单细胞分析枯草芽孢杆菌生物膜，用荧光显微镜和流式细胞仪

Summary

微生物生物膜一般由专门的细胞不同亚群构成。这些亚群的单细胞分析需要使用荧光记者。在这里，我们描述了一个协议，以可视化和监视几个subpopulationswithin

Abstract

几乎所有的细菌^1-6生物膜的形成是一个普遍的属性。当细菌形成生物膜，包裹在细胞外基质，大多在^7-10的其他因素所构成的蛋白质和胞外多糖，。包裹内生物膜的微生物群落，往往显示^11-17专门的细胞不同亚群的分化。这些亚群共存，并常常表现出时间和空间内的生物膜^18-21组织。

在模式生物的枯草芽孢杆菌的生物膜的形成需要专门的细胞不同亚群的分化。其中，亚矩阵生产商，负责产生和分泌的生物膜的细胞外基质是必不可少的生物膜形成^11,19。因此，矩阵生产者的分化是生物膜形成的标志在 B 枯草。

我们使用荧光记者可视化和量化亚矩阵生产者B 的生物膜枯草 ^{15,19,22-24。}具体来说，我们观察到亚矩阵生产者自产外信号表面活性²⁵存在区别。有趣的是，表面活性是由亚矩阵生产者¹⁵不同的专门细胞亚群。

我们已详列于本报告必要的技术方法，可视化和量化矩阵生产者和表面活性生产者在枯草杆菌生物膜亚群。要做到这一点，基质生产和生产表面活性所需的基因插入染色体B 的荧光记者枯草 。记者们表示，只有在一个专门的细胞亚群。然后，亚能监测用荧光显微镜和流式细胞仪（见图1）。

专门的细胞不同亚群内的细菌多细胞群落共存的事实给了我们一个不同的角度对原核生物的基因表达调控。该协议解决了这一实验现象和它可以很容易地适应任何其他的工作模式，以澄清在微生物群落的基本表型异质性的分子机制。

Protocol

1。标签B。枯草和生物膜形成实验

1. 通过PCR扩增感兴趣的基因的启动子区域。我们的P _TAPA，负责生产的的TASA基质蛋白²⁶基因启动子的克隆为例。克隆带够_TAPA到pkm008向量（Rudner实验室，哈佛医学院，波士顿，美国）（图2）。
2. 线性质粒，通过消化酶（酶建议，XhoI位）。
3. 在 B诱导自然能力枯草芽孢杆菌菌株按照协议，先前由Harwood一步切割²⁷ 168。
4. 添加到文化主管细胞的线性质粒和两个小时的潜伏期后，奇霉素抗性选择。
5. 株获得插入到B 的的中性amyE轨迹的构造双重组枯草芽孢杆菌 （图4）。要创建双标记菌株，融入中性轨迹LACA使用的质粒pDR183我们在图3中给出的第二个记者。插入记者，以上我们描述了克隆的记者在pKM008的插入使用相同的技术。
6. 记者从168菌株转移到NCIB3610是能够形成生物膜。使用SPP1噬菌体转导的协议^28,29。在TY培养基增长捐助株（LB +10 mM的硫酸镁₄ +10微米硫酸锰_4）。混合培养液100μL噬菌体股票稀释200。孵育30分钟后加入3毫升软琼脂，并允许噬菌体光晕出现在37°C。
7. 收集软琼脂。离心机，并通过上清认为注射器0.22微米的过滤器。使用此上清感染在TY培养基上生长的受体菌株的文化。加入30微升至10毫升稀释的文化1:10。孵育30分钟和24小时的潜伏期后选择抗生素耐药性。
8. 硒LECT殖民地和37一夜之间生长在LB°C。
9. 坚实的生物膜诱导MSgg的1.5％，琼脂³⁰介质上，发现3μL过夜培养。让细胞在72小时生长在30°C（图3）。经过三天的增长，琼脂表面的表面的MSgg琼脂上形成的生物膜开发一个复杂的形态结构。

2。生物膜分散和细胞固定

1. 表面，MSgg琼脂用牙签或镊子取出生物膜形式。生物膜的一致性，应该让你在一块琼脂表面剥离它。
2. 将在3毫升PBS缓冲生物膜和分散通过吸管或针头重复通过生物膜。此外，生物膜可以用温和的超声分散。轻度超声需要12个脉冲输出3和0.7秒的幅度。
3. 修正样品前单细胞分析。 resuspenD 300μL 整整七分钟，在4％多聚甲醛溶液，室温孵育1毫升细胞悬液。
   4％多聚甲醛溶液的组成：
   2克多聚甲醛
   PBS缓冲液50毫升
   4μL为10 N氢氧化钠
   过滤的解决方案，通过0.22微米的过滤器和等分
4. 洗净后，PBS缓冲液中的固定三次的细胞和悬浮在300μLPBS缓冲。

3。荧光显微镜

1. 倒入200μL琼脂糖显微镜幻灯片0.8％，并仔细盖上另一张幻灯片。 2分钟后取出上层幻灯片，轻轻地获得琼脂糖层底部的幻灯片。
2. 现货2μL琼脂糖层表面上的固定细胞，用显微镜盖玻片覆盖。
3. 放置在荧光显微镜的样品。我们用荧光显微镜徕卡DMI6000B与徕卡CRT6000 iIluminat的装备离子系统。 YFP的过滤器例如：BP500/20，EM：BP535/30和CFP资格的防爆：BP426/20，EM：480/40
4. 公开您的样本 50-200毫秒之间激发荧光。设置激发期内根据阴性对照，这表明在实验选定的条件没有荧光。
5. 有关荧光形象与明亮的领域获得相同的图像。合并在一张照片中的两个图像。从流荧光显微镜用单标记的应变窝藏记者带够_TAPA-YFP的代表在图6得到的结果。

4。单细胞用流式细胞仪定量

1. 固定细胞，用温和的超声分散的样品。超声波清洗的样品进行5 2系列12脉冲输出和0.7秒的幅度，分散成单个细胞团块，而导致细胞裂解。通过光镜确认细胞扩散的效率。 流式细胞仪分析前的样品在PBS缓冲液稀释1:100。我们用流式细胞仪的BD流式细胞仪广东第二。对于YFP的荧光，再加上530/30日过滤器使用488纳米的激光激发。对CFP荧光，再加上一个408/40过滤器使用405纳米的激光激发。
2. 流式细胞仪机校准与两个阴性对照。 PBS的细胞悬浮液中没有缓冲区的样本应作为负粒子的大小，流式细胞仪检测到控制。与记者无荧光标记的样本应作为阴性对照的荧光，流式细胞仪灵敏度。
3. 将与记者在流式细胞仪的荧光标记的样本。对于每个样本，分析至少50000之间的300和3000事件每秒的流量事件。
4. 使用流式细胞仪，DIVA软件（BD Biosciences公司）采集数据和分析它使用FlowJo 8.5.2软件。是指荧光信号，表明控制没有荧光。
5. 目前监测的数据在两轴图形应变单标记的荧光信号。绘制在X轴和表达的荧光在Y轴的不同层次的细胞数量检测荧光信号。用单标记的应变窝藏记者带够_TAPA-YFP的代表在图8流式细胞仪分析得到的结果。
6. 提出的双标在三个轴的平面应变监测荧光信号的数据。画出每一个在X和Y轴（例如，GFP将在X轴和Y轴CFP资格测量）监测通道的荧光信号。情节细胞表达每个记者和呈现轮廓等值线，这将是垂直于平面的纸张（图9和10），在Z轴。

4。代表结果

当B。枯草增长一盘的B观察3天的潜伏期后，在30°C ³⁰ iofilm诱导培养基MSgg的生物膜形成。生物膜显示了很强的一致性，它可以在一块琼脂表面去皮。此外，生物膜，显示了一个复杂的形态结构是指示鲜明参与细胞亚群（图5）。例如，在细胞外基质在殖民地表面上的皱纹形成的生物膜结果。此功能可与矩阵生产者¹⁹亚群的分化。同样，提高生物膜表面上的天线结构是表明sporulating细胞亚群的存在，因为孢子在这些结构³⁰心尖区本地化。

细胞分化的可视化的例子，在一个单标记和双标记的菌株，用荧光显微镜ŕepresented在图6和7，分别为。单标记的应变藏着荧光记者带够_TAPA-CFP资格是在基质细胞亚群表示。这种亚群是负责产生和分泌细胞外基质构成生物膜（图6）。双标记菌株窝藏记者带够²⁶ _TAPA-CFP资格和额外的记者带够_srfAA-YFP的^31。这第二个记者，允许监视亚细胞负责分泌的信号分子的表面活性，从而触发信号级联矩阵生产者的分化（图7）。亚群矩阵生产者都是假的蓝色，而亚表面活性生产者是假的黄色。

流式细胞仪分析用单标记的应变窝藏记者带够_TAPA-YFP的图8。未经处理的对照菌株不包庇任何荧光蛋白基因，表明一个单一的人口相对低荧光。没带够_TAPA-YFP的非生物膜的诱导条件细胞窝藏区分亚矩阵生产者和整个人口呈相对低的荧光。在生物膜的诱导条件下，具有相对高的荧光的细胞亚群发生，作为一个肩膀观察到²³低相对荧光峰的权利。

从流式细胞仪采用双标记菌株的分析得到的结果表示在图9和10。图9监视矩阵生产者和表面活性生产者使用双标应变带够，磷_srfAA-YFP的_TAPA-CFP资格的亚群。作为背景荧光的控制，我们使用没有窝藏任何荧光蛋白基因的菌株。下一步，我们发现在每个荧光通道，每个亚矩阵生产者和表面活性生产者，使用单标记菌株 S为控制。双标应变带够，磷_srfAA-YFP的_TAPA-CFP资格表明了两个高层次的荧光记者表达的细胞亚群。每个人口诬陷，显示有^15个专门的细胞两个亚群之间的记者表达没有重叠。同样，使用双标流式细胞仪分析应变带够，磷_TAPA-YFP的_SKF-YFP的是在图10。基因SKF记者监视食人族^32，已被描述的协调与亚矩阵生产者²⁴区分亚群的分化。在这种情况下，双标应变单一的表达YFP的和CFP的荧光细胞亚群。这表明，无论是协调在同一亚群激活细胞分化途径。

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图1。实验的总体方案。该协议分为三个主要步骤。第一步需要标注B 的应变记者枯草融合，监控亚利益。第二，成长标记菌株在生物膜的诱导条件。第三，分散生物膜，并进行单细胞的人口使用荧光显微镜和流式细胞仪分析。

图2。这个向量的示意图整合载体pKM008的。集成到双重组中性轨迹amyE记者感兴趣的融合。利息_（TAPA）的启动子克隆到使用EcoRI和酶切的酶切位点的载体。然后，CFP基因的表达，是控制下的子带够_TAPA。在orientat离子基因质粒作为一个箭头表示。

图3。这个载体整合载体pDR183示意图。双重组整合到中立位点LACA记者感兴趣的融合。 EcoRI和 BamHI酶切位点克隆到载体利息_（TAPA - CFP）的融合。作为一个箭头表示基因质粒的方向。

图4。记者一体化的计划，到B 的染色体由双重组枯草 。 （一）B （二） 枯草染色体有两个中性位点，amyE和LACA，结合记者的融合，而不影响生物膜的发展。 的基因由双重组枯草 。记者融合集成到中性轨迹在一个稳定的方式。

图5。 B 的生物膜形成枯草 NCIB3610应变B. bioflm形成过程枯草 NCIB 3610时，越来越多在三天的生物膜诱导培养基MSgg的30°C。每12h生物膜发展的连续照片拍摄。

图6。在荧光显微镜下的矩阵生产商亚群的可视化从B 的生物膜样品。 枯草带够_TAPA - CFP是固定的，在荧光显微镜下检查。 200毫秒的荧光激发证明散发高于其他细胞的荧光细胞亚群。我们认为作为基质产生细胞亚群亚群。比例尺为3μm。

图7。从生物膜样品的B. 亚矩阵生产者和荧光显微镜下的表面活性生产者的可视化。 枯草带够_TAPA-CFP供磷_srfAA-YFP双标应变是固定的，在荧光显微镜下检查。 250毫秒证明两个排放高于其他细胞的荧光细胞亚群的曝光时间。一个亚群表达YFP的独家使用YFP的通道（假黄色）检测。这是亚表面活性生产者。另一个亚群表达CFP和它是专门检测在CFP陈荫罴 EL。这是亚矩阵生产者。比例尺为3μm。

图8。量化矩阵生产者使用的2-D流式细胞仪。亚群分散从B 的生物膜的细胞枯草带够_TAPA-YFP进行了监测，用流式细胞仪。流式细胞仪计数50.000事件，每个事件的荧光信号监测。计数细胞数绘制在绘制在X轴Y轴，而YFP的信号强度。在LB培养基中获得细胞生长非生物膜诱发条件。在MSgg媒介获得生物膜诱导条件细胞生长。亚矩阵生产者的区别只在生物膜的诱导条件。这个数字是改编自洛佩斯等。，国家科学院院刊（2009）106 :280-285。

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图9。亚矩阵生产者和表面活性生产者使用的3-D流式细胞仪定量监测通道的荧光信号。在X轴（YFP的）和Y轴（CFP资格）。 Z轴测量细胞表达每个记者的数量，并进行量化轮廓等值线垂直的平面纸张。在这个实验中监视的事件数量为50.000事件。左上小组提出的背景荧光窝藏无荧光蛋白基因的控制。右上面板检测亚表面活性生产者YFP的荧光通道（黄色框），使用一个单一的标记菌株带够_srfAA YFP的。左下角面板检测亚矩阵生产者使用单一标记的应变带够_TAPA-CFP资格CFP荧光通道（蓝 ​​色框）。双标记的应变带够_TAPA </ EM> CFP资格，磷_srfAA-YFP的监测在右下角面板。它表明在黄色和蓝色镜框的两个亚群。这个数字是改编自洛佩斯等 ，基因和发展（2009）23 :1631-1638。

图10。量化矩阵使用的3-D流式细胞仪的生产商和食人族亚群的监测通道的荧光信号。在X轴（YFP的）和Y轴（CFP资格）。在这个实验中监视的事件数量为50.000。右上面板检测亚YFP的荧光通道（黄色框）在一个单一标记的应变带够_SKF-YFP的食人族。左下角面板检测基质生产者的亚单标记的应变带够_TAPA-CFP资格CFP荧光通道（蓝 ​​色框）。在Double标记应变带够，磷_SKF-YFP的_TAPA-CFP资格显示对角线的X和Y轴（绿色框）只有一个细胞亚群。这亚群检测YFP的渠道和CFP，因为它同时表示，两名记者。洛佩斯等，基因和发展（2009）23 :1631-1638。

Discussion

事实上，细菌群落表明细胞亚群的表达一组特定的基因证据^33,34微生物群落的复杂性。本议定书应帮助，以确定是否对任何感兴趣的基因的表达仅限于微生物群落，特别是一个专门的细胞亚群。这些亚群的可视化需要新技术的发展，因为传统的方法来监测基因表达微阵列基因表达分析率水平，整个微生物群落内的微生物群落的基因表达的波动一般失手。

荧光显微镜和流式细胞仪补充理想的细胞类型的分析提供了定性和定量相结合，将确定亚利益。这两种技术的限制，使他们必要的参考日至对方é为了测量精度。在荧光显微镜，荧光细胞（有时亚群的大小）的信号强度的变化取决于用来激发样品（一般在50到200毫秒）的曝光时间。但流式细胞仪的情况下，细菌细胞的体积小，限制了检测和某些细菌不能被监视。由于单元尺寸的限制，记者发出的荧光信号应该高到足以使荧光检测，并正因为这样，我们在检测细胞表达与低表达水平的记者遇到了问题。然而，新的流式细胞仪现在是一个比较敏感的检测限，这使我们能够在更精确地监测中的细菌种群。此外，在更高的灵敏度，检出限将让我们检测细胞分选，分离出的细胞亚群，我们INTERES特德在这个特定的亚群进行基因表达分析。