Summary
Drosophila melanogaster ist eine genetisch und auf der Verhaltensebene praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet wurde, um die molekularen und zellulären Grundlagen von vielen wichtigen biologischen Prozessen seit über einem Jahrhundert ein zu verstehen. Drosophila wurde auch genutzt, um Einblicke in die genetischen Grundlagen der Fliege Verhalten zu gewinnen.
Abstract
Drosophila melanogaster, der Fruchtfliege, wurde genutzt, um molekulare Mechanismen von einer breiten Palette von menschlichen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen und verschiedenen neurologischen Erkrankungen ein zu studieren. Wir haben einfache und robuste Verhaltensstörungen Assays zur Bestimmung Larven Fortbewegung, erwachsenen Steigfähigkeit (RING-Assay) und Werbeverhalten von Drosophila optimiert. Diese Verhaltens-Assays sind allgemein anwendbar für die Untersuchung der Rolle von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf Fly Verhalten. Larven kriechen Fähigkeit zuverlässig für die Bestimmung frühzeitig Veränderungen in den kriechenden Fähigkeiten von Drosophila-Larven und auch für die Prüfung Wirkung von Medikamenten oder Erkrankungen des Menschen Genen (in transgenen Fliegen) auf ihrer Fortbewegung verwendet werden. Die Larven kriechen Assay wird immer anwendbar, wenn die Expression oder Abschaffung eines Gens verursacht Letalität im Puppenstadium oder adulte Stadien, da diese Fliegen nicht bis ins Erwachsenenalter überleben kann, wo sie sonst könnte beurteilt werden. Dieses BASICssay kann auch in Verbindung mit hellem Licht oder Stress zusätzliche Verhaltensreaktionen in Drosophila-Larven untersucht werden. Balzverhalten wurde weithin verwendet, um genetische Basis der sexuellen Verhaltens zu untersuchen, und kann auch verwendet werden, um die Aktivität und die Koordination zu untersuchen, ebenso wie Lernen und Gedächtnis werden. Drosophila Balzverhalten der Austausch von verschiedenen Sinnesreizen einschließlich visueller, auditiver und chemosensorischen Signale zwischen Männern und Frauen, die zu einer komplexen Reihe von gut charakterisierten Motor Verhaltensweisen die ihren Höhepunkt in erfolgreiche Kopulation führen. Traditionelle Erwachsenen klettern Assays (negative Geotaxis) sind langwierig, arbeitsintensiv und zeitaufwendig, mit signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Studien 2-4. Die schnelle iterative negativen Geotaxis (RING)-Assay 5 hat viele Vorteile gegenüber größerem Umfang eingesetzten Protokolle und bietet eine reproduzierbare, sensibel und mit hohem Durchsatz Ansatz zur Erwachsenen-und Bewegungsapparat negativ Geotaxis b quantifizierenehaviors. In der RING-Assay kann mehrere Genotypen oder medikamentöse Behandlungen getestet gleichzeitig unter Verwendung der großen Anzahl von Tieren, mit der High-Throughput-Ansatz macht es zugänglicher für Screening-Experimenten.
Protocol
A. Larven Crawling-Test
1. Larven Sammlung
- Richten Sie eine 8 Unzen Flasche fliegt (10-15 + 10-15 Männchen Weibchen).
- Lassen Fliegen legen ihre Eier für 24 Stunden, dann klare Flasche fliegt. (Übertragen Sie die Erwachsenen in eine neue Flasche und wiederholen wie nötig).
- Inkubieren Flasche für 3-4 Tage, oder bis zum dritten Larvenstadium sichtbar sind.
- In 50 bis 100 ml 20% Saccharose in die Flasche mit Larven und lassen Sie sich für 20 Minuten. Die Larven werden auf der Oberfläche schwimmen.
- Sammle Larven mit einem 25 ml serologische Pipette mit der Spitze abgeschnitten, und in einen Gitterkorb.
- Waschen Sie Larven im Gitterkorb zweimal mit deionisiertem H 2 O. Die Larven sind jetzt bereit für die Experimente.
2. Um Larven mit Medikamenten behandeln
- Verwenden Sie eine Bürste, um die gewünschte Anzahl der Larven zu einem 5-ml-Becher, die eine Lösung von 5% Saccharose + Droge transportieren.
- Lassen Larven ernähren sich mindestens 15 Minuten.
- Gießen Medikament behandelten Larven in einen Gitterkorb und spülen. Sie sind jetzt einsatzbereit.
3. Bewegungsapparat Assay (Messung insgesamt zurückgelegte Entfernung oder Körperwand Kontraktionen)
- Mit einer Bürste, einzelne Larve bis ein Transport:
- 15 cm Petrischale mit 2% Agarose (zuvor gegossen und ausgehärtet) über Millimeterpapier mit einer 0,2 cm 2 Rasters.
- Count Anzahl der Gitterlinien in 1 Minute überschritten.
- Nun von einem Glas Dissektion Schale mit einer verdünnten Lösung Hefepaste.
- Count Peristaltik Kontraktionen (von vorne nach hinten voller Bewegung = 1 Kontraktion) in einer Minute unter Beobachtung unter einem Dissektionsmikroskop.
- 15 cm Petrischale mit 2% Agarose (zuvor gegossen und ausgehärtet) über Millimeterpapier mit einer 0,2 cm 2 Rasters.
- Wiederholen, bis die gewünschte Anzahl von Larven gezählt worden.
B. Schnelle iterative negativen Geotaxis (RING) Protokoll
Dieser Test wurde ursprünglich debeschrieben durch Gargano et al 5.
- Sammeln frisch geschlüpften erwachsenen männlichen Fliegen unter leichtem CO 2-Betäubung und in einen Standard-Fläschchen mit Nahrungsmitteln (+ Arzneimittel oder Lebensmittel).
- Halten Sie Fliegen bei Raumtemperatur (auf der Tischplatte. ~ 22 ° C) für 2-3 Tage auf die zur Verwertung von CO 2 (und Akkumulation von Steady-State-Plasmaspiegel gegebenenfalls) zu ermöglichen.
- Übertragen Sie etwa 25 Fliegen ohne Betäubung zu Polystyrol vorbereiteten Fläschchen.
- Montieren Fläschchen mit Fliegen in den RING Apparatur (Abbildung 1).
- Erlauben Sie fliegt in die Umwelt, ungestört, für 15-20 Minuten akklimatisieren.
- Während dieser Zeit Platz Digitalkamera ~ 1 m vor dem Gerät (auf einer Plattform, wenn notwendig, das Zentrum der Linse auf halber Höhe des Vials ausrichten), Fokus und Zoom der Kamera auf das Gerät, und einen Timer einstellen, um 3,0 Sekunden.
- Entfernen Sie vorsichtig von der RING-Apparat zu halten mit der linken Hand, um nicht zu disturb die Fliegen, und halten Sie den Timer mit der rechten Hand.
- Scharf tippen Sie auf das Gerät nach unten auf der Oberfläche der Bank dreimal, sicherzustellen, dass das Leitungswasser hart genug, um knock down all die Fliegen auf den Boden der Fläschchen ist.
- Gleichzeitig mit Fertigstellung des dritten Hahn, starten Sie die 3 Sekunden Countdown-Timer.
- Bei 3 Sekunden ein Bild aufnehmen.
- Setzen Sie den Timer für 1 Minute und starten. Während dieser Zeit setzen Sie die Kamera und Fokus auf das Gerät, und stellen Sie einen anderen Kanal des Timers für drei Sekunden.
- Nach 1 Minute, wiederholen Sie die Schritte 1,7-1,10
- Nach insgesamt 5-6 Versuche, laden Sie Bilder auf einen Computer und nutzen Sie Ihre Lieblings-Bildbetrachter zu öffnen, zu punkten und die durchschnittliche Höhe kletterten für jedes Fläschchen.
- Statistische Analysen auf Ihrer verschiedenen Gruppen einen Vergleich der mittleren Höhe geklettert.
C. Balz und Paarung Assay
- Als erstes am Morgen, klar, gut-produzierenden Flaschen FLIes verwendet werden soll.
- Im Laufe des Tages (alle 3-4 Stunden), sammeln neu entstandenen sexuell naive Männchen und Weibchen:
- Platzieren Sie Männchen einzeln in Fläschchen oder Röhrchen mit Medium.
- Platzieren Sie 5-6 Weibchen zusammen pro Fläschchen / Tube.
- Isolieren Sie gesammelt Fliegen bei 25 ° C unter 12 Stunden Licht / Dunkel für 5 Tage.
- Übertragen Sie eine Frau in die Kammer eines Gegenrad.
- Übertragen Sie ein Männchen in die Kammer eines Gegenrad.
- Beachten Paar unter einem Dissektionsmikroskop für die folgenden Verhaltensweisen:
- Orientierung (die männlichen orientiert sich an den weiblichen)
- Tapping (klopft das Männchen das Weibchen)
- Flügel Lied (das männliche erstreckt und schwingt einen Flügel)
- Lecken (die männlichen leckt die weiblichen Genitalien)
- Curling (das Männchen seinen Bauch rollt unter sich)
- Kopulation Versuch (Curling Tätigkeit beim Versuch, den weiblichen montieren)
- Beachten Sie für 10 Minuten oder bis zum erfolgreichen Kopulation, in Anbetracht der Zeit, zu der jedes Verhalten auftritt (Latenzzeit), (die gesamte Zeit in Balzverhalten bis Kopulation (die Brautwerbung Index zu berechnen), sowie die Anzahl der Paare, die erfolgreich ein bestimmtes Verhalten auszuführen engagiert Frequenz). 100% der Wildtyp-Paare werden in der Regel innerhalb von 5 Minuten zu paaren.
- Berechnen Balz ein Index (CI) durch Division der Zeitaufwand bei der Balz durch die gesamte Zeit bis Kopulation unterteilt. Für Wildtyp-Paaren dies in der Regel im Bereich zwischen 0,6 bis 0,8.
D. Repräsentative Ergebnisse
Crawling-Assay
Normale Wildtyp-Larve wird wandern ~ 3 cm / min und Ausstellungsflächen ~ 40-50 Körperwand Kontraktionen in einer Minute. Wir haben kürzlich eine Drosophila-Modell FUS / TLS-bezogenen amyotrophe Lateralsklerose, die Larven kriechen Defekt, verminderte Lebensdauer und Erwachsenen klettern Beeinträchtigung 6 zeigt entwickelt. Wir gezielte Expression of Wildtyp und mutierte Formen von FUS / TLS zu den Motoneuronen (OK-371-GAL4-Treiber) und führte eine Larven-Crawling-Assay. Wie unten dargestellt, Wildtyp-Larven bis zu 12 cm zu kriechen, während die Expression von Wildtyp-FUS verringerte die Larven kriechen Fähigkeit, etwa 6 cm. Tiere Ausdruck des ALS-Mutation R521C in FUS / TLS zeigen eine sehr starke Beeinträchtigung in ihrem kriechenden Bewegung (Abbildung 1), Crawling nur etwa 1 cm / min.
Negativ Geotaxis RING-Assay
Junge Wildtyp-erwachsenen Fliegen sollten einen mittleren Steighöhe von ~ 4-5 cm in einem 3-Sekunden-Zeit (die Zeit zwischen 3 Sekunden und kann eingestellt werden, um verschiedene Stämme oder Aktivität aufnehmen, um eine gegebene durchschnittliche Höhe für eine gegebene Definition Dehnung / Behandlung). Fliegen, die am Boden bleiben, wird ein Wert von 0 zugewiesen. Es ist nicht ratsam, mehr als 25 Fliegen pro Fläschchen zu verwenden, da wird es dann schwierig, die Lage jeder einzelnen Fliege an Höhe messen zu bestimmen. No Desensibilisierung hat bei eingerichtet, um die 6 aufeinander folgenden Versuchen Abstand von 1 Minute auseinander, dass wir beschäftigt beobachtet. Es ist wichtig, nicht die Prüfung Polystyrol Fläschchen in diesem Assay nach den ersten Sätzen von Daten verwertet werden gesammelt, weil neue Fliegen in Glasfläschchen verwendet nicht im gleichen Maße steigt, wie in frische Röhrchen.
Abbildung 1. Setup für das RING-Assay. Die Digitalkamera wird ca. 1 m vor dem Gerät mit Fliegen in den Polystyrol-Röhrchen platziert; konzentrieren und zoomen Sie die Kamera auf das Gerät, und einen Timer einstellen, um 3,0 Sekunden.
2. Repräsentative Daten aus der Larven Crawling-Assay unter Verwendung Fliegen ektopisch UAS-FUS WT und UAS-FUS R521C unter der Kontrolle einer motoneuronalen Treiber (OK371-Gal4).
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Discussion
Drosophila Verhalten wird streng von genetischen und umweltbedingten Faktoren reguliert. Wir und andere haben vorher beschriebenen Assays hier verwendet, um Daten zu sammeln, um Gene in Bezug auf Verhalten und zu menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Drosophila 19.05 modelliert fliegen zu untersuchen. Für das Crawling-Assay ist eine sorgfältige Auswahl der 3 rd Larven ein entscheidender Schritt. Wenn die Behandlung mit einem Arzneimittel, dauert es 10-15 Minuten (oder mehr, abhängig von der Art und Beschaffenheit des Arzneimittels), um eine maximale Wirkung zu erzielen, wenn sie eine gute Löslichkeit aufweist. Deshalb füttern wir routinemäßig fliegt das Medikament für 15 Minuten, und dann warten weitere 15 Minuten vor dem Test. Es ist jedoch wichtig, um Arzneimittelkonzentrationen in Lösung zu halten, und Belichtungszeiten zwischen den Behandlungsgruppen das gleiche für genauen Vergleich. ZNS-wirksame Medikamente haben in der Regel eine maximale Wirkung über ~ 45 Minuten. Die Larven sollten auch nach der Selektion (oder gegraben Fütterung), die Fliege Nahrung zu entfernen und gewaschen werdenzulässig für 1 Minute vor dem Start des Crawling-Test akklimatisiert. Die Agar-Platte sollte bei Raumtemperatur (~ 22 ° C) für eine Stunde gehalten werden, da niedrige Temperatur Larven kriechen Fähigkeit beeinflussen können. Obwohl die Larven kriechen Test kann wichtige Informationen zur Aktivität bieten, ist es nicht geeignet für die Analyse von subtilen Koordination Defizite. Daher wird, wie ein Screening-Plattform ist es am besten für einen ersten Durchlauf Prüfung grobe Aktivität Defizite.
Eine erwachsene Verhalten, das der feinmotorischen Koordination betreffen, ist Balz und Paarung. Dieses Verhalten wurde genutzt, um Aspekte der relevanten Verhaltensweisen auf menschliche Krankheiten zu untersuchen, und beinhaltet sensorische Verarbeitung (olfaktorische, visuelle, akustische) zusätzlich zur Feinmotorik 18. Wenn ein Männchen ein Weibchen bemerkt, löst er die Balz, die in einem stereotypen Muster, beginnend mit Orientierungsverhalten (Drehen in Richtung auf und jagt das Weibchen) fortschreitet. Dies wird durch wingsong, gefolgt licking und die Erschließung der weiblichen Genitalien, Eisstockschießen des Bauches in Richtung des Weibchens, und gipfelt in der Begattung, die mehrere zehn Minuten 20-22 dauern kann. Da viele der Aspekte des Werbens visuelle Hinweise beinhalten, dunklen Bedingungen zu einer Verschlechterung der Paarungsverhalten führen, und Assays sollten mit genügend Licht durchgeführt werden, so dass Fliegen einander zu sehen. Dementsprechend White-eyed Fliegen haben in der Regel äußerst schlechte Leistung in unserem Test beschrieben und der Leser wird gegen die Planung nutzbar zu machen Experimente mit diesem Protokoll beraten. Wenn die Fliegen Behandlung mit einem Medikament, setzte das Medikament in das Medium die Fliegen auf isoliert (z. B. 1% Agarose + 10% Saccharose + Medikament anstelle von Standard-Nahrung bei der Behandlung mit Medikamenten, um jede mögliche Verschlechterung des Medikaments durch Mikroorganismen in der Vermeidung von Lebensmittel). Im Allgemeinen sind die Fliegen werden in 5 ml Röhrchen, die 300 bis 500 ml Nahrung in sich haben, gesteckt mit Baumwolle isoliert. NICHT betäuben die Fliegen für die Übertragung zum Gegenrad. Es is absolut entscheidend, um die Paarung zwischen Rad sehr gut waschen verwendet, um alle restlichen Pheromone (warmes Wasser mit einer geringen Menge von Alconox Seife über Nacht unter Schütteln, dann für mindestens 48 Stunden in entionisiertem Wasser unter Schütteln gewaschen und zahlreiche Änderungen von Wasser) zu entfernen . Ein weiterer Aspekt bei der Durchführung des Tests beschreiben wir das Wetter ist. Nach unserer Erfahrung Fliegen wird nicht Gericht, wenn es regnet oder aussieht wie es regnen wird. Sie führen am besten auf hellen sonnigen Tag, unabhängig davon, ob das Laboratorium über Fenster oder nicht. Unsere aktuelle Theorie ist, dass dieses Phänomen auf atmosphärischen Druck zusammenhängt, aber wir haben das nicht untersucht.
Die traditionelle negativen Geotaxis Assay beruht auf der Messung, wie viele Fliegen über einer vorbestimmten Höhe in 10 Sekunden (beschrieben in klettern http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Wir glauben, dass die RING-Assay gewisse Vorteile gegenüber der herkömmlichen Assay hat. Einer ist throughput als sechs unabhängigen repliziert gleichzeitig im Vergleich zu der des Standard-Assay gemessen werden, und das System ist im Allgemeinen lassen. Ein weiterer Grund ist die Empfindlichkeit, da die durchschnittliche Höhe kletterten in einem definierten Zeitraum quantifiziert wird, anstatt ein Pass / Fail-Nummer für die absolute Höhe. Mit diesem Ansatz kann subtiler Defizite beobachtet werden. Wegen der Höhe der Durchsatz ist der Test besser geeignet, als die Bildschirme langweiliger traditionellen negativen Geotaxis Assay. Des Weiteren beschreiben Garagano et al. (2005) ein computergestütztes Scoring-Methode, die angewandt würden, wenn Durchsatz weiter zu erhöhen. Primäre Überlegungen für diesen Test sind, dass es unerlässlich ist, dass die Fliegen nicht betäubt vor dem Test, und auch frische Flaschen werden nach einer gegebenen Menge von Studien, bevor eine neue Charge von Fliegen getestet werden verwendet.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Astha Maltare zur Erzeugung der Larven kriechen Daten danken. Wir möchten Dr. Nicholas Lanson Jr. für das Geben seiner Anmerkungen zum Manuskript danken. Diese Arbeit wurde von der Robert-Packard Zentrum für ALS an der Johns Hopkins (bis UBP) und die Amyotrophe Lateralsklerose Association (UBP) unterstützt; und R01MH083689 von den National Institutes of Mental Health (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
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