Summary
En fremgangsmåde til spatio-temporal kontrol lille GTPase-aktivitet af lys, er beskrevet. Denne metode er baseret på rapamycin-induceret FKBP-FRB heterodimerisering og foto-bure systemer. Optimering af lys-bestråling muliggør spatio-tidsmæssigt styret aktivering af små GTPaser på det subcellulære niveau.
Abstract
Dynamisk regulering af Rho familie af små guanosin triphosphatases (GTPaser) med stor spatiotemporal præcision er nødvendig for forskellige cellulære funktioner og arrangementer 1, 2. Deres spatiotemporally dynamiske karakter er blevet afsløret ved hjælp af visualisering af deres aktivitet og lokalisering i realtid 3. For at opnå en dybere forståelse af deres roller i forskellige cellulære funktioner på det molekylære niveau, bør næste skridt være forstyrrelse af protein aktiviteter på en præcis subcellulære placering og timing.
For at nå dette mål, har vi udviklet en fremgangsmåde til lysinduceret, spatio-tidsmæssigt styret aktivering af små GTPaser ved at kombinere to teknikker: (1) rapamycin-induceret FKBP-FRB heterodimerisering og (2) en foto-bure metode rapamycin. Med anvendelse af rapamycin-medieret FKBP-FRB heterodimerisering, har vi udviklet en fremgangsmåde til hurtig inducerbare aktivering eller inaktivering af små GTPaser including Rac 4, Cdc42 4, RhoA 4 og Ras 5, hvor rapamycin inducerer translokation af FKBP-kondenserede GTPaser, eller deres aktivatorer, til plasmamembranen, hvor FRB er forankret. Til kobling med dette heterodimerisering system, har vi også udviklet en foto-bure system rapamycin analoger. Et foto-bur forbindelsen er et lille molekyle, hvis aktivitet er undertrykt med en fotospaltelig beskyttende gruppe kendt som en anbringelse i bur gruppe. At undertrykke heterodimerisering aktivitet fuldstændigt vi udviklet en bur rapamycin, som er bundet til et makromolekyle, således at den resulterende store komplekset ikke kan krydse plasmamembranen, hvilket fører til praktisk talt ingen baggrund aktivitet som en kemisk dimerizer i celler 6. Figur 1 illustrerer et skema i vores system. Med kombinationen af disse to systemer, lokalt har vi ansat en Rac aktivator til plasmamembranen på en tidsskala sekunder og opnåede lys-induceret Rac aktivering på det subcellulære Level 6.
Protocol
1. Transfektion af plasmid DNA
- Tilsættes plasmid-DNA'er, 0,5 ug membran-bundne FRB (herefter benævnt LDR) og 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cellelymfom invasion og metastase-inducerende protein 1: Rac aktivator) mærket med fluorescerende protein til 37,5 gl dH 2 O. Tilsæt 1 gl FuGENE HD.
- Vortex, og der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. I mellemtiden, skal du fortsætte til trin 1,3-1,8.
- Vaske hver brønd i en 8-brønds kammer med 50 ul poly-D-lysin.
- Vask i midten af hver brønd med dH 2 O.
- Trypsinisér 80-85% konfluente NIH-3T3-celler og fortyndes til 10 ml dyrkningsmedium (DMEM med 10% FBS).
- Fjern 375 gl suspension og centrifuger ved 1750 rpm i 3 minutter.
- Aspirer medierne, og pas på ikke at forstyrre pellet.
- Tilsættes 750 ul DMEM w / 10% FBS og resuspender.
- Tilføj cellesuspension til dH 2 O / DNA / FuGENE HD opløsning og bland forsigtigt.
- Tilsæt 250ul celler / DNA suspension til hver brønd (fylder op til 3 brønde).
- Inkuber de transficerede celler ved 37 ° C og 5% CO2 i 15-18 timer.
2. Fremstillinq af CRb-A Solution
- Syntetisere bur rapamycin-biotin addukt (CRB). Se "Syntetisk ordning CRb" for detaljer. Kort fortalt bure og biotin dele fremstillet separat. Den bure delen derefter konjugeret til rapamycin (LC lab), produktet derefter koblet til biotin-delen ved hjælp af et klik reaktion 7 til opnåelse CRb.
- Forbered en 1 pM stamopløsning af CRb i DMSO.
- Opløs 1 mg avidin i 250 pi PBS i en 0,5 ml Eppendorf-rør.
- Tilsættes 1 ml af CRb stamopløsning til opløst avidin. Blandes ved at vende flere gange.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter til opnåelse CRb-avidin-konjugat (CRb-A)-Opløsning.
- Udelukker ubundne små molekyler og oprense CRb-A under anvendelse af en størrelses-eksklusion søjle.
3. Mikroskopi og lys belysning på subcelleniveauet
- Serum sulte transficerede celler i DMEM uden FBS i 12 timer.
- Forsigtigt aspireres medierne fra cellerne, og der tilsættes 250 pi af den forbehandlede 400 nM CRb-A-opløsning (fra trin 2.6).
- At visualisere protein-dynamik i levende celler ved subcellulær opløsning før og efter lysbehandling, blev roterende skive mikroskopi anvendt (fig. 2a). UV-belysning blev opnået ved kobling af optik for UV LED-lys (365 nm) med epi-fluorescens lys (figur 2b).
- MetaMorph software blev anvendt til at indfange fluorescensbilleder af transficerede celler for hver 15 sekunder.
- Definerer koordinaterne og størrelsen af en belysning plet ved hjælp af en glasplade overtrukket med fluorescerende farvestoffer exciteres af UV-lys. Størrelsen kandifferentieres ved anvendelse objektiv med forskellige forstørrelser, og ved at vælge optiske fibre med forskellige kerne størrelse.
- Efter bestemmelse af baggrundsniveauerne af membranen ruffling, bestråle UV-lys ved periferien af celler. De følgende to trin er at sammenligne før lokaliserede virkninger.
- Globalt bestråle cellerne med 365 nm lys fra en kviksølvlampe.
- Opløs Uncaged, således original rapamycin i DMSO og derefter i PBS (400 nM endelig), og tilsæt løsning på billedbehandling kammer til at fremkalde globale konsekvenser.
4. Repræsentative resultater
Et eksempel på repræsentative resultater er vist i figur 3. UV-lys bestråling ved et lille område nær et cellulært kant hurtigt induceres dannelse af lokaliseret flæser kun i og nær det bestrålede område. For at bekræfte, at dette rent faktisk var lokal aktivitet, vi så globalt bestråles celler med UV-eller tilføjes rapamycin til bulk-medierne, både af which induceret global flæse dannelse hele membranen. For en kvantitativ analyse, divideret vi målceller i fire kvadranter, og tælles hyppigheden af flæse dannelse i hver kvadrant på lokalt såvel som følge af global stimulering under forskellige betingelser, herunder kontrol (Figur 4). Det er kun denne kombination af UV-bestråling, CRb-A, og passende FKBP-FRB-konstruktioner, der inducerer lokal ruffling.
Figur 1. Skematisk af rumligt begrænset protein dimerisering under anvendelse bur rapamycin-avidin-konjugat (CRb-A) og UV-lys. UV-bestråling spalter linkeren mellem rapamycin og biotin, hvilket resulterer i frigivelse af kemisk dimerizer (HE-rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl)-rapamycin) og biprodukt. Den frigivne dimerizer derefter diffunderer ind i cellerne og inducerer dimerisation mellem FKBP-POI (protein af interesse) og plasma membRANE forankret FRB kun i nærheden af det bestrålede område (blå cirkel). Uden UV-bestråling, gør FKBP og FRB ikke associeret (Røde Kors), og dermed producerer ingen effekt. (Copyright @ ACS2011) 6
Figur 2. Billede af tilpassede konfokal fluorescensmikroskop. (A) set forfra af konfokal mikroskopi (inverteret Axiovert 200, Zeiss). (B) et nærbillede set ovenfra af en koblingsenhed til EPI fluorescens og UV-belysning.
Figur 3. Rumligt begrænset flæse dannelse i en transficeret NIH3T3 celler induceret ved lokal UV-bestråling. Konfokal fluorescens billeder af en NIH3T3 fibroblastcellelinie, der er transficeret med YFP-mærket FKBP-Tiam1 (Rac aktivator) og LDR (membran-forankret FRB) undergik bestråling i et indelukket område nær kanten med LED lys ved 365 nm i 15 sekunder begynder ved 210 sekunder i nærvær af CRb-A-konjugat i bulk-medier. Denne behandling blev efterfulgt af global belysning med kviksølvlampe i 1 sek ved 1063 sek og global tilsætning af rapamycin endelige 400 nM på 1560 sek. Cellen viste næsten ingen ruffling aktivitet i starten (a), men viste rumligt begrænset ruffling efter lokaliseret belysning (gul cirkel) (b). Cellen viste globale flæse dannelse efter global belysning og tilsætning af rapamycin (CD), hvilket indikerer, at den lokale flæse formationen skyldtes rumligt begrænset aktivering af Rac. Målestokken: 10 um. (Copyright @ ACS2011) 6
Figur 4. Hyppigheden af flæse dannelse i kvadranter af transficerede NIH3T3-celler. Lokal UV-bestråling med CRb-A og efterfølgende samlet UV-bestråling blev udført på 13-celler. CRb-A CRb-A uden UV-bestråling, eller lokalt UV-bestråling med eller uden avidin i bulk medier. Vi opsamlede data fra cellerne med lav baggrund flæse dannelse, men som havde kapaciteten af rapamycin-induceret flæse formation, som vi har undersøgt efter hvert eksperiment ved at bekræfte global flæse dannelse som et resultat af tilsætning af rapamycin (endelige 400 nM). Disse resultater viste, at CRb-A og lokale UV-bestråling er nødvendige for lokal flæse dannelse i cellerne. (Copyright @ ACS2011) 6
Forkortelser:
FKBP: FK506-bindende protein
FRB: FKBP-rapamycin-bindende protein
Tiam1: T-cellelymfom invasion og metastase-inducerende protein 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminale 11 aminosyrer af Lyn-kinase)
HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyethyl)-rapamycin
CRb: bur rapamycin med biotindelen
CRb-A: CRb konjugeret til avidin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrev vi en teknik, der anvender en hidtil ukendt bur forbindelse sammen med FKBP-FRB heterodimerisering systemet for at manipulere Rho GTPase-aktivitet ved en præcis subcellulære lokalisering på en tidsskala sekunder.
Der er tre begrænsninger af den foreliggende fremgangsmåde. For det første fordi metoden er baseret på at forhindre eller tillade diffusion af dimerizer over plasmamembranen, målet cellulære placering skal være plasmamembranen eller dens nærhed. Yderligere optimering af den kemiske struktur af CRb tillade forbindelsen at trænge ind i celler uden at inducere dimerisering indtil lysbestråling. Med sådan en dimerizer, kunne vi i teorien manipulere aktivitet signalmolekyler overalt inde i cellerne. For det andet kan molekylær diffusion af kemiske dimerizers og FKBP-FRB dimerisering komplekse eller aktiverede endogene signaleringsmolekyler i høj grad påvirke præcis indespærring af de tilsigtede virkninger. Denne effekt er særligt udtaltpå senere tidspunkter og er afhængig af parametre knyttet til UV-bestråling (f.eks strålebredde, energi og stråle (kontinuerlig vs pulserende)) og diffusionskoefficienter for de involverede forbindelser. Yderligere empirisk optimering af disse parametre giver strengere indespærring af signal aktiviteter. For det tredje en UV-lys udviser ikke-trivielle fototoksicitet til celler. En let måde at forbedre dette problem er at anvende en længere bølgelængde, såsom 405 nm uncage nitrobenzyl bure grupper. To-foton belysning til uncaging tillader belysning ved en endnu længere bølgelængde og i meget lokaliseret område af celler. For nylig har andre forskere rapporteret en elegant fremgangsmåde til at aktivere Rac på subcellulære lokalisering ved hjælp af lys-sensitive planteproteiner 8-11. Hidtil er dets anvendelse begrænset til kun nogle få proteiner. Sammenlignet med deres strategier vores nuværende teknik er mere let tilpasses til at udvide antallet af målproteiner uden omfattende og TImig-forbrugende re-engineering. Vi og andre har allerede udviklet en række dimerisering prober, der kan manipulere aktiviteten af forskellige signaleringsmolekyler på plasmamembranen 5, 6, 12-14. Spatiotemporally dynamiske cellulære begivenheder er nu direkte testbar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH finansiering af forskning (DK090868 og GM092930 til TI). Der er en verserende patent på et indhegnet rapamycin analog.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
