione diluita di siero su ogni sottomatrice.
    2. In un esperimento per la misurazione uno glicani su più proteine ​​del siero tra più campioni di siero utilizzando uno rilevazioni GBP (vedere esperimento campione 2). In questo caso, 1 pl ampio siero viene diluito in 9 pl di PBS contenente 0,1% Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 pg / ml di IgG di topo, 100 pg / ml di IgG di ratto, 100 pg / ml di IgG di coniglio , 100 pg / ml di IgG di capra e 100 pg / mL di asino IgG. Questo volume è sufficiente per l'applicazione di 6 microlitri di una soluzione diluita di siero su ogni sottomatrice.
  2. Dopo l'impronta di cera al punto 4, ad applicare attentamente 6 microlitri di campione diluito o di campioni di controllo (PBST0.1) ad ogni sottomatrice della diapositiva. Incubare il vetrino in una cassetta umidificato con tovaglioli di carta bagnati a temperatura ambienteper 1 ora.
  3. Sciacquare il vetrino con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare è a 1200 xg per 2 minuti.

6. Applicare biotinilato GBP (Anticorpo o lectina Anti-glicano) nella diapositiva

  1. Durante la fase 2.4, preparare 10μg/ml delle lectine biotinilati / Gbps in PBST0.1.
    1. Nell'esperimento profiling glicano che sonda un campione con lectine multipli (campione esperimento 1), preparare 350 microlitri di lectina biotinilato che è sufficiente per tutti i sottoarray.
    2. In singolo glicano epitopo / biomarker di screening in campioni multipli utilizzando lectine più, preparare 10 pl di ogni lectina biotinilato che è sufficiente per un sottoarray.
  2. Applicare 6 microlitri della lectina diluito biotinilato (s) a ciascuna sottomatrice della slitta, e incubare nella scatola slitta umidificata con tovaglioli di carta umidi a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Sciacquare i vetrini con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ciascuno Time.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare è a 1200 xg in centrifugare per 2 minuti.

7. Applicare Dye neutravidina etichetta per il rilevamento della fluorescenza

  1. Preparare 350 microlitri di Dylight 549 neutravidina marcato che è sufficiente per tutti i sottoarray.
  2. Applicare 6 pl di Dylight 549 neutravidina etichettate su ciascun subarray, e incubare il vetrino nel cassetto scorrevole umidificato a temperatura ambiente per 1 ora.
  3. Sciacquare il vetrino con PBST0.1 tre volte per 3 minuti ogni volta.
  4. Asciugare il vetrino facendo girare l'ha a 1200 xg in centrifugare per 2 minuti.

8. Ottenere Immagine diapositiva Microarray a Scansione la diapositiva

  1. Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner a fluorescenza microarray a risoluzione di 10 micron. Le impostazioni di laser e PMT deve essere il più forte possibile, ma nessun punto di saturazione si osserva.

9. Estrazione dei dati e analisi

  1. Aprire l'immagine in ArrayPro 3.2. Impostare il modello di serie in base alla mappa matrice che mostra la posizione degli anticorpi macchie. Allineare con cura ogni cerchio modello sul punto corrispondente nell'immagine.
  2. Estrarre l'intensità di ogni spot in un file Excel per ulteriori analisi.

10. Risultati rappresentativi

Esempio di esperimento 1

Profiling glicosilazione delle glicoproteine ​​sieriche più a campione del paziente carcinoma epatocellulare siero mediante microarray anticorpi chimicamente bloccato con più di rilevamento lectine.

L'obiettivo di questo esperimento è quello di esplorare il profilo individuale di 20 glicoproteine ​​glicosilazione nel carcinoma epatocellulare (HCC) campione di siero del paziente mediante microarray anticorpi chimicamente bloccato con rilevamento lectina. Un microarray anticorpo, che contiene 48 sottoarray identici che comprendono 26 anticorpi e biotina-BSA, è stato progettato e realizzato come descritto nella Step 1. Questi anticorpi erano 26 contro 20 glicoproteine ​​siero che identificati come promettenti valore diagnosi precoce per pazienti con carcinoma epatocellulare utilizzando Lectina immunoprecipitazione base combinato con l'identificazione di proteine ​​spettrometria di massa 12, 32 come mostrato nella Tabella 1. Il modello e la disposizione dei punti anticorpo stampate in triplice copia in una sottomatrice rappresentante sono illustrati nella Figura 1E e 1F, rispettivamente. Due vetrini microarray identiche, non era chimicamente bloccato (Figura 1A), mentre l'altro è (figura 1B), sono stati utilizzati per effettuare lo stesso esperimento profilatura glicosilazione al fine di dimostrare l'importanza della procedura chimicamente blocco per l'analisi. Per la slitta chimicamente bloccata (figura 1B), l'esperimento avviato alla fase 2, per il none slitta chimicamente bloccato (Figura 1A), l'esperimento è iniziato dal punto 3. L'esperimento è stato portato da following tutti i passi descritti nel protocollo ad eccezione di Fase 5.1.2 e 6.1.2. Nella Fase 5,2, uno PBST0.1 campione di controllo è stato applicato su sottoarray in colonna 1 e 3, e un pool campione di HCC siero è stato applicato su sottoarray nella colonna 2 e 4, rispettivamente (Figura 1G). Questo confronto è per dimostrare l'efficacia, l'efficienza del procedimento, nonché l'affinità antigene legame degli anticorpi dopo chimicamente blocco. 22 lectine biotinilati (come mostrato in Tabella 1) che specifica per glicani differenti 18, 20 sono stati applicati su ciascuna sottomatrice come mostrato nella Figura 1G per profilatura glicosilazione. Le immagini dei chimicamente bloccati (Figura 1B) e non chimicamente bloccato (Figura 1A) microarray dopo il dosaggio glicosilazione profilatura seguendo il protocollo. Come mostrato nelle sottoarray nella colonna 1 e 3 in microarrays bloccati non chimicamente (Figura 1A e la Figura 1C), in cuisolo PBST0.1 è stata applicata, la maggior parte delle lectine destinata a catturare gli anticorpi, e ha mostrato di fondo molto elevato che paragonabili a quelle sottoarray nella colonna 2 e 4, in cui è stato applicato il campione di siero. È impossibile ottenere informazioni glicano profilo da questa diapositiva microarray. Al contrario, quando lo stesso esperimento è stato fatto su un vetrino anticorpo chimicamente bloccato microarray, i subarray nella colonna 1 e 3, su cui è stata applicata solo PBST0.1, la maggior parte delle lectine binding non mostrato o molto basso per catturare gli anticorpi, mentre antigene elevato associazioni sono mantenuti in subarray nella colonna 2 e 4, sul quale campione di siero è stato applicato (figura 1B e 1D). Questi risultati hanno mostrato la procedura chimicamente blocco è stato un passo fondamentale quindi la misura di glicani su anticorpi catturati glicoproteine. Seguendo il protocollo, profili di glicosilazione 22 glicoproteine ​​HCC in siero può essere ottenuta.

Esperimento 2

Schermo per fucos alteratiylation su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker per cirrosi epatica discriminati e pazienti con carcinoma epatocellulare.

L'obiettivo di questo esperimento è quello di schermo per fucosylation alterato su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker che discriminano cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare (HCC) pazienti. A differenza dell'esperimento 1, in cui è stato applicato un solo campione di siero su ogni sottoarray e sondato con lectine vari, in questo saggio, un totale di 40 campioni di siero diversi da HCC e cirrosi pazienti sono stati applicati su ciascun subarray, e sondati con una lectina (AAL ). L'analisi statistica, come il T test, ricevitore-operativa caratteristica (ROC) curve, è stato fatto per valutare le distribuzioni o la prestazione diagnostica del epiptope glicano / biomarker su ogni singola proteina in tutti i campioni di siero. Abbiamo utilizzato il microarray stesso anticorpo prodotto nell'Esperimento 1 eccetto per anti-CA19-9 e anticorpi anti-Lewis X in questo studio. Il compeiment è stata effettuata dal 2 settembre al punto 9 tranne il passaggio 5.1.1 e 6.1.1. Totale 40 campioni di siero da 20 cirrosi e 20 pazienti con carcinoma epatocellulare sono stati applicati al subarray casuale delle 48 sottoarray insieme ai campioni di controllo PBS come controllo negativo. Fucosylation di ciascuna delle proteine ​​rilevati sono stati poi rilevato mediante biotinilato specifico lectina-fucosio. L'immagine microarray mostrato in Figura 1 ha dimostrato l'AAL lectina solo legati alle proteine ​​plasmatiche catturati sul microarray (Figura 2D) invece di anticorpi catturati (figura 2E). Le intensità AAL vincolanti tutti gli spot sono stati poi estratti, e analizzati mediante test T e curve ROC per valutare le prestazioni del fucosylation (AAL intensità legame) di ciascuna proteina del siero del discriminazione tra HCC e gruppi cirrosi. I risultati hanno mostrato che la fucosylation di GP73 proteina ha la migliore discriminazione tra i due gruppi con p = 0,03 e area sottoCurva di curva ROC pari a 0,72. Questo esperimento dimostra questa procedura è un metodo rapido e efficiente per l'epitopo / biomarker glicano lo screening su campioni multipli all'interno proteine ​​multiple.

ID Nome del reattivo Abbreviazione Azienda Catalogo #
L1 Biotinilato Concanavalina A ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Biotinilato Sambucus Nigra lectina SNA Vector Laboratories B-1305
L3 Biotinilato Lens Culinaris agglutinina LCA Vector Laboratories BK-2000
L4 Biotinilato Ricinus Communis agglutinina I RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Biotinilato Aleuria aurantia lectina AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Biotinilato Erythrina cristagalli lectina ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Biotinilato di Germe di Grano agglutinina WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Biotinilato Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Biotinilato Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 BioPeanut agglutinina tinylated PNA Vector Laboratories BK-1000
L12 Biotinilato Pisum Sativum agglutinina PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Biotinilato Dolichos biflorus agglutinina DBA Vector Laboratories BK-1000
L14 Biotinilato lectina Datura Stramonium DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Biotinilato agglutinina Sophora Japonica SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Soia agglutinina biotinilato SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Biotinilato Solanum tuberosum (patata) lectina STL Vector Laboratories BK-3000 </ Td>
L18 Biotinilato Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I GSL I Vector Laboratories BK-2000
L19 Biotinilato Vicia Villosa lectina VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Biotinilato Lycopersicon esculentum (pomodoro) lectina LEL Vector Laboratories BK-3000
L21 Biotinilato Ulex Europaeus agglutinina I UEA I Vector Laboratories BK-1000
L22 Biotinilato Jacalin JACALIN Vector Laboratories BK-3000
A1 Capra F (ab ') 2 Frammento anti-IgM umane, anticorpi Fc5μ IgM Jackson Immuno Research 109-006-129
A2 Donkey F (ab ') 2Frag anti-IgG umane (H + L) anticorpo AB1 Jackson Immuno Research 709-006-149
A3 Topo anti-IgG umane F (ab ') 2 anticorpo monoclonale AB3 Jackson Immuno Research 209-005-097
A4 Capra anti-umano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonale A2M GeneTex GTX62924
A5 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale A1AT Lee Biosiences CA1T-80A
A6 Topo anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo monoclonale A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Coniglio anti-umano alfa-1-antitripsina anticorpo policlonale ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 Coniglio anti-umano alfa-1-antichymotrypsin anticorpo policlonale ACT Fisher Scientific RB9213R7
A9 Topo anti-transferrina umana anticorpo monoclonale Transferrina GeneTex GTX101035
A10 Coniglio anti-transferrina umana anticorpo policlonale Transferrina GeneTex GTX77130
A11 Capra anti-umano apolipoproteina J anticorpo policlonale ApoJ Abcam ab7610
A12 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Abbott 14H4-23
A13 Topo anti-umano GP73 anticorpo monoclonale GP73 Santa Cruz Biotechnology INC sc-101275
A14 Coniglio anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo policlonale AFP GenWay GWB-41C966
A15 Murino anti-umano alfa-1 fetoproteina anticorpo monoclonale AFP Fitzgerald 10-A05A
A16 Topo anti-umano emopessina anticorpo monoclonale Emopessina Assaypro 60.190-05.011
A17 Murino anti-umano glypican-3 (1g12) anticorpo monoclonale GPL3 Santa Cruz Bio sc-65443
A18 Topo anti-umano chininogeno (LMW) anticorpo monoclonale Chininogeno Assaypro 20.333-05.011
A19 Coniglio anti-umano MMP-21 anticorpo monoclonale MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Murino anti-umano CEACAM-1 anticorpo monoclonale CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Ratto anti-umano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonale DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Topo anti-umano PIVKA II anticorpo monoclonale PIVICA Cristallo chem 8040
A23 Topo anti-antigene carcinoembrionario CEA USA biologico C1300
A24 Topo Antigen anti-cancro CA125 CA125 USA biologico C0050-01D
A25 Topo anti-CA19-9 Cancer antigene CA19-9 USA biologico C0075-18
A26 Topo anti-Lewis x anticorpo monoclonale Lewis x Calbiochem 434631
bio Biotinilato BSA (controllo positivo) Bio Fatto in casa N / A

Tabella 1. Elenco delle lectine e anticorpi utilizzati in questo protocollo.

Nome del reattivo, s / attrezzature Azienda Numero di catalogo
Contatto micro-distributore non BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 micropiastra Pescatore 14-230-243
Foodsaver Foodsaver V3835
Ultrasottile nitrocellulosa Coate microarray scivola Gentel PATH
Presentazione Imprinter (opzionale) Il Gel Società WSP60-1
Shaker Pescatore 15-453-211
Centrifuga Eppendorf 5804 000.013
Far scorrere lavandino / Slide colorazione Dish with estraibile Rack Pescatore 08-812
Diapositiva camera di incubazione / vetrino da microscopio box Pescatore 03-448-5
Brij 35, 30 w / v% di soluzione in acqua Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Pescatore P337-100
Periodato di sodio (NAIO 4) Sigma 311448
L-glutammico γ-idrazide Sigma G-7257
Acetato di sodio anidro (CH 3 COONa) Sigma S2889
Albumina sierica bovina (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Tampone fosfato salino (PBS) (10X) Denville scientifico CP4390-48
Dylight 549 neutravidina coniugato Thermo 22837
Inibitori della proteasi Cocktail Tablets Roche 4693159001
ChromPure IgG umane, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure IgG umane, molecola intera Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure mouse IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure mouse IgG, frammento Fc Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure IgG di coniglio, molecola intera Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, molecola intera Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan LS Reloaded

Tabella 2. Listdi attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo.

Schema 1
Schema 1 Uno schema che mostra la lectina anticorpo microarray basata processo di biomarker discovery glicano 1 (Step 2 a 4): Bloccare la microarray anticorpo con il blocco (Glu-idrazide) e BSA, 2 (punto 5):.. Applicare campioni di siero e la cattura glicoproteine ​​specifiche con anticorpi specifici, 3 (Fase 6): si applicano lectina biotinilato (s), 4 (Fase 7): la sonda AAL biotinilato con Dylight 549 neutravidina etichettato per microarray imaging.

Figura 1
Figura 1. Immagini Microarray del profiling Sample glicosilazione Esperimento 1 di molteplici glicoproteine ​​sieriche nel campione di siero del paziente HCC mediante Chemicmicroarray anticorpo alleato bloccato con più di rilevazione lectina. Due vetrini microarray identici, (A) none chimicamente bloccato, o (B) chimicamente bloccata come descritto nel passaggio 2, sia passato attraverso tutte le fasi da 2 a 9 per la profilatura glicosilazione, così come scopo di confronto. (A) e (B) sono le immagini microarray scansione durante la fase 8 in una risoluzione di 10 micron. (C) lo zoom in immagine delle prime due righe della none chimicamente bloccato slitta microarray (A), (D) lo zoom in immagine delle prime due righe della slitta non chimicamente bloccato microarray (B)), (E) lo schema della disposizione degli anticorpi all'interno di ogni sottomatrice; (F) mappe di matrice: la posizione di ciascun anticorpo all'interno del subarray, ogni nome anticorpo rappresenta 3 punti; (G), campione di siero e la posizione lectina: un diagramma che mostra sottomatrice ciascun campione di siero e è stata applicata su lectina.

Figura 2
Figura 2. Immagini Microarray dellacampione esperimento 2 schermo per fucosylation alterato su specifiche glicoproteine ​​del siero come biomarker che discriminano cirrosi epatica e pazienti con carcinoma epatocellulare. Il saggio microarray è stata eseguita come descritto nella sezione Esempio Esperimento 2. (A) L'immagine intera diapositiva della diapositiva microarray dal punto 8; (B) lo schema della disposizione degli anticorpi all'interno di ogni sottomatrice; (C) mappe matrice: la posizione di ciascun anticorpo all'interno del subarray, ogni nome rappresenta l'anticorpo 3 punti; (D) uno zoom-in immagine di un subarray che sono state incubate con siero, (E) uno zoom-in immagine di un subarray che sono stati incubati con PBS controllo.

Figura 3
Figura 3. Risultati profiling glycan dell'esperimento campione 1. Ogni grafico a barre rappresentano lectina profilo legame (o profili glycan) di uno dei proteina testata 20. Trovati 22 lectine differenti sono stati utilizzati per analizzare i the glicano profilo di ciascuna proteina.

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Discussion

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1. Proteina bersaglio e selezione anticorpo di cattura

Prima del test microarray anticorpi, alcuni reagenti e materiali sono necessari per essere considerato e preparati. Per progettare un microarray per l'analisi degli anticorpi glicano o biomarker di screening glicano, un pannello di anticorpi specifici per i candidati della glicoproteina deve essere determinato secondo la letteratura o dai risultati precedenti. Questi anticorpi sono di solito acquistati da fornitori diversi, quali R & D Systems, ecc IgG sono preferiti anticorpi di cattura in quanto i nostri test precedenti hanno mostrato che alcuni IgM e IgE può perdere completamente le loro affinità di legame antigene dopo la modificazione chimica.

2. Progettazione e produzione di anticorpi microarray

Fabbricazione di microarray anticorpo è un passaggio facoltativo che ha bisogno di micro-distributore professionale e costoso, e ben addestrato il personale per il funzionamento. Tuttavia, personalizzata anticorpo microarray fabbricazionetura può essere facilmente effettuata da un fornitore di servizi come Serome Biosciences Inc. Per un risultato robusto, si consiglia di non-contatto micro-distributore, come ad esempio il volume sciFLEXARRAYER Scienion ultra bassa senza contatto micro-distributore che è stato utilizzato nella nostra produzione di anticorpi microarray. Ad alta capacità legante diapositive microarray, come PATH (Gentel Bio Inc. WI) o diapositive H (Shott, PA).

3. Selezionare e preparare glycan Binding Proteins (Sterline) per il profiling glicosilazione

GBPs che bersaglio diverso mono-o oligosaccaridi possono trovare nella letteratura e attraverso un motore di ricerca sviluppata dal laboratorio Haab 29 e mantenuti alla Translational Genomics Institute Per selezionare Sterline con elevata specificità ed affinità algli epitopi glycan mirate, selezionare il motivo (epitopo) dal menu a tendina e cliccare su "search". Lo specifico Sterline per questo motivo (epitopo) saranno elencati in base al loro valore logP da alta a bassa dell'ordine. Higher logP indica una forte affinità di legame e specificità al motivo glicano / epitopo. A causa della intrinseca non specifico problema di legame di lectina, questo metodo non è ancora ottimale quanto il saggio basato su anticorpi. Pertanto, si raccomanda vivamente di anticorpi anti-glycan vengono utilizzati, come ad esempio anti-Lewis x o anti-Lewis a sialil anticorpi, se sono disponibili. Utilizzo di più Sterline per la rilevazione è un'altra strategia per un controllo incrociato diversi profili obbligatori e di ottenere dati affidabili vincolanti.

4. Analisi dei dati

Poiché questo metodo viene usato per rilevare nativi proteine ​​del siero, complessi proteina-proteina può essere catturato e rilevato. Western blot e spettrometria di massa è dei buoni metodi per convalidare i dati di microarray. Intanto, Rivelazione dei livelli di proteine ​​utilizzando la stessa microarray è un altro metodo per apprendere i dettagli della alterazione glicosilazione della proteina, come se i cambiamenti erano dovuti alla variazione totale livello proteico o semplicemente che il livello di glicosilazione aumentato in ciascuna delle proteine.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto per l'epatite e la ricerca del virus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated Concanavalin A Vector Laboratories BK-1000 ConA
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin Vector Laboratories B-1305 SNA
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 LCA
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 RCA
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin Vector Laboratories B-1395 AAL
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin Vector Laboratories BK-3000 ECL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II Vector Laboratories BK-3000 GSL II
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 WGA
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-E
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin Vector Laboratories BK-2000 PHA-L
Biotinylated Peanut Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 PNA
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 PSA
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 DBA
Biotinylated Datura Stramonium Lectin Vector Laboratories BK-3000 DSL
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin Vector Laboratories BK-2000 SJA
Biotinylated Soybean Agglutinin Vector Laboratories BK-1000 SBA
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 STL
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories BK-2000 GSL I
Biotinylated Vicia Villosa Lectin Vector Laboratories BK-2000 VVL
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin Vector Laboratories BK-3000 LEL
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I Vector Laboratories BK-1000 UEA I
Biotinylated Jacalin Vector Laboratories BK-3000 JACALIN
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody Jackson Immuno Research 109-006-129 IgM
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody Jackson Immuno Research 709-006-149 AB1
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody Jackson Immuno Research 209-005-097 AB3
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody GeneTex GTX62924 A2M
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody Lee Biosiences CA1T-80A A1AT
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody Sigma-Aldrich SAB4200198 A1AT
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody NeoMarkers RB-367-A1 ACT
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody Fisher Scientific RB9213R7 ACT
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody GeneTex GTX101035 Transferrin
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody GeneTex GTX77130 Transferrin
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody Abcam ab7610 ApoJ
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody Abbott Laboratories 14H4-23 GP73
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC sc-101275 GP73
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody GenWay GWB-41C966 AFP
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody Fitzgerald 10-A05A AFP
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody Assaypro 60190-05011 Hemopexin
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody Santa Cruz Bio sc-65443 GPL3
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody Assaypro 20333-05011 Kininogen
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody Epitomic 1955-1 MMP21
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody R&D Systems MAB1180 CEACAM
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody R&D Systems MAB22441 DPPIV
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody Crystal chem 8040 PIVICA
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen US biological C1300 CEA
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen US biological C0050-01D CA125
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen US biological C0075-18 CA19-9
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody Calbiochem 434631 Lewis X
Biotinylated BSA (positive control) Home-made N/A Bio
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol.
Non contact microarrayer BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 microplate Fisher Scientific 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides Gentel PATH
Slide Imprinter (optional) The Gel Company WSP60-1
Shaker Fisher Scientific 15-453-211
Centrifuge Eppendorf 5804 000.013
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack Fisher Scientific 08-812
Slide incubation chamber/microscope slide box Fisher Scientific 03-448-5
Brij 35, 30 w/v% solution in water Acros Organics AC32958-0025
Tween-20 Fisher Scientific P337-100
Sodium Periodate (NaIO4) Sigma-Aldrich 311448
L-Glutamic acid γ-hydrazide Sigma-Aldrich G-7257
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) Sigma-Aldrich S2889
Bovine Serum Albumin (BSA) Lampire Biological Labs 7500804
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) Denville Scientific CP4390-48
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin Thermo Fisher Scientific, Inc. 22837
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Group 4693159001
ChromPure Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
ChromPure Human IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 009-000-003
ChromPure Mouse IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 015-000-003
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 015-000-008
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch 017-000-003
Microarray Scanner Tecan Group Ltd. LS Reloaded
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol.

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References

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Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi
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Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).More

Lu, C., Wonsidler, J. L., Li, J., Du, Y., Block, T., Haab, B., Chen, S. Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples. J. Vis. Exp. (63), e3791, doi:10.3791/3791 (2012).

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