Summary
Den amperometriska tekniken mäter dopaminfrisättning från en enda cell genom att detektera den oxidativa ström som produceras av spontan dopamin oxidation. Samtidig spänning klämma och amperometri metodik avslöjar mekanistiska förhållandet mellan den totala "aktivitet" av dopamin transportören och reglerande roll denna aktivitet på baksidan transport av dopamin.
Abstract
Efter dess release i synaptiska klyftan, dopamin utövar sina biologiska egenskaper via sina pre-och postsynaptiska mål 1. Dopamin signalen avslutas genom diffusion 2-3, extracellulära enzymer 4 och transportörer membran 5. Dopamin transportör, som ligger i den peri-synaptiska klyftan av dopaminneuroner rensar de frigjorda aminer genom en inre dopamin flöde (upptag). Den dopamintransportörer kan också arbeta i motsatt riktning för att frigöra aminer från insidan till utsidan på en process som kallas yttre transport eller utflöde av dopamin 5. . Mer än 20 år sedan Sulzer et al rapporterade dopamin transportören kan arbeta i två lägen Verksamhetsområde: framåt (upptag) och omvänd (efflux) 5. Signalsubstansen frigörs via utflöde genom transportören kan flytta en stor mängd dopamin till det extracellulära utrymmet, och har visat sig spela en viktig reglerande roll i extracellulärt dopamin timomeostasis 6. Här beskriver vi hur samtidig patch clamp och amperometri inspelning kan användas för att mäta ut dopamin via effluxmekanism med millisekunders tidsupplösning när membranpotentialen styrs. För detta är hel-cell nuvarande och oxidativ (amperometriska) signaler mätas samtidigt med en Axopatch 200B förstärkare (Molecular Devices, med en låg-pass Besselfiltrets inställd på 1.000 Hz för helcell-aktuell inspelning). För amperometri inspelning en elektrod kolfiber är ansluten till en andra förstärkare (Axopatch 200B) och är placerad intill plasmamembranet och hölls vid 700 mV. De hel-cell-och oxidativ (amperometriska) strömmar kan registreras och ström-spänning relation kan genereras med hjälp av en spänning steg protokoll. Till skillnad från den vanliga amperometriska kalibrering, vilket kräver omvandling till koncentration, visas den aktuella redovisas direkt utan hänsyn till faktiska volymen 7. Således resulterande datautgör en undre gräns till dopamin utflöde eftersom vissa sändaren förlorade mot bulklösningen.
Protocol
1. Utrustning och tillbehör
- Montera en Faradays bur ovanpå anti vibrationsbord (TMI) att minska bakgrundsbruset.
- Den samtidiga patch clamp amperometri inspelning kräver ett inverterat mikroskop med utmärkt DIC optik och en lång arbetsdag avstånd lins. Anslut mikroskopet fyr till ett bilbatteri. Denna DC-ljuskälla för systemet kommer att ytterligare minska elektriskt brus.
- Hydrauliska mikromanipulatorer (Siskiyou) ytterligare minskning buller. I vår konfiguration använder vi en högerhänt manipulator för hela cellen inspelning och vänsterhänt för amperometri.
2. Förbered Elektroder för inspelning
- Dra lappelektroder med kvarts pipetter på en P-2000 avdragare (Sutter). Vår dra varar ungefär 5 sekunder, med två värme cykler. Denna värme tid har resulterat i konsekvent motstånd (3-4 Mohm) i hela vårt pipetter cell patch.
- Fyll elektroden medpipett lösning innehållande 2 mM dopamin och montera den på rätt manipulatorn. Linda behållaren håller pipetten innehållande DA med aluminiumfolie. Håll på is. Dopamin är oxiderbart. Hålla lösningen på is, skyddad från ljus minskar oxidationshastigheten av dopamin.
- Ta försiktigt bort en ProCFE (Dagan) låg ljudnivå kolfiber amperometriskt elektrod från förvaringsbox, fyll med kvicksilver, montera på amperometriska adaptern (som visas i figur 1), och sedan montera på rätt maniupulator. Skydda spets kolfiber från skador genom att hålla den bortre änden av kolfiber. Inspektera elektroden med en labb mikroskop för att säkerställa att spetsen är ren och intakt.
- Undersöka integriteten av den amperometriska elektroden genom att placera elektroden i ett glas botten petriskål innehållande extern lösning. Spela en baslinje ström i frånvaro av dopamin. Tillsätt 10 | il av en 1 mM lösning DA till skålen. En bra amperometrisk elektrod resladdar en ökning av oxidativ strömmen. Upprepa detta steg i början och slutet av varje experiment att göra vissa amperometriska elektroden fungerar.
3. Förbered primära neuronala Kultur dopaminneuroner eller celler för att uttrycka dopamintransportörer i Petri Glass Bottom rätter
- Försiktigt tvätta celler eller dopaminneuroner tre gånger med varm extern lösning.
- Montera glasbotten petriskål på mikroskopets objektbord.
4. Visualisera Cell-och Utför experiment
- Hitta rätt fokus för att tydligt visualisera cellerna. Placera övertryck på plåstret elektroden. Sedan försiktigt föra båda elektroderna ned i lösningen, och nära cellen.
- Placera den amperometriska elektroden intill cellen (på vänster sida), och lappelektroden till höger.
- Uppnå en gigaohm tätning på cellen med lappelektroden. Bristning tätningen med sugning tilluppnå helcells-konfiguration.
- Låt 5-8 min för dialys av intern lösning innehållande dopamin i cellen.
- Använd önskad spänning steg eller ramp protokoll. Samtidigt erhåller data från både fläckpipetten och den amperometriska elektroden för att mäta helcell strömmar och vända transport av dopamin genom dopamintransportören medan membranpotentialen styrs via fläckpipetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinerad patch clamp med amperometri kan mäta spänningsberoende DAT-medierad DA utflöde. Figur 2A visar ett representativt experimentell konfiguration och inspelning av DAT-medierad DA utflöde när den intracellulära miljön och membranpotentialen kläms av en hel-cell patch-pipett. Med användning av denna teknik, celler som uttrycker YFP-DAT proteiner är spännings-fastklämd med en hel cell patch-pipett medan en amperometrisk elektrod placeras på plasmamembranet (fig. 2A). Hela cellen elektroden är fylld med en pipett innehållande 2 mM DA. Den amperometriska elektroden vidrör plasmamembranet hålls vid 700 mV, en potential som är större än redoxpotentialen av DA. DAT-medierade strömmar (hel-cell-Figur 2C och amperometriska-Figur 2D) registreras genom att stega den helcell-pipett till en membran spänning mellan -60 och +100 mV från en hållpotential av -40 mV (Fig. 2B figur 2D) i amperometriska strömmarna motsvarar en yttre flöde av DA. Flytta kolfiber bort från plåstret bringar den oxidativa svaret att bli mindre och långsammare. Som förväntat för DA oxidation, minskar den oxidativa svaret när kolfiber spänningen reduceras till +300 mV och försvinner helt på ytterligare minskning. Figur 2E-2F är representativa för acceptabla och oacceptabla inspelningar. Figur 2E är ett exempel på en tät GΩ helcells-tätning och motsvarande amperometriska signalen. Figur 2F företrädarets en läckande helcells-lapp. Motsvarande amperometriska inspelningen mäter läckt DA.
Figur 1. Förberedelse och montering av amperometrisk elektrod. Försiktigt bort en ProCFE låg ljudnivå kolfiber amperometriskt elektrod från förvaringsbox, fyll med kvicksilver. Förbered adaptern genom att trä den silverfärgade tråden i patch clamp hållaren sedan trä adaptern på patch clamp hållaren och försiktigt montera amperometriska elektroden. Spetsen på kolfiber får inte röra någonting.
Figur 2. Representativ hel-cell och amperometriska inspelning på flera spänningar när plåstret pipetten är i helcells-konfiguration. (A) Cartoon visar den experimentella konfigurationen.Celler som uttrycker dopamintransportörer var spänningen fastklämd med en hel-cell patch-pipett medan en amperometrisk elektrod placerades nära cellmembranet. Oxidationen av DA resulterar i en positiv amperometrisk ström. (B) Illustration av spänning klämma vågform protokollet. (C) DAT-medierade strömmar registreras genom att stega membranet spänningen mellan -60 och +100 mV från en hållpotential av -40 mV med helcell-pipett. Pipetten lösningen innehöll 2 mM dopamin, såsom beskrivits tidigare 7-9. (D) amperometrisk strömmen förvärvade samtidigt med helcell-ström representerad i fält C (ovan). I början av spänningen steg, för spänningar högre än 20 mV, de amperometriska elektroden register en oxidation ström (positiv) som ökade under hela den tid som spänningen steg. (E) och (F) är representativa för acceptabla och oacceptabla helcells-experiment patch clamp, respektive. Figur 2E är ett exempel på en tät GΩ whål-cell tätning och motsvarande amperometriska signalen. Figur 2F visar en läckande helcells-lapp. Tätningen motståndet nådde MQ området i stället för GΩ före eller efter att ha brutit in i cellen för att uppnå helcells-läge. Motsvarande amperomtric inspelningen åtgärder läckt DA. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samtidig spänning-klämma och amperometri har följande fördelar. Alla celltyper är tillgängliga och kan användas för inspelning. Identifieringen av cellerna eller neuron där inspelningarna görs är enkel och okomplicerad. I synnerhet, om cellen är fluorescensmärkta genom tillsats av en fluorescerande markör till proteinet av intresse försöksledaren kan enkelt välja målcellen eller neuron. Den experimentella utformningen medger jämn och kontrollerad tillförsel av farmakologiska medel antingen via fläckpipetten, eller genom tillsats av dessa medel till badlösningen 10. Den samtidiga patch clamp amperometri teknik tillåter undersökning av vilken roll olika kanaler och transportörer på release av oxiderbara sändare med millisekunders tidsupplösning medan membranet potentialen kontrolleras. Samma information kan inte erhållas genom biokemiska metoder 8. En av de unika aspekterna av denna approach är att det tillåter manipulering av den intracellulära miljön genom dialys via fläckpipetten 7,11. Emellertid har denna teknik den nackdelen att den amperometriska elektroden kan detektera endast oxiderbara sändare. Dessutom minskar känsligheten hos den amperometriska elektroden i närvaro av väsentlig basala, spontan frisättning av en oxiderbar förening, därmed mätning av frisättning efter, till exempel, förladdning av en oxiderbar förening som spontant frisätts kan producera en minskning i oxidativ ström. Den huvudsakliga nackdelen med denna teknik är kravet på teknisk expertis och dyr utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Sanika Chirwa för kritisk granskning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (DA026947, DA021471 och NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
