Summary
La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale "attività" del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.
Abstract
Dopo il suo rilascio nella fessura sinaptica, la dopamina esercita le sue proprietà biologiche attraverso i suoi obiettivi di pre-e post-sinaptica 1. Il segnale dopamina è terminata da diffusione 2-3, enzimi extracellulari 4, e trasportatori di membrana 5. Il trasportatore della dopamina, che si trova nel peri-sinaptico dei neuroni dopaminergici cancella le ammine rilasciate attraverso un flusso di dopamina verso l'interno (assorbimento). Il trasportatore della dopamina può funzionare anche in senso inverso per liberare ammine dall'interno verso l'esterno in un processo chiamato di trasporto verso l'esterno o l'efflusso di dopamina 5. . Più di 20 anni fa Sulzer et al hanno riportato il trasportatore della dopamina può operare in due modi di attività: in avanti (assorbimento) e la retromarcia (efflusso) 5. Il neurotrasmettitore rilasciato tramite efflusso attraverso il trasportatore può spostare una grande quantità di dopamina nello spazio extracellulare, e ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolamentazione dopamina extracellulare homeostasi 6. Qui si descrive come patch clamp e registrazione simultanee amperometria può essere utilizzato per misurare dopamina rilasciata attraverso il meccanismo di flusso con risoluzione temporale millisecondo quando il potenziale di membrana è controllata. Per questo, cellule intere correnti e ossidativo (amperometrico) segnali sono misurati simultaneamente utilizzando un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, con un passa-basso insieme filtro di Bessel a 1.000 Hz per cellula intera registrazione corrente). Per amperometria registrazione di un elettrodo in fibra di carbonio è collegato ad un secondo amplificatore (Axopatch 200B) ed è posto adiacente alla membrana plasmatica e mantenuto a 700 mV. Le cellule intere e ossidativo (amperometrico) correnti possono essere registrati e la relazione corrente-tensione possono essere generati utilizzando un protocollo di tensione di fase. A differenza della calibrazione solita amperometrico, che richiede la conversione alla concentrazione, la corrente viene riportato direttamente senza considerare il 7 effettivo volume. Così, i dati risultantirappresentano un limite inferiore di efflusso dopamina perché alcuni trasmettitore è perso alla soluzione bulk.
Protocol
1. Attrezzature e Forniture
- Montare una gabbia di Faraday sopra il tavolo antivibrazione (TMI) per diminuire il rumore di fondo.
- La simultanea patch clamp sistema amperometria di controllo richiede un microscopio invertito con eccellenti ottiche DIC e una lente lunga distanza di lavoro. Collegare il microscopio faro di una batteria per auto. Questa sorgente luminosa DC per il sistema diminuirà ulteriormente il rumore elettrico.
- Micromanipolatori idraulici (Siskiyou) ulteriore riduzione del rumore. Nella nostra configurazione, utilizziamo un manipolatore di mano destra per la registrazione cellula intera, e la sinistra ha consegnato per amperometria.
2. Preparare Elettrodi di registrazione
- Tirare elettrodi di patch utilizzando pipette quarzo su un P-2000 estrattore (Sutter). La trazione dura circa 5 secondi, con due cicli termici. Questa volta il calore ha portato a resistenza costante (3-4 MW) nei nostri pipette patch di cellule intere.
- Riempire l'elettrodo con l'Aggiunta della soluzione contenente 2 mM dopamina e montarlo sul manipolatore destro. Avvolgere il contenitore che contiene la soluzione di pipetta contenente DA con un foglio di alluminio. Tenere su ghiaccio. La dopamina è ossidabile. Mantenendo la soluzione in ghiaccio, protetto dalla luce diminuirà il livello di ossidazione della dopamina.
- Rimuovere delicatamente un (Dagan) ProCFE basso tenore di carbonio elettrodo amperometrico rumore fibra dal contenitore, riempire con il mercurio, per montaggio su scheda amperometrica (come illustrato nella figura 1), e poi montare sulla maniupulator destra. Proteggere la punta della fibra di carbonio da danni tenendo l'estremità della fibra di carbonio. Ispezionare l'elettrodo con un microscopio di laboratorio per garantire la punta è pulito e intatto.
- Esaminare l'integrità del elettrodo amperometrico ponendo l'elettrodo in una capsula di Petri di vetro inferiore contenente soluzione esterna. Registrare una corrente di base in assenza di dopamina. Aggiungere 10 ml di una soluzione 1 mM DA al piatto. Un re buon elettrodo amperometricocavi di un aumento nella corrente ossidativo. Ripetere questo passo all'inizio e alla fine di ciascun esperimento per rendere certa la elettrodo amperometrico funziona correttamente.
3. Preparare la coltura primaria neuronale dei neuroni dopaminergici o di cellule ingegnerizzate per esprimere il vettore della dopamina di stoviglie fondo di vetro Petri
- Lavare delicatamente le cellule o neuroni dopaminergici tre volte con soluzione esterna calda.
- Montare il fondo piatto di vetro Petri sul palco microscopio.
4. Visualizza cellulare ed esecuzione Experiment
- Trova il punto focale corretta di visualizzare chiaramente le cellule. Posizionare pressione positiva sull'elettrodo patch. Poi, delicatamente portare entrambi gli elettrodi giù nella soluzione, e vicino alla cella.
- Posizionare l'elettrodo amperometrico accanto alla cella (a sinistra), e l'elettrodo cerotto sulla destra.
- Realizzare un sigillo gigaohm sulla cella con l'elettrodo patch. La rottura del sigillo mediante aspirazioneottenere la configurazione a cellula intera.
- Consentire 5-8 min per dialisi della soluzione interna contenente dopamina nella cella.
- Utilizzare desiderato gradino di tensione o protocollo rampa. Acquisire simultaneamente i dati sia la pipetta patch e l'elettrodo amperometrico per la misura di correnti a cellule intere e invertire trasporto di dopamina attraverso il trasportatore della dopamina, mentre il potenziale di membrana è controllata tramite la pipetta patch.
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Representative Results
Patch clamp combinato con amperometria può misurare tensione-dipendente DAT-mediata DA efflusso. Figura 2A mostra una configurazione rappresentativa sperimentale e registrazione DAT-mediata DA efflusso quando l'ambiente intracellulare e il potenziale di membrana sono serrati da una cellula intera pipette patch. Usando questa tecnica, cellule esprimenti YFP-DAT proteine sono in tensione fissata con una pipetta intero cerotto cellule mentre un elettrodo amperometrico viene posto sulla membrana plasmatica (Figura 2A). L'elettrodo a cellula intera è riempita con una soluzione contenente 2 mM pipetta DA. L'elettrodo amperometrico toccare la membrana plasmatica è tenuto a 700 mV, un potenziale maggiore del potenziale redox della DA. DAT-mediate correnti (whole-cell-Figura 2C e amperometrica-Figura 2D) sono registrati, intensificando la cellula intera pipetta ad un potenziale di membrana tra -60 e +100 mV da un potenziale di mantenimento di -40 mV (Figura 2B Figura 2D) nelle correnti amperometrici corrisponde ad un flusso verso l'esterno di DA. Spostare la fibra di carbonio dal cerotto provoca la reazione ossidativa a diventare più piccoli e più lento. Come previsto per ossidazione DA, la risposta ossidativo diminuisce quando la tensione in fibra di carbonio è ridotto a 300 mV e scomparirà completamente sulla ulteriore riduzione. Figura 2E-2F sono rappresentativi di registrazioni accettabili e inaccettabili. Figura 2E è un esempio di una stretta GΩ whole-cell guarnizione e il corrispondente segnale amperometrico. Figura 2F rapprets un leaky whole-cell patch. La registrazione corrispondente amperometrico misura trapelato DA.
Figura 1. Preparazione e montaggio di elettrodo amperometrico. Delicatamente rimuovere un ProCFE basso tenore di carbonio elettrodo amperometrico rumore fibra dal contenitore, riempire con mercurio. Preparare l'adattatore filettando il filo d'argento nel supporto patch clamp, quindi infilare l'adattatore sul supporto patch clamp e delicatamente montare l'elettrodo amperometrico. La punta della fibra di carbonio non deve toccare nulla.
Figura 2. Rappresentante registrazione whole-cell e amperometrica a tensioni più quando la pipetta patch è in configurazione whole-cell. (A) illustra la configurazione Cartoon sperimentale.Cellule esprimenti trasportatore della dopamina sono stati serrati con una tensione a cellula intera pipette patch mentre un elettrodo amperometrico è posto vicino alla membrana cellulare. L'ossidazione dei risultati DA in una corrente positiva amperometrico. (B) Illustrazione del protocollo di tensione morsetto forma d'onda. (C) DAT-mediate correnti registrate intensificando la tensione membrana tra -60 e +100 mV da un potenziale di mantenimento di -40 mV con la cellula intera pipetta. La soluzione pipetta conteneva 2 mM dopamina, come descritto in precedenza 7-9. (D) La corrente amperometrico acquisite simultaneamente l'intera-cella corrente rappresentato in pannello C (sopra). All'inizio del gradino di tensione, per tensioni superiori a 20 mV, i record elettrodo amperometrico una corrente di ossidazione (positivo) che aumenta durante l'intera durata del gradino di tensione. (E) e (F) sono rappresentativi di esperimenti di patch accettabili e inaccettabili cellule intere clamp, rispettivamente. Figura 2E è un esempio di una stretta GΩ whole-Guarnizione della cella e il corrispondente segnale amperometrico. Figura 2F rappresenta un leaky whole-cell patch. La resistenza del sigillo raggiunto MW intervallo anziché GΩ prima o dopo rottura nella cella per ottenere cellule intere modalità. La registrazione corrispondente amperomtric misura trapelato DA. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Simultanea voltage-clamp e amperometria offre i seguenti vantaggi. Tutti i tipi cellulari sono accessibili e possono essere utilizzati per la registrazione. L'identificazione delle cellule o dei neuroni in cui sono fatte le registrazioni è semplice e lineare. In particolare, se la cella è marcato in modo fluorescente aggiungendo un tag fluorescente per la proteina di interesse sperimentatore può facilmente selezionare la cella di destinazione o neurone. La configurazione sperimentale consente un'erogazione uniforme e controllato di agenti farmacologici o tramite la pipetta patch, o per aggiunta di questi agenti per la soluzione del bagno 10. La tecnica del patch clamp simultanea amperometria consente indagine sul ruolo dei diversi canali e trasportatori sul rilascio del trasmettitore ossidabile con risoluzione temporale millisecondo mentre la membrana potenziale è controllato. Le stesse informazioni non possono essere ottenute mediante metodi biochimici 8. Uno degli aspetti unici di questo approach è che permette la manipolazione dell'ambiente intracellulare mediante dialisi tramite la pipetta cerotto 7,11. Tuttavia, questa tecnica ha lo svantaggio che l'elettrodo amperometrico può rilevare solo trasmettitori ossidabili. Inoltre, la sensibilità del elettrodo amperometrico diminuisce in presenza di sostanziale basale, rilascio spontaneo di un composto ossidabile, quindi, la misurazione del rilascio dopo, per esempio, precarico di un composto ossidabile che viene spontaneamente liberato può produrre una diminuzione della ossidativo corrente. Il principale svantaggio di questa tecnica è il requisito di competenze tecniche e attrezzature costose.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Sanika Chirwa per la revisione critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DA026947, DA021471 e NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
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