Summary
电化学技术措施，通过检测自发多巴胺的氧化产生的氧化电流从一个单细胞多巴胺的释放。同时钳位电压和安培的方法揭示了整体的“活动”，这种活动对多巴胺的反向运输的多巴胺转运体的调节作用机理之间的关系。
Abstract
其释放到突触间隙，多巴胺后发挥其生物学特性，通过其前和突触后的目标1。的多巴胺信号被终止通过扩散2-3，胞外酶4，和膜转运5。位于周边的多巴胺神经元的突触间隙的多巴胺转运蛋白，清除释放的胺通过向内多巴胺通量（吸收）。多巴胺转运蛋白也可以在相反的方向，在这个过程被称为向外输送或流出的多巴胺5从内到外释放胺。 20余年前，苏尔寿等。报道，多巴胺转运可以工作在两种模式的活动：向前（吸收）和反向（流出）5。通过外排通过释放神经递质转运到细胞外空间移动大量的多巴胺，并已被证明发挥重要的调控作用，在细胞外多巴胺Ĥomeostasis 6。在这里，我们描述了如何同时膜片钳和安培法记录膜电位被控制以毫秒的时间分辨率时，通过外排机制，可用于测量释放多巴胺。对于这一点，使用Axopatch 200B中放大器（Molecular Devices公司，用一个低通贝塞尔滤波器组在1,000 Hz的全细胞电流记录），全细胞电流和氧化（电流）信号是同时测量的。对于记录的碳纤维电极的安培法连接到第二放大器（Axopatch 200B中），被置于相邻的质膜，并保持在700毫伏。可以被记录的全细胞和氧化的电流（安培），可以使用一个电压阶跃协议生成的电流 - 电压关系。不同于通常安培校准，需要转换为浓度，电流被直接报告，而不考虑的有效容积7。因此，所得到的数据代表一个下限多巴胺流出，因为有些发射机失去本体溶液。
Protocol
1。设备和用品
- 安装一个法拉第笼顶部的抗振动台（TMI），以减少背景噪音。
- 的同时膜片钳安培的记录系统需要一个倒置显微镜具有优良的DIC的光学元件和长工作距离镜头。连接到汽车电池的显微镜灯塔。这个直流系统的光源，用于将进一步降低的电噪声。
- 液压的微操纵（锡斯基尤）进一步降低噪音。在我们的配置中，我们使用的全细胞记录，用右手的机械手和左手为安培。
2。准备电极记录
- 拉块电极使用石英移液管上的P-2000拉出器（萨特）。我们的拉持续约5秒后，用两个热循环。在我们的全细胞膜片吸液管，这导致加热时间一致电阻（MΩ3-4）。
- 填充电极与所述液含2 mM多巴胺，它安装于正确的机械手。保持的吸移管溶液包含DA用铝箔包裹的容器。请在冰上。多巴胺是可氧化。保持溶液在冰上，避光将减少多巴胺的氧化速率。
- （大矸）一个ProCFE低噪声的碳纤维安培电极，轻轻取下的储物盒，填充与汞，安装到安培适配器（在图1所示），然后安装在右边maniupulator。保护免受损害的碳纤维的前端保持的碳纤维的远端。实验室显微镜检查电极的前端，以确保清洁完整。
- 检查通过把包含外部溶液的玻璃底培养皿中的电极的安培电极的完整性。记录的基准电流，在没有多巴胺。添加10微升的为1mm DA解决方案的菜。一个很好的安培电极重帘线的氧化电流的增加。重复此步骤，在每一个实验的开始和结束，使若干安培电极工作正常。
3。准备主设计，以表达多巴胺转运体的玻璃底培养皿或细胞的多巴胺神经元的神经细胞培养
- 轻轻洗细胞或多巴胺神经元的3倍，温暖的外部解决方案。
- 安装玻璃底培养皿，在显微镜阶段。
4。可视化细胞进行实验
- 找到正确的焦点，清晰地可视化的细胞。将贴片电极上的正压力。然后，轻轻地使两个电极下降到溶液中，并靠近细胞。
- 旁边的小区（在左侧），和在右边的贴片电极安培电极的位置。
- 对细胞的修补电极达到一个gigaohm的密封。破裂的密封与吸实现整个单元的配置。
- 允许5-8分钟含多巴胺进入细胞内部溶液用于透析。
- 使用所需电压台阶或斜坡协议。同时采集数据而膜电位的补丁移液管通过控制从两个补丁移液器和安培电极测量全细胞电流和反向多巴胺通过多巴胺转运蛋白运输。
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Representative Results
组合膜片钳与安培法可以测量电压依赖性DAT介导的DA流出。 图2A示出有代表性的实验配置和记录DAT介导的DA流出当细胞内以及独特的膜电位，通过全细胞膜片移液器夹紧。使用这种技术，细胞表达YFP-DAT蛋白的电压钳位与全细胞膜片移液器而安培电极被放置到质膜（ 图2A）。整个电池用电极的填充用移液管溶液含有2mM DA。安培触摸质膜的电极被保持在700毫伏，大于DA的氧化还原电位的电位。 DAT介导的电流（全细胞图2C和安培图2D）所记录的全细胞的移液管从-40 mV时保持电位（ 图2B中的膜之间的电压-60和+100 mV的步进图2D）中的安培电流对应的DA向外的磁通。远离修补程序移动的碳纤维导致的氧化反应变得更小和更慢。正如预期的那样用于DA氧化，氧化反应降低到+300 mV时，碳纤维的电压降低，并会进一步减少完全消失。 图2E-2F是可接受和不可接受的唱片的代表。 图2E是一紧GΩ的一个例子全细胞的密封件和相应的安培信号。 图2F代表中TS漏水的全细胞膜片。相应的安培记录测量泄漏DA。
图1。电流型电极的制备及组装。轻轻地取出一个ProCFE低噪声的碳纤维安培电极的储物盒，填充汞。准备通过螺纹膜片钳持有人的银线适配器，那么线程将适配器膜片钳持有人，轻轻地电化学电极安装。的碳纤维的前端不应该接触任何东西。
图2。代表全细胞记录在多个电压和安培 （A） 时，膜片微电极是在整个单元配置。卡通说明的实验配置。多巴胺转运蛋白的细胞表达，电压钳位与全细胞膜片移液器而安培电极被放置在靠近细胞膜。氧化的DA结果在积极的安培电流。 （B）插图的钳位电压波形协议。 （C）的DAT-介导的电流通过加强膜之间的电压-60到+100 mV的范围内保持电位-40 mV的全细胞移液管。电极内液中含有2mM的多巴胺，如前所述7-9。 （D）收购安培的电流，同时在面板C（上）与全细胞电流。开始时的电压的步骤，对于高于20毫伏的电压，安培电极记录的氧化电流（正），增加的电压的步骤的整个持续时间期间。 （E）和（F）是分别代表可接受和不可接受的全细胞膜片钳实验， 图2E的一个例子是一紧GΩ瓦特细胞孔密封和相应的安培信号。 图2F代表一个漏水的全细胞膜片。密封阻力达到MΩ范围，而不是GΩ之前或之后打破进入细胞内，实现全细胞模式。相应的amperomtric记录测量泄露DA。 点击此处查看大图 。
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Discussion
同时电压钳位和安培法有以下好处。所有类型的细胞都可以访问的，并且可以被用于记录。录音完成后的细胞或神经元的鉴定是简单明了的。特别是，如果该信元被加入荧光标记的兴趣蛋白质的荧光标记的实验者可以很容易地选择目标细胞或神经元。的实验配置允许的药物制剂的均匀和受控的交付，通过修补程序移液管，或通过加入这些试剂的浴溶液10。在同时膜片钳安培的技术允许不同的渠道和运输的作用，可氧化的发射器释放的调查毫秒级的时间分辨率，而膜 电位控制。不能获得相同的信息，通过生物 化学方法8。这引道的独特方面之一h是，它允许通过修补程序吸管7,11通过透析细胞内环境中的操纵。然而，该技术具有这样的缺点，安培电极可以仅检测可氧化发射机。此外，在存在大量基肥，可氧化化合物的自发释放的安培电极的灵敏度降低，因此，测量后的释放，例如，预压的可氧化的化合物]是自发释放，可以制作在减少氧化电流。这种技术的主要缺点是技术的专业知识和昂贵的设备的要求。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们博士Sanika奇鲁瓦的严格审查本手稿。这项工作是由美国国立卫生研究院（DA026947，DA021471，NS071122）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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