Summary
Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.
Abstract
Drosophila melanogaster, meyve sineği, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve bazı nörolojik hastalıklar 1. sıra insan hastalıklarının geniş bir moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Biz larva hareket, yetişkin tırmanma yeteneği (HALKA testi), ve Drosophila kur davranışlarının belirlenmesi için basit ve sağlam davranışsal testler optimize edilmiştir. Bu davranış testleri sinek davranışı üzerinde genetik ve çevresel faktörlerin rolünü incelemek için yaygın olarak uygulanabilir. Larva tarama yeteneği güvenilir ve aynı zamanda lokomosyon ilaçlar ya da genetik hastalık etkisi (transgenik sineklerde) incelenmesi için Drosophila larva tarama yetenekleri erken evre değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Aksi takdirde değerlendirilebilir nerede bu sinekler yetişkinliğe hayatta yok gibi bir genin ifadesi veya kaldırılması, pupa veya ergin dönemlerinde ölümcül neden olursa larva tarama testi daha uygun olur. Bu temel birssay Drosophila larva ek davranışsal tepkileri incelemek için parlak ışık veya stres ile birlikte de kullanılabilir. Kur davranışı yaygın cinsel davranış genetik temeli araştırmak için kullanılmıştır ve aynı zamanda da öğrenme ve bellek gibi, etkinlik ve koordinasyon incelemek için kullanılabilir. Drosophila Kur davranışı görsel, işitsel ve duyusal sinyaller dahil olmak üzere çeşitli uyarımlar değişimi içerir erkek ve başarılı cinsel birleşme sonuçlanan iyi karakterize motor hareketlerin karmaşık bir dizi neden kadınlar arasında. Geleneksel yetişkin tırmanma testler (negatif geotaxis) farklı çalışmalarda 2-4 arasında belirgin bir farklılaşma ile sıkıcı, yoğun emek ve zaman alıcı vardır. Hızlı (HALKA) testi 5 yetişkin lokomotor ve negatif geotaxis b ölçmek için, tekrarlanabilir duyarlı ve yüksek verimlilik yaklaşımı sağlayan, yaygın kullanılan protokolleri üzerinden pek çok avantajı vardır negatif geotaxis iteratifehaviors. HALKA deneyde, birkaç genotiplerinin veya ilaç tedavileri yüksek verimli tarama deneyleri yaklaşımı için daha uygun hale ile birlikte, aynı zamanda hayvanları, çok sayıda kullanılarak test edilebilir.
Protocol
A. Larva sürünüyor Testi
1. Larva Koleksiyonu
- Sinekler (10-15 erkek + 10-15 kadın) bir 8 ons şişe ayarlayın.
- Sinekler sonra 24 saat boyunca yumurta, sineklerin net şişe inşa edelim. (Yeni bir şişeye aktarın ve yetişkinlerin uygun şekilde tekrarlayınız).
- 3-4 gün inkübe şişe, ya da üçüncü evre larvaları görünür olana kadar.
- Larvaları ile şişeye% 20 sakkaroz, 100 ml ve 20 dakika bekletin - 50 ekleyin. Larva başına yüzer.
- Uçlu bir 25 ml serolojik pipet kullanarak toplayın larva kesti ve bir mesh sepet içine yer.
- Iki kez deiyonize H 2 O ile örgü sepet içinde larva yıkayın Larva artık deneyler için hazır.
2. Ilaç ile larva tedavisi için
- Bir çözüm% 5 sakkaroz + ilaç içeren 5 ml'lik behere larva İstediğiniz numaraya taşımak için bir fırça kullanın.
- En azından 15 dakika süreyle larvaları besleme sağlar.
- Bir örgü sepet içine ilaç ile tedavi edilen larva dökün ve durulayın. Onlar artık kullanıma hazır.
3. Lokomotor Assay (toplam mesafe ölçme seyahat veya vücut duvarı kasılmaları)
- Bir tek tek larva taşımak için bir fırça kullanın:
- 0,2 cm 2 ızgara ile milimetrik kağıt üzerinde% 2 agaroz (daha önce dökülür ve sertleşmesine izin) içeren 15 cm Petri.
- 1 dakika içinde geçti çizgileri sayısını sayın.
- Seyreltilmiş maya hamur çözeltisi içeren bir cam diseksiyon çanağı iyi.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemlerken bir dakika içinde peristaltizm kasılmalar (posterior hareketi = 1 daralma tam anterior) sayın.
- 0,2 cm 2 ızgara ile milimetrik kağıt üzerinde% 2 agaroz (daha önce dökülür ve sertleşmesine izin) içeren 15 cm Petri.
- Larva istenilen sayıda sayılmış kadar tekrarlayın.
B. Hızlı negatif geotaxis (HALKA) Protokol iteratif
Bu test aslında kaldırdığımızda edildiGargano ark 5 tarafından tarif edildiği.
- Standart bir flakon içeren yiyecekler (veya gıda + ilaç) içine ışık CO 2 anesthetization ve yer altında yeni ortaya çıkan yetişkin erkek sinekleri toplayın.
- Oda sıcaklığında sinekler Koru (tezgah üstünde. ~ 22 ° C) CO 2 kurtarma (ve kararlı durum ilaç düzeyleri birikimi uygunsa) izin vermek için 2-3 gün.
- Hazırlanan polistiren şişelere anestezi olmadan 25 sinekler hakkında aktarın.
- HALKA aparatı (Şekil 1) içine sinekler şişeleri birleştirin.
- Sinekler 15-20 dakika boyunca rahatsız edilmeden çevre, gelmesini bekleyin.
- Bu süre yerde dijital kamera sırasında ~ cihazları önünde 1 m (bir platform flakon orta yükseklikte lensin merkezine hizalamak için gerekirse üzerine), odaklanma ve aparat üzerine kamera, zum ve bir zamanlayıcı ayarlamak 3.0 saniye.
- Dikkatle dist için sol elinizle HALKA aygıtının tutun şekilde alamayızurb sinekler ve sağ elinizle zamanlayıcı tutun.
- Keskin musluk şişe altına tüm sinekler yıkmak yeterince zor sağlanması, tezgah yüzeyinin üç kez aparatı aşağı dokunun.
- Aynı zamanda üçüncü kademe tamamlanması ile birlikte, 3 saniyelik geri sayım sayacını başlatmak.
- Üç saniyede bir resim çekin.
- 1 dakika zamanlayıcı sıfırlayın ve başlayın. Bu süre boyunca cihaz üzerindeki kamera ve odak sıfırlamak ve üç saniye sayacı başka bir kanala ayarlayın.
- 1 dakika sonra tekrar 1,7-1,10 adımlar
- 5-6 denemenin toplamı sonra, bir bilgisayara resim yüklemek ve açmak için favori resim görüntüleyici kullanın ve ortalama yüksekliği her flakon için tırmandı puan.
- Tırmandı ortalama yüksekliği karşılaştırırken, farklı grup üzerinde istatistiksel analiz.
C. Kur yapma ve çiftleşme Testi
- Sabah ilk iş, fli net iyi üreten şişeleres kullanılır.
- Gün içerisinde (her 3-4 saat) içinde, yeni ortaya çıkan cinsel naif erkek ve kadın toplamak:
- Orta şişelerde veya tüpleri tek tek erkeklerde yerleştirin.
- Şişe / tüp başına birlikte 5-6 dişi koyun.
- 5 gün boyunca karanlık 12 saat ışık altında / 25 ° C 'de toplanan sinekler kesin.
- Bir çiftleşme tekerleğin odasına bir kadın aktarın.
- Bir çiftleşme tekerleğin odasına bir erkek aktarın.
- Aşağıdaki davranışlardan bir diseksiyon mikroskobu altında çifti gözlemleyin:
- Oryantasyon (kadın doğru erkek yönlendirir)
- (Erkek kadın yararlanıyor) dokunulduğunda
- Kanat şarkı (erkek genişletir ve bir kanat titreşir)
- (Erkek yalıyor kadın genital organlarının) Licking
- Curling (erkek kendisi altında karnı kıvrılıyor)
- (Kadın monte çalışırken aktivite Curling) birleşme girişimi
- 1 dikkat0 dakika veya daha başarılı bir birleşme kadar, her davranışın meydana geldiği zaman not (gecikme), kur birleşme kadar davranış (kur endeksi hesaplamak için) yanı sıra, başarılı bir şekilde belirli bir davranışı gerçekleştirmek çiftlerinin numarası yapan toplam süre ( frekans). Vahşi tip çiftlerinin% 100 genellikle 5 dakika içinde çiftleşirler olacaktır.
- Hesaplamak zaman bölerek bir kur endeksine (CI) çiftleşmeye kadar toplam süre bölünmesiyle kur geçirdi. Vahşi tip çiftleri için bu genellikle 0.6-0.8 arasında değişmektedir.
D. Örnek Sonuçlar
Assay Crawling
Normal vahşi tip larva ~ 3 cm / dakika ve sergi ~ bir dakika içinde 40-50 vücut duvarı kasılmaları başıboş dolaşırlar. Biz son zamanlarda larva sürünen, kusur, düşük kullanım ömrü ve değer düşüklüğü 6 tırmanma yetişkin gösterir FUS / TLS ile ilgili Amyotrofik lateral skleroz bir Drosophila modeli geliştirdik. Biz ifadesi o hedefMotor nöronların (OK-371-gal4 sürücü) ve f yabani tip ve FUS / TLS mutant formları bir larva tarama testi yapıldı. Aşağıda görüldüğü gibi vahşi tip FUS ifadesi yaklaşık 6 cm larva tarama yeteneği azalmış ise, vahşi tip larva, en fazla 12 cm sürün. FUS / TLS ALS neden olan mutasyon R521C ifade Hayvanlar sadece yaklaşık 1 cm / dakika, emekleme, onların tarama hareketi çok ciddi bozulma (Şekil 1) göstermektedir.
Negatif geotaxis HALKA assay
Genç vahşi tip ergin sinek 3 saniyelik bir zaman diliminde ~ 4-5 cm (zaman belirli bir için belirli bir ortalama yüksekliği tanımlamak için farklı suşları veya aktivite seviyelerini karşılamak için 3 saniye arasında ayarlanabilir ortalama tırmanma yükseklikte olmalıdır / tedavi) süzün. Altta kalan sinekler 0 değeri tahsis edilir. Onu daha sonra yüksekliğini ölçmek için her bir sinek yerini belirlemek zor olur, çünkü vialde 25'ten fazla sinek kullanılması tavsiye edilmez. No duyarsızlaştırma istihdam ediyor olması dışında 1 dakika aralıklı 6 ardışık denemeler için yukarı görülmüştür. Bu kullanılan vialler içine yerleştirilen yeni sinekler taze şişeler içerisine aynı ölçüde tırmanmaya çünkü toplanmış veri kümesi başlangıç sonra bu tahlilde test polistiren şişeleri yeniden edilmeyen kritik önem taşır.
Şekil 1. HALKA Assay Kur. Odaklanma ve aparat üzerine kamera yakınlaştırmak;; dijital kamera polistiren flakonlarda sinekler içeren cihazları önünde ~ 1 m yerleştirilir ve 3.0 saniye için zamanlayıcıyı ayarlayabilirsiniz.
Kullanarak larva tarama testte Şekil 2. Temsilcisi veri ektopik UAS-FUS WT ifade ve motor nöron sürücüsü (OK371-gal4) kontrolü altında UAS-FUS R521C sinekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila davranış sıkı genetik ve çevresel faktörler tarafından düzenlenir. Biz ve diğerleri, daha önce davranış ve Drosophila 5-19 modellenmiş insan nörodejeneratif hastalıklar uçmak için ilgili genler incelemek için veri toplamak için burada açıklanan testleri kullandılar. Tarama testi için, 3. Larvalar dikkatli seçimi kritik bir adımdır. Bir ilaç ile tedavi etmek, bu da iyi bir erime kabiliyetine sahip olmadığını maksimal etkisi elde etmek için 10-15 dakika (veya daha fazla ilaç tipi ve doğasına bağlı olarak) alacaktır. Bu nedenle, rutin beslemek 15 dakika için ilaç uçar ve sonra test yapılmadan önce ek bir 15 dakika bekleyin. Bu çözelti, ilaç konsantrasyonlarını tutmak için, bununla birlikte, önemlidir ve tedavi grupları arasında maruz kalma süresi, doğru bir karşılaştırma için aynıdır. CNS aktif ilaç genellikle kalıcı bir maksimal etkisi ~ 45 dakika olacak. Larva de sinek gıda kaldırmak ve seçimi (veya beslenme kazdık) sonra yıkanmalıizin tarama testi başlamadan önce 1 dakika iklimlendirdi. Düşük sıcaklıkta larva taranmasına yeteneği etkileyebilir gibi agar plak, bir saat boyunca oda sıcaklığında (~ 22 ° C) olarak saklanmalıdır. Larva tarama testi aktivite düzeyleri ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir rağmen, ince koordinasyon açıklarının analizi için uygun değildir. Bu nedenle, bir tarama platformu olarak brüt faaliyet açıklarını inceleyen ilk geçiş için en uygundur.
Ince motor koordinasyon ile ilgili bir yetişkin davranışı flört ve çiftleşme olduğunu. Bu davranış, insan hastalıkları ile ilgili davranışlar yönlerini incelemek için kullanılan ve ince motor kontrolü 18 yanısıra duyusal işleme (koku, görsel, akustik) içerir edilmiştir. Bir erkek bir dişi fark edince, yönelim davranış (doğru çevirerek ve kadın kovalayan) ile bir klişe desen başında ilerledikçe kur ritüel başlatır. Bu wingsong, Lickin takip ediyorg ve kadın doğru karın kıvırma, kadın genetalia vurma ve 20-22 dakika birkaç on sürebilir birleşme ile sonuçlanacak. Kur yönlerini pek çok görsel ipuçları içerdiğinden, karanlık koşullarda çiftleşme performans düşmesine yol, birbirlerini görebilirsiniz uçar böylece testlerin yeterince ışık ile yapılmalıdır. Buna göre, beyaz gözlü sinekler genellikle bizim açıklanan deneyde son derece kötü performansa sahip ve okuyucular bu protokol ile bunları kullanan deneyler planlıyoruz karşı tavsiye edilir. Bir ilaç ile tedavi sinekler, ortama ilaç koyarsanız sinekler üzerinde izole edilir (örneğin% 1 agaroz +% 10 sakkaroz + ilaç yerine standart gıda mikroorganizmalar tarafından ilacın olası düşüşü önlemek için ilaç ile tedavi gıda). Genellikle sinekler pamuk ile takılı, onlara yiyecek 300-500 ml olan 5 ml test tüplerinde izole edilmiştir. Çiftleşme tekerlek transfer için sinekler uyutmak yapmayın. Bu is çok iyi arasındaki çiftleşme tekerlek yıkama kesinlikle KRİTİK herhangi bir kalıntı feromonlar (daha sonra sallayarak deiyonize su içinde en az 48 saat süreyle yıkanmış sallayarak ile gece boyu Alconox sabun ile az miktarda sıcak su, su ve çok sayıda değişiklik) kaldırmak için kullanır . Bizim tarif tahlil yapan bir diğer dikkate hava. Yağmur veya yağmur yağacak gibi görünüyor eğer deneyimlerimiz sineklerinde mahkemeye olmayacaktır. Laboratuar pencere veya varsa onlar ne olursa olsun, güneşli günlerde en iyi performansı. Mevcut teorisi bu fenomen atmosfer basıncı ile ilişkili olduğu, ama biz bu Soruşturma değil.
Geleneksel negatif geotaxis testi 10 saniye (açıklanan önceden belirlenmiş bir yükseklik üzerinde tırmanmaya kaç sinekler ölçüm dayanır http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Biz HALKA tahlil geleneksel tahlil üzerinde bazı avantajları olduğuna inanıyorum. Bir throughput, altı gibi bağımsız standart assay of birine göre eş zamanlı olarak ölçülebilir çoğaltır ve sistemi, genellikle ölçeklenebilirdir. Ortalama yüksekliği belirli bir süre içinde tırmandı çünkü diğer bir çok bir geçiş / mutlak yükseklik için çok sayıda başarısız, ölçülür, hassasiyetidir. Bu yaklaşımı kullanarak, daha ince açıkları görülebilir. Çünkü akış düzeyinin, assay sıkıcı geleneksel negatif geotaxis deneyi daha ekranları daha uygundur. Ayrıca, Garagano ve ark. (2005) daha fazla verim artacak istihdam eğer bilgisayarlı puanlama yöntemi açıklar. Bu deneyde İlköğretim mülâhazalar sinekler test öncesi anestezi değildir ve bu taze flakon sineklerin yeni bir toplu test edilmiştir denemeler verilen bir grubu sonra kullanılır zorunludur olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz larva tarama verilerinin üretilmesi için Astha Maltare teşekkür etmek istiyorum. Biz el yazması üzerine yaptığı yorum vermek için Dr Nicholas Lanson Jr teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Johns Hopkins ALS Robert Packard Merkezi (UBP) ve Amyotrofik Lateral Skleroz Derneği (UBP) tarafından desteklenen ve Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü (CDN) den R01MH083689.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
- Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
- Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
- Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
- Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
- Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
- Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
- Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
- Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800 (2011).
- Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
- Bastock, M., Manning, A. The Courtship of Drosophila Melanogaster. Behaviour. , 85-111 (1955).
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F. Courtship in Drosophila. Annu. Rev. Genet. 34, 205-232 (2000).
- Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).
