Spatio-temporelle de manipulation de l'activité GTPase Petit au niveau subcellulaire et sur des échelles de secondes dans les cellules vivantes

Summary

Procédé pour spatio-temporel de commande de l'activité GTPase de petite par la lumière est décrite. Cette méthode est basée sur la rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et photo-cages systèmes. Optimisation de la lumière-l'irradiation permet l'activation spatio-temporellement contrôlée de petites GTPases au niveau subcellulaire.

Abstract

Régulation dynamique de la famille Rho guanosine triphosphatases petites GTPases) avec une précision spatio-temporelle est grande essentiels pour diverses fonctions cellulaires et des événements ^{1, 2.} Leur nature spatio-temporelle dynamique a été révélé par la visualisation de leur activité et la localisation en ³ temps réel. Afin d'obtenir une meilleure compréhension de leurs rôles dans diverses fonctions cellulaires au niveau moléculaire, la prochaine étape devrait être la perturbation des activités de protéines à un endroit précis subcellulaire et le calendrier.

Pour atteindre cet objectif, nous avons développé une méthode pour induite par la lumière, spatio-temporellement activation contrôlée de petites GTPases en combinant deux techniques: (1) rapamycine-FKBP-FRB induite par hétérodimérisation et (2) une méthode de photo-mise en cage de la rapamycine. Avec l'utilisation de la rapamycine-FKBP-FRB médiation hétérodimérisation, nous avons développé une méthode pour rapidement inductible activation ou l'inactivation des petites GTPases including Rac ^4, Cdc42 ^{4, 4} RhoA et Ras ^5, dans lequel la rapamycine induit la translocation de la FKBP-condensés, ou leurs GTPases activateurs, à la membrane plasmique, où FRB est ancré. Pour le couplage avec ce système hétérodimérisation, nous avons également développé un système de photo-mise en cage de la rapamycine analogues. Un composé photo-cage est une petite molécule dont l'activité est supprimée avec un groupe photoclivable protéger connu sous le nom d'un groupe de mise en cage. Pour supprimer l'activité hétérodimérisation complètement, nous avons conçu une rapamycine en cage qui est attaché à une macromolécule de telle sorte que le complexe résultant grande ne peut pas traverser la membrane plasmique, ce qui conduit à pratiquement aucune activité de fond comme une dimérisation chimique à l'intérieur des cellules ^6. Figure 1 illustre un schéma de notre système. Avec la combinaison de ces deux systèmes, nous recrutés localement un activateur de Rac à la membrane plasmique sur une échelle de temps de quelques secondes et atteint induite par la lumière d'activation Rac à la subcellulaire level ^6.

Protocol

1. La transfection de l'ADN plasmidique

1. Ajouter ADN plasmidiques, 0,5 ug membrane captif FRB (ci-après dénommé LDR) et 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell invasion lymphome et les métastases induisant la protéine 1: Rac activateur) marqué avec la protéine fluorescente à 37,5 pi dH ₂ O. Ajouter 1 ul FuGENE HD.
2. Vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Pendant ce temps, procéder aux étapes 1,3-1,8.
3. Laver chaque puits d'une chambre de 8 puits avec 50 pl de poly-D-Lysine.
4. Laver le centre de chaque puits avec dH ₂ O.
5. Trypsiniser 80-85% confluentes cellules NIH-3T3 et diluer à 10 ml du milieu de culture (DMEM avec 10% de FBS).
6. Retirer 375 ul de la suspension et centrifuger à 1750 rpm pendant 3 minutes.
7. Aspirer les médias, en faisant attention de ne pas perturber le culot.
8. Ajouter 750 ul de FBS DMEM w / 10% et remettre en suspension.
9. Ajouter suspension cellulaire à dH ₂ O / ADN / FuGENE HD solution et mélanger doucement.
10. Ajouter 250ul de cellules / ADN de suspension dans chaque puits (remplira jusqu'à 3 puits).
11. Incuber les cellules transfectées à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 15-18 h.

2. Préparation de la CRB-Une Solution

1. Synthétiser en cage rapamycine-biotine adduit (CRB). Voir «schéma de synthèse du CRB" pour plus de détails. Brièvement, des fragments de cages et de la biotine sont préparés séparément. Le fragment cage est ensuite conjugué à la rapamycine (CL laboratoire), le produit ensuite couplé à la fraction biotine par un moyen de réaction ⁷ clic pour donner CRB.
2. Préparer une solution à 1 uM de stock du CRB dans le DMSO.
3. Dissoudre 1 mg d'avidine dans 250 ul de PBS dans un tube de 0,5 ml Eppendorf.
4. Ajouter 1 ml de solution stock de CEM pour l'avidine dissous. Mélanger en retournant plusieurs fois.
5. Incuber à température ambiante pendant 15 min pour obtenir CRB-avidine conjugué (CRB-A) Solution.
6. Exclure les petites molécules non liées et purifier CRB-A. En utilisant une colonne d'exclusion de taille

3. Microscopie et un éclairage en lumière au niveau subcellulaire

1. Sérum affamer les cellules transfectées dans du DMEM sans SVF pendant 12 heures.
2. Aspirer doucement les médias hors des cellules et ajouter 250 microlitres de la préparation 400 nM CRB-Une solution (de l'étape 2.6).
3. Pour visualiser la dynamique des protéines dans les cellules vivantes à la résolution subcellulaire avant et après traitement par la lumière, la microscopie disque de rotation a été utilisé (Figure 2a). Illumination UV a été réalisée par couplage optique pour la lumière LED UV (365 nm) avec l'épi-fluorescence en lumière (Figure 2b).
4. MetaMorph logiciel a été utilisé pour capturer des images de fluorescence des cellules transfectées toutes les 15 secondes.
5. Définir les coordonnées et la taille d'un point d'illumination en utilisant une plaque de verre revêtue avec des colorants fluorescents excités par la lumière UV. La taille peutfaire varier en appliquant lentille d'objectif avec des grossissements différents et en sélectionnant des fibres optiques avec la taille de base différente.
6. Après la détermination des niveaux de fond de fronçage membrane, la lumière UV irradient à la périphérie de cellules. Les deux étapes suivantes sont à contraster précédant effets localisés.
7. Globalement irradier des cellules avec de la lumière à 365 nm fournie par une lampe à mercure.
8. Dissoudre Uncaged, ainsi rapamycine origine dans le DMSO, puis dans du PBS (400 nM final), et ajouter la solution à la chambre de l'imagerie d'induire des effets globaux.

4. Les résultats représentatifs

Un exemple de résultats représentatifs est illustré à la figure 3. Irradiation de lumière UV à une petite région près d'un bord cellulaire induit rapidement la formation de volants localisée que dans et à proximité de la zone irradiée. Pour confirmer qu'il s'agissait effectivement d'une activité locale, nous avons alors le monde irradié des cellules avec des UV, ou ajouté rapamycine aux médias en vrac, à la fois de la WHIch induit la formation tout au long de volant mondiale de la membrane. Pour une analyse quantitative, nous avons divisé les cellules cibles en quatre quadrants, et a compté la fréquence de formation volants dans chaque quadrant sur locale ainsi que suite à une stimulation globale dans diverses conditions, y compris les contrôles (Figure 4). Ce n'est que cette combinaison de l'irradiation UV, CRB-A, et appropriées FKBP-FRB constructions qui induit fronçage locale.

Figure 1. Schéma de la dimérisation des protéines dans l'espace confiné à l'aide en cage rapamycine-avidine conjugué (CRB-A) et de la lumière UV. Irradiation UV clive la liaison entre la rapamycine et de la biotine, entraînant la libération de produits chimiques de dimérisation (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroxyethyl) rapamycine) et son sous-produit. La dimérisation publié diffuse ensuite dans les cellules et induit la dimérisation entre FKBP-POI (protéine d'intérêt) et le plasma membrane ancré FRB que dans la proximité de la région irradiée (cercle bleu). Sans l'irradiation UV, FKBP et FRB n'associent pas (croix rouge), donc ne produisant aucun effet. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figure 2. Image du microscope personnalisé confocale de fluorescence. (A) Vue de face du microscope confocal (inversé Axiovert 200, Zeiss). (B) Close-up, vue de dessus d'une unité de couplage pour le PEV de fluorescence et d'illumination UV.

Figure 3. Formation volants spatialement confinée dans un transfectée NIH3T3 cellulaire induite par une irradiation UV localisée. Confocale de fluorescence images d'un cellulaire de fibroblastes NIH3T3 qui est transfectée avec YFP-étiqueté FKBP-Tiam1 (Rac activateur) et LDR (membrane ancrée FRB) a subi une irradiation dans un espace confiné près de son bord avec LED lumière à 365 nm pour 15 secondes à partir de 210 sec en présence d'CRb-Conjugué dans les supports en vrac. Ce traitement a été suivi par l'illumination globale avec lampe au mercure pour 1 sec à 1063 sec plus et globale de la rapamycine finales 400 nM à 1560 sec. La cellule a montré presque aucune activité ébouriffant au début (a), mais a montré dans l'espace confiné ébouriffant après l'illumination localisée (cercle jaune) (b). La cellule a montré la formation de volant mondiale après l'illumination globale et l'ajout de la rapamycine (cd), indiquant que la formation locale a été volants provoquée par l'activation dans l'espace confiné de Rac. La barre d'échelle: 10 um. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figure 4. Fréquence de la formation volants dans les quadrants de cellules NIH3T3 transfectées. Irradiation UV locale CRB-A et après irradiation UV mondiale ont été réalisées sur 13 cellules. CRB-A CRB-A sans irradiation UV, ou l'irradiation UV locale avec ou sans l'avidine dans les médias en vrac. Nous avons recueilli des données à partir de cellules avec la formation de fond volant bas, mais qui a la capacité de la rapamycine induit la formation de volant, ce qui nous avons vérifié après chaque expérience en confirmant la formation volants mondiale en tant que résultat de l'addition de la rapamycine (finales 400 nM). Ces résultats ont montré que CRB-A et l'irradiation UV locale sont nécessaires pour la formation locale volant dans les cellules. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Abréviations:

FKBP: FK506-binding protein
FRB: FKBP-rapamycine-binding protein
Tiam1: T-cell invasion lymphome et les métastases induisant protein 1 (Rac FEM)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: N-terminales 11 acides aminés de Lyn kinase)
HE-Rapa: C40-O - (2-hydroxyéthyl) rapamycine
CRB: la rapamycine en cage avec fragment de biotine
CRB-A: CRB conjugué à l'avidine

Discussion

Nous avons décrit une technique qui emploie un roman composé en cage avec le système hétérodimérisation FKBP-FRB afin de manipuler Rho GTPase activité à un endroit précis sur une échelle subcellulaire de temps en secondes.

Il ya trois limites de l'approche actuelle. Tout d'abord, parce que la méthode est basée sur la prévention ou permettant la diffusion des dimérisation travers la membrane plasmique, l'emplacement cible cellulaire doit être la membrane plasmique ou dans ses environs. En outre l'optimisation de la structure chimique du CRB peut permettre au composé de pénétrer dans les cellules, sans induire la dimérisation jusqu'à irradiation de lumière. Avec une telle dimérisation, nous pourrions en théorie manipuler l'activité de molécules de signalisation partout l'intérieur des cellules. Deuxièmement, la diffusion moléculaire de dimerizers chimiques, complexes dimérisation FKBP-FRB, ou activées endogènes des molécules de signalisation peuvent grandement affecter confinement précise des effets escomptés. Cet effet est particulièrement prononcéau plus tard points dans le temps et dépend de paramètres associés à une irradiation UV (tels que la largeur du faisceau, l'énergie, et le mode de faisceau (vs continue pulsée)) et les coefficients de diffusion des composés impliqués. En outre l'optimisation empirique de ces paramètres permet de confinement plus strict des activités de signal. Troisièmement, une lumière UV présente non-trivial phototoxicité aux cellules. Un moyen facile de remédier à ce problème consiste à utiliser une longueur d'onde tels que 405 nm à uncage groupes de cages nitrobenzyle. Deux photons d'illumination pour uncaging permet l'illumination à une longueur d'onde encore plus longue ainsi qu'au région très localisée de cellules. Récemment, des chercheurs d'autres ont rapporté une approche élégante pour activer Rac à une localisation subcellulaire des protéines végétales en utilisant sensibles à la lumière ^8-11. Jusqu'à présent, son application est limitée à seulement quelques protéines. Comparativement à leurs stratégies, notre technique actuelle est plus facilement adaptable à augmenter le nombre de protéines cibles, sans étendue et timoi-consommation re-engineering. Nous et d'autres ont déjà mis au point une variété de sondes de dimérisation qui peuvent manipuler l'activité de diverses molécules de signalisation à la membrane plasmique ^{5, 6, 12-14.} Spatio-temporelle des événements cellulaires dynamiques sont désormais directement vérifiable.