Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

وحيد الخلية تحليل الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي

doi: 10.3791/3796 Published: February 15, 2012

Summary

وعموما الأغشية الحيوية الميكروبية التي تشكلها مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. وحيد الخلية تحليل هذه القطعان يتطلب استخدام للصحفيين فلوري. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور ورصد عدة subpopulationswithin

Abstract

تشكيل بيوفيلم هو سمة عامة للجميع تقريبا 1-6 البكتيريا. عندما البكتيريا تشكل الأغشية الحيوية، وخلايا المغطى في المصفوفة خارج الخلية التي شكلت في معظمها من البروتينات وexopolysaccharides، من بين عوامل أخرى 7-10. المغطى المجتمع الميكروبية داخل بيوفيلم يظهر في كثير من الأحيان التمييز بين subpopulation متميزة من الخلايا المتخصصة 11-17. هذه القطعان تتعايش وغالبا ما تظهر التنظيم المكاني والزماني في بيوفيلم 18-21.

تشكيل بيوفيلم في نموذج العصوية الرقيقة الحي يتطلب التفريق بين مجموعات سكانية فرعية متميزة من الخلايا المتخصصة. فيما بينها، وsubpopulation من المنتجين مصفوفة، المسؤولة عن انتاج وإفراز المصفوفة خارج الخلية من بيوفيلم أمر ضروري لتشكيل بيوفيلم 11،19. وبالتالي، التفريق بين المنتجين المصفوفة هو السمة المميزة لتشكيل بيوفيلم في B. الرقيقة.

وقد استخدمنا للصحفيين فلوري لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين مصفوفة في الأغشية الحيوية من B. 15،19،22-24 الرقيقة. بشكل ملموس، لاحظنا أن subpopulation من المنتجين مصفوفة يفرق ردا على وجود الذات المنتجة خارج الخلية إشارة surfactin 25. ومن المثير للاهتمام، ويتم إنتاج surfactin بواسطة جزء من السكان من خلايا متخصصة تختلف عن subpopulation من المنتجين مصفوفة 15.

وقد فصلنا في هذا التقرير على نهج الفنية اللازمة لتصور وتحديد subpopulation من المنتجين والمنتجين surfactin مصفوفة داخل الأغشية الرقيقة من B.. للقيام بذلك، يتم إدراج صحفيين فلوري من الجينات اللازمة لإنتاج مصفوفة والإنتاج surfactin في كروموسوم من B. الرقيقة. يتم التعبير للصحفيين فقط في جزء من السكان من الخلايا المتخصصة. ثم، يمكن أن تكون القطعانرصدها باستخدام المجهر مضان والتدفق الخلوي (انظر الشكل 1).

حقيقة أن مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا المتخصصة التعايش داخل المجتمعات المتعددة الخلايا من البكتيريا يعطينا وجهة نظر مختلفة حول تنظيم التعبير الجيني في بدائيات النوى. هذا البروتوكول لا يتناول هذه الظاهرة بشكل تجريبي، ويمكن أن تتكيف بسهولة مع أي نموذج العمل الأخرى، لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية الكامنة وراء عدم التجانس المظهري داخل المجتمع الميكروبية.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. وضع العلامات B. الرقيقة وبيوفيلم الفحص تشكيل

  1. تضخيم من قبل الاسترداد في منطقة المروج من الجينات في المصالح. نعرض كمثال استنساخ تابا ف، المروج من الجينات المسؤولة عن إنتاج بروتين المصفوفة الطاسه 26. استنساخ ف تابا إلى pkm008 ناقلات (تم إنشاؤه من قبل مختبر Rudner، كلية الطب بجامعة هارفارد. بوسطن، الولايات المتحدة الأمريكية) (الشكل 2).
  2. يصبح خطي من البلازميدات بواسطة الهضم الأنزيمي (الإنزيم الموصى بها، XhoI).
  3. حث اختصاص الطبيعية في B. الرقيقة توتر 168 باتباع بروتوكول خطوة واحدة سبق وصفها من قبل هاروود وقطع 27.
  4. إضافة البلازميدات خطي في ثقافة من الخلايا المختصة وحدد للمقاومة سبكتينوميسين بعد ساعتين من الحضانة.
  5. أدرجت سلالات حصلت على التركيبة في مكان محايد amyE باء. الرقيقة من إعادة التركيب المزدوج (الشكل 4). لإنشاءسلالة المزدوج المسمى، دمج الصحفي الثاني في هموم موضع محايد باستخدام pDR183 البلازميد نقدم في الشكل 3. إدراج هذا المراسل باستخدام نفس التقنية التي وصفناها أعلاه لإدراج صحفيين المستنسخة في pKM008.
  6. نقل المراسل عن سلالة 168 إلى NCIB3610 أن يكون قادرا على تشكيل الأغشية الحيوية. استخدام تنبيغ بالعاثية SPP1 بروتوكول 28،29. تنمو سلالة المانحة في المتوسط ​​TY (LB +10 +10 ملي MgSO 4 ميكرومتر MnSO 4). مزيج 200 ميكرولتر من ثقافة مع 100 ميكرولتر من تخفيف الأوراق المالية ووظائفها. أضف 3 مل من أجار لينة بعد 30 دقيقة من حضانة والسماح للهالات بالعاثية أن تنشأ عند 37 درجة مئوية.
  7. جمع أجار لينة. يعتقد أنه منبذة وتمرير طاف حقنة 0.22 ميكرون فلتر. استخدام هذا طاف على إصابة ثقافة سلالة المتلقي نمت في المتوسط ​​TY. إضافة 30 ميكروليتر إلى 10 مل من 1:10 ثقافة المخفف. احتضان لمدة 30 دقيقة وحدد لمقاومة المضادات الحيوية بعد 24 ساعة من الحضانة.
  8. سراج الدينlect مستعمرة وتنمو بين عشية وضحاها على LB عند 37 درجة مئوية.
  9. اكتشاف 3 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في المتوسط ​​بيوفيلم الذي يحفز الصلبة MSgg أجار 1.5٪ 30. السماح للخلايا أن تنمو خلال 72 ساعة على 30 درجة مئوية (الشكل 3). بعد ثلاثة أيام من النمو، وتطوير الأغشية الحيوية تشكلت على السطح من أجار MSgg بنية معقدة الصرفية في سطح أجار.

2. التشتت بيوفيلم وتثبيت الخلية

  1. إزالة النموذج بيوفيلم سطح أجار MSgg باستخدام مسواك أو ملاقط. وينبغي أن اتساق بيوفيلم تسمح لك لقشر تشغيله من سطح أجار في قطعة واحدة.
  2. وضع بيوفيلم في 3 مل من المخزن برنامج تلفزيوني وتفريق بيوفيلم بواسطة مرور المتكررة من خلال ماصة أو إبرة. بدلا من ذلك، يمكن القيام بيوفيلم تشتت باستخدام صوتنة معتدل. صوتنة معتدل يتطلب 12 البقول ويبلغ حجم انتاجها من 3 والسعة من خلال 0.7 ثانية.
  3. تحديد العينات قبل خلية واحدة تحليل. Resuspenد 300 ميكرولتر من تعليق خلية في 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لسبع دقائق بالضبط.
    تكوين حل لامتصاص العرق 4٪:
    2 غرام من بارافورمالدهيد
    50 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني
    4 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم
    تصفية حل من خلال مرشح 0،22 أم وقسامة
  4. غسل الخلايا بعد تثبيت العازلة في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وresuspend لهم في 300 ميكرولتر من العازلة في برنامج تلفزيوني.

3. مضان المجهر

  1. صب 200 ميكرولتر من 0.8٪ الاغاروز على شريحة المجهر، وتغطي بعناية مع شريحة أخرى. إزالة الشريحة العليا بهدوء بعد 2 دقيقة للحصول على طبقة من الاغاروز تعلق على شريحة من أسفل.
  2. بقعة 2 ميكرولتر من خلايا ثابتة على سطح طبقة الاغاروز وتغطية ذلك مع المجهر غطاء زجاجي.
  3. وضع العينة في مضان المجهر. نستخدم الإسفار مجهر لايكا DMI6000B مجهزة iIluminat CRT6000 لايكاايون النظام. المرشحات لYFP هي تحويلة: BP500/20، إم: BP535/30 والحراجية هي تحويلة: BP426/20، إم: 480/40
  4. فضح عينتك لإثارة مضان بين MS 50-200. تعيين فترة الإثارة وفقا لسيطرة السلبية التي لا تظهر مضان في ظروف المحددة للتجربة.
  5. إحالة صورة مضان على نفس الصورة التي تم الحصول عليها مع حقل مشرق. دمج الصورتين في صورة واحدة. النتائج التي تم الحصول عليها من مضان المجهر تدفق باستخدام سلالة واحدة، وصفت إيواء مراسل تمثل P-تابا YFP في الشكل 6.

4. الكمي للخلايا واحدة عن طريق التدفق الخلوي

  1. تفريق عينة من خلايا محددة باستخدام صوتنة معتدل. يصوتن العينة أداء 2 سلسلة من 12 البقول ويبلغ حجم انتاجها من 5 والسعة من خلال 0.7 ثانية، لتفريق تكتلات داخل الخلايا واحد دون أن تسبب تحلل الخلية. تأكيد كفاءة تشتت الخلية بواسطة المجهر الضوئي. تمييع عينة 1:100 في برنامج تلفزيوني قبل العازلة تحليل التدفق الخلوي. نستخدم تدفق عداد الكريات دينار بحريني FACS كانتو الثاني. لمضان YFP، واستخدام الليزر في إثارة 488 نانومتر إلى جانب وجود مرشح 530/30. لمضان CFP، استخدام الليزر في إثارة 405 نانومتر إلى جانب وجود مرشح 408/40.
  2. معايرة عداد الكريات آلة تدفق مع اثنين من عناصر سلبية. وينبغي أن يكون عينة من العازلة في برنامج تلفزيوني مع عدم وجود خلايا في التعليق بمثابة سيطرة سلبية على حجم الجزيئات لمست من قبل تدفق عداد الكريات. وينبغي أن يكون عينة المسمى مع عدم وجود مراسل لمضان أن تكون بمثابة سيطرة سلبية للحساسية مضان من تدفق عداد الكريات.
  3. وضع عينة المسمى مع مراسل فلوري في عداد الكريات تدفق. لكل عينة، وتحليل ما لا يقل عن 50000 الأحداث مع معدل تدفق ما بين 300 و 3000 الأحداث في الثانية الواحدة.
  4. التقاط البيانات باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية المغنية البرمجيات دينار بحريني (العلوم البيولوجية) وتحليلها باستخدام FlowJo 8.5.2 البرمجيات. تشير إشارات مضان لرقابة التي تظهرق لا مضان.
  5. تقديم البيانات ورصد إشارة مضان من سلالة واحدة، وصفت في رسم اثنين من محاور. رسم إشارة مضان الكشف عنها في المحور العاشر وعدد الخلايا التعبير عن مستويات مختلفة من التألق في المحور ص. النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل التدفق الخلوي باستخدام سلالة واحدة، وصفت إيواء مراسل تمثل P-تابا YFP في الشكل 8.
  6. تقديم البيانات ورصد إشارة مضان من سلالة مزدوجة وصفت في رسم ثلاثة محاور. رسم إشارة مضان من كل واحدة من القنوات رصدها في محاور X و Y (على سبيل المثال، سوف يتم قياس GFP في المحور العاشر والحراجية المعتمدة في المحور Y). مؤامرة في Z-محور عدد الخلايا التعبير عن كل صحافي وتقديمها مثل خطوط التساوي كفاف من شأنه أن يكون عموديا على مستوى الورقة (الشكل رقم 9 و 10).

4. ممثل النتائج

عندما B. الرقيقة ينمو على طبق من (ب)ويلاحظ iofilm الذي يحفز MSgg المتوسط، تشكيل بيوفيلم بعد ثلاثة أيام من الحضانة في 30 30 درجة مئوية. وبيوفيلم يظهر اتساق قوي، ويمكن تشغيله من مقشر سطح أجار في قطعة واحدة. علاوة على ذلك، بيوفيلم يظهر بنية معقدة الصرفي أن يدل على مجموعات سكانية فرعية متميزة خلية المشاركة (الشكل 5). على سبيل المثال، إنتاج المصفوفة خارج الخلية في نتائج الأغشية الحيوية في تكوين التجاعيد على السطح للمستعمرة. ويمكن ربط هذه الميزة مع التمايز في subpopulation من المنتجين مصفوفة 19. وبالمثل، فإن رفع الهياكل الجوية على سطح بيوفيلم يدل على وجود جزء من السكان من الخلايا sporulating، لأن الجراثيم موضعيا في منطقة قمية هذه الهياكل 30.

أمثلة من التصور من تمايز الخلايا في R واحدة وصفت وهي سلالة المزدوج المسمى باستخدام المجهر مضانepresented في الشكل 6 و 7 على التوالي. سلالة واحدة وصفت تؤوي مراسل فلوري P-CFP تابا الذي أعرب عنه في subpopulation من الخلايا المنتجة للمصفوفة. هذا subpopulation هي المسؤولة عن انتاج وإفراز المصفوفة خارج الخلية التي تشكل بيوفيلم (الشكل 6). سلالة المزدوج المسمى تؤوي مراسل P-CFP تابا (26) ومراسل إضافية P-srfAA YFP 31. هذا المراسل الثاني يسمح لمراقبة subpopulation من الخلايا المسؤولة عن إفراز surfactin جزيء إشارة، الذي يتسبب في سلسلة يشير إلى التفريق بين المنتجين مصفوفة (الشكل 7). Subpopulation من المنتجين المصفوفة ليست صحيحة الملونة باللون الأزرق بينما subpopulation من المنتجين surfactin باطل الملونة باللون الأصفر.

تحليل التدفق الخلوي باستخدام سلالة واحدة، وصفت إيواء مراسل يرد P-تابا YFP في الشكل 8. غير المعالجة سلالة تحكم لا تأويوأظهرت أي جينات بروتين فلوري واحد مضان سكان منخفض نسبيا. لم الخلايا ايواء P-تابا YFP في ظروف غير بيوفيلم الذي يحفز ليس التفريق بين subpopulation من المنتجين المصفوفة وجميع السكان وأظهرت مضان منخفض نسبيا. في بيوفيلم الذي يحفز حالة، وقعت جزء من السكان من الخلايا مع مضان نسبية عالية، كما لوحظ في الكتف على يمين ذروة انخفاض نسبي مضان 23.

وتمثل النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل التدفق الخلوي باستخدام سلالة المزدوج المسمى في الشكل 9 و 10. الشكل 9 رصد جزء من السكان المنتجين مصفوفة والمنتجين surfactin باستخدام الضغط المزدوج المسمى P-CFP تابا، P-srfAA YFP. كما السيطرة على مضان الخلفية كنا سلالة لا تأوي أي جينات بروتين فلوري. المقبل، لمسنا كل subpopulation من المنتجين والمنتجين surfactin مصفوفة في كل قناة مضان، وذلك باستخدام سلالة واحدة، وصفت ق كما الضوابط. وأظهرت السلالة المزدوج المسمى P-CFP تابا، P-srfAA YFP 2 جزء من السكان الخلايا معربا عن مستويات عالية من الصحفيين فلوري. تم تأطير كل السكان، والتي تبين أنه لا يوجد تداخل في التعبير عن الصحفيين بين المجموعات السكانية الفرعية اثنين من الخلايا المتخصصة 15. وبالمثل التدفق الخلوي، التحليل باستخدام المزدوج المسمى يرد سلالة P-SKF YFP، P-تابا YFP في الشكل 10. المراسل لجينة SKF تراقب التمايز من subpopulation من أكلة لحوم البشر 32، التي وصفت في التفريق coordinately مع subpopulation من المنتجين مصفوفة 24. في هذه الحالة، وأظهرت السلالة المزدوج المسمى جزء من السكان واحدة من الخلايا فلوري التعبير عن كلا YFP والحراجية. هذا يشير الى ان يتم تنشيط مسارات coordinately كلا تمايز الخلايا في subpopulation نفسه.

1.JPG "/>
الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. وينقسم بروتوكول في ثلاث خطوات رئيسية. الخطوة الأولى تتطلب وصفها سلالة من B. الرقيقة مع الانصهار مراسل التي تراقب subpopulation من الفائدة. الثانية، وتنمو سلالات المسمى في بيوفيلم الذي يحفز الظروف. الثالث، تفريق بيوفيلم وتنفيذ وحيدة الخلية تحليل للسكان باستخدام مجهر مضان والتدفق الخلوي.

الشكل 2
الشكل 2. التمثيل التخطيطي لالتكامل pKM008 ناقلات. هذا ناقلات يدمج الانصهار المراسل من مصلحة في مكان محايد amyE بواسطة إعادة التركيب المزدوج. والمستنسخة مروجي مصلحة (P تابا) في مكافحة ناقلات باستخدام تقييد مواقع EcoRI وHindIII. ثم، في التعبير عن الجينات CFP هو تحت سيطرة المروج ف تابا. وorientatيتم تمثيل أيون من الجينات في البلازميد كالسهم.

الشكل (3)
الشكل 3. التمثيل التخطيطي لناقلات التكامل pDR183. هذا ناقلات يدمج الانصهار المراسل من مصلحة في هموم موضع محايد من قبل إعادة التركيب المزدوج. والمستنسخة في مكافحة ناقلات باستخدام تقييد مواقع EcoRI وBamHI - الانصهار من مصلحة (CFP ف تابا). ويمثل اتجاه الجينات في البلازميد كالسهم.

الشكل 4
الشكل 4. مخطط للتكامل للصحفيين في كروموسوم من B. الرقيقة من إعادة التركيب المزدوج. (A) B. الرقيقة كروموسوم اثنين من مواضع محايد، amyE وهموم، لدمج اندماج مراسل دون التأثير على تطور بيوفيلم. (B) B. الرقيقة من إعادة التركيب المزدوج. اندماج مراسل يدمج في مكان محايد على نحو مستقر.

الشكل 5
الشكل 5. تشكيل بيوفيلم باء. الرقيقة NCIB3610. عملية تشكيل bioflm من سلالة B. الرقيقة NCIB 3610 عندما المتزايد على MSgg المتوسطة بيوفيلم الذي يحفز خلال ثلاثة أيام في 30 درجة مئوية. وقد أخذت صور متتابعة لتطوير بيوفيلم كل 12H.

الشكل (6)
الشكل 6. تصور من subpopulation من المنتجين مصفوفة تحت المجهر مضان. عينة من بيوفيلم باء. تم إصلاح الحراجية وفحصها تحت المجهر مضان - الرقيقة P تابا. 200 مللي ثانية من مضانالإثارة يتضح جزء من السكان من الخلايا التي ينبعث منها أكبر من مضان بقية الخلايا. اعتبرنا هذا subpopulation كما subpopulation من مصفوفة الخلايا المنتجة. شريط المقياس 3 ميكرومتر.

الشكل 7
الشكل 7. تصور من subpopulation من المنتجين والمنتجين مصفوفة surfactin تحت المجهر مضان. عينة من بيوفيلم من B. الرقيقة P-CFP تابا، تم إصلاح P-srfAA yfp الضغط المزدوج وصفت وفحصها تحت المجهر مضان. زمن التعرض من 250 مللي القطعان 2 يتضح من الخلايا التي ينبعث منها أكبر من مضان بقية الخلايا. أعرب أحد subpopulation YFP وتم الكشف عن ذلك باستخدام حصرا قناة YFP (كاذبة الملونة باللون الأصفر). هذا هو subpopulation من المنتجين surfactin. وأعرب آخر subpopulation CFP وتم الكشف على وجه الحصر ذلك باستخدام chann CFP ش. هذا هو subpopulation من المنتجين المصفوفة. شريط المقياس 3 ميكرومتر.

الشكل 8
الرقم 8. تفرقوا الكمي لsubpopulation من المنتجين باستخدام مصفوفة 2 مد تدفق الخلوي. الخلايا من بيوفيلم من B. تم رصد الرقيقة P-تابا yfp باستخدام التدفق الخلوي. عد عداد الكريات تدفق 50،000 أحداث، ويتم رصد إشارة مضان لكل حدث. يتم رسم عدد من الخلايا عدها في محور Y بينما يتم رسم شدة إشارة YFP في المحور العاشر. وقد نمت الخلايا في المتوسط ​​LB للحصول على ظروف حمل غير بيوفيلم. وقد نمت الخلايا في MSgg المتوسطة للحصول على بيوفيلم الذي يحفز الظروف. وsubpopulation من المنتجين مصفوفة يميز فقط في بيوفيلم الذي يحفز الظروف. وقد تم تكييف هذا الرقم من وآخرون لوبيز.، PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
الشكل 9. وتعرض الكمي لsubpopulation من المنتجين والمنتجين surfactin مصفوفة باستخدام 3-D التدفق الخلوي. إشارة الإسفار من القنوات رصدها في محور X (لYFP) ومحور Y (لCFP). في محور Z-يقيس عدد الخلايا التعبير عن كل صحافي وكميا على أنها خطوط التساوي كفاف لطائرة عمودية من ورقة. وكان عدد من الأحداث رصدها في هذه التجربة 50،000 الأحداث. لوحة العلوي الأيسر يعرض السيطرة على مضان خلفية إيواء أي جينات بروتين فلوري. لوحة اليمنى يكشف subpopulation من المنتجين surfactin في القناة مضان YFP (مؤطر باللون الأصفر) باستخدام واحد المسمى سلالة P-srfAA YFP. اليسار لوحة أسفل يكشف subpopulation من المنتجين مصفوفة في القناة مضان CFP (مؤطر بالأزرق) باستخدام سلالة واحدة، وصفت P-CFP تابا. المزدوج المسمى سلالة P تابا </ ويتم رصد EM-> CFP، P-srfAA YFP في لوحة الأيمن السفلي. وأظهر أن اثنين من القطعان التي تم تأطيرها في الأصفر والأزرق. وقد تم تكييف هذا الرقم من وآخرون لوبيز.، الجينات والتنمية (2009) 23 :1631-1638.

الشكل 10
الرقم 10. وتعرض الكمي لsubpopulation من المنتجين المصفوفة وأكلة لحوم البشر باستخدام 3-D التدفق الخلوي. إشارة الإسفار من القنوات رصدها في محور X (لYFP) ومحور Y (لCFP). وكان عدد من الأحداث رصدها في هذه التجربة 50.000. لوحة اليمنى يكشف subpopulation من أكلة لحوم البشر في قناة مضان YFP (مؤطر باللون الأصفر) في سلالة واحدة، وصفت P-SKF YFP. اليسار لوحة أسفل يكشف subpopulation من المنتجين مصفوفة في القناة مضان CFP (مؤطر باللون الأزرق) في سلالة واحدة، وصفت P-CFP تابا. دouble المسمى أظهرت السلالة P-CFP تابا، P-SKF YFP واحد فقط من الخلايا في subpopulation مائل إلى X و Y محاور (مؤطر في الخضراء). تم الكشف عن هذه subpopulation في القناة YFP وCFP لأنه يعبر عن اثنين من الصحفيين في وقت واحد. لوبيز وآخرون، الجينات والتنمية (2009) 23 :1631-1638.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

حقيقة أن المجتمعات البكتيرية تظهر مجموعات سكانية فرعية من الخلايا معربا عن مجموعة محددة من الأدلة الجينات تعقيد المجتمعات الميكروبية 33،34. يجب أن هذا البروتوكول يساعد على تحديد ما إذا كان يقتصر على التعبير عن أي الجينات التي تهم جزء من السكان خاصة من خلايا متخصصة داخل المجتمع الميكروبية. تصور هذه القطعان يتطلب تطوير تقنيات جديدة، وذلك لأن الطرق التقليدية لمراقبة التعبير الجيني أو ميكروأري معدل تحليل مستويات التعبير الجيني للمجتمع كله الجراثيم والتقلبات في التعبير الجيني داخل المجتمع الميكروبية ويتم تفويت عموما.

مضان المجهر والتدفق الخلوي مكملا مثاليا لتحليل أنواع الخلايا لتوفير مزيج من النوعية والكمية التي ستحدد من subpopulation من الفائدة. القيود المفروضة على كل من التقنيات جعلها من الضروري الإشارة إلى بعضها البعض من أجل ال(ه) من اجل دقة القياسات. في حالة مضان المجهر، لشدة الإشارة من الخلايا فلوري (وأحيانا حجم subpopulation) يختلف باختلاف وقت التعرض تستخدم لإثارة العينات (عادة بين 50 و 200 ميللي ثانية). في حالة من التدفق الخلوي ومع ذلك، فإن صغر حجم الخلايا البكتيرية يحد من الكشف ولا يمكن رصد بعض البكتيريا يمكن. بسبب القيود المفروضة على حجم الخلية، وإشارة مضان المنبعثة من الصحفيين يجب أن تكون مرتفعة بما يكفي للسماح للكشف عن ومضان، وتحديدا بسبب هذا، لدينا مشاكل من ذوي الخبرة في الكشف عن الخلايا معربا عن صحفيين مع مستوى منخفض التعبير. ومع ذلك، cytometers تدفق الجديدة تأتي الآن مع حد اكتشاف أكثر حساسية، والذي يسمح لنا بمراقبة السكان البكتيرية بطريقة أكثر دقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع حساسية في حد الكشف تسمح لنا فحص للفرز الخلية، لعزل الخلايا subpopulation نحن ينتيريستيد في وإجراء تحليل الجينات التعبير في هذا subpopulation خاص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

ويتم تمويل هذا العمل من قبل برنامج محقق بحوث الشباب، من مركز أبحاث الأمراض المعدية (ZINF) من جامعة فورتسبورغ. C-خوان غارسيا بيتانكور، وهو زميل الدكتوراه من كلية الدراسات العليا في علوم الحياة (GSLS) من جامعة فورتسبورغ.

References

  1. Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
  2. Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
  3. Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
  4. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  5. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
  6. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
  7. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  8. Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
  9. Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
  10. O'Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
  11. Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
  12. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
  13. Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
  14. Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
  15. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
  16. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
  17. Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
  18. Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
  19. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
  20. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  21. Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  22. Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
  23. Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
  24. Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
  25. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
  26. Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
  27. Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. Wiley. (1990).
  28. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
  29. Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
  30. Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
  31. Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
  32. Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
  33. Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
  34. Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).
وحيد الخلية تحليل<emالعصوية الرقيقة></em> الأغشية الحيوية باستخدام المجهر الإسفار والتدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).More

Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter