Summary
La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d'une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l'ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l'activité sur le transport inverse de la dopamine.
Abstract
Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l'intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique 1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de 2-3, enzymes extracellulaires 4 et transporteurs membranaires 5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l'intérieur vers l'extérieur dans un processus appelé transport vers l'extérieur ou l'efflux de dopamine 5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d'activité: avant (absorption) et inverse (efflux) 5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l'espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis 6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l'enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l'intermédiaire du mécanisme d'efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l'ensemble de la cellule courante et à l'oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l'ensemble des cellules d'enregistrement en cours). Pour l'enregistrement d'une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l'oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l'aide d'un protocole échelon de tension. Contrairement à l'étalonnage d'habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la 7 fois le volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.
Protocol
1. Matériel et fournitures
- Monter une cage de Faraday sur le dessus de la table anti-vibration (TMI) pour diminuer le bruit de fond.
- La pince simultanée correctif d'enregistrement ampérométrie système nécessite un microscope inversé avec d'excellentes optiques DIC et une lentille longue distance de travail. Branchez le microscope phare à une batterie de voiture. Cette source de lumière continue pour le système va encore réduire le bruit électrique.
- Micromanipulateurs hydrauliques (Siskiyou) diminution supplémentaire du bruit. Dans notre configuration, nous utilisons un manipulateur droitier pour l'enregistrement de cellules entières, et le gaucher pour ampérométrie.
2. Préparer électrodes pour l'enregistrement
- Tirez électrodes de patch en utilisant les pipettes de quartz sur un extracteur P-2000 (Sutter). Notre traction dure environ 5 secondes, avec deux cycles thermiques. Cette fois, la chaleur a provoqué une résistance constante (3-4 MQ) dans nos pipettes de patch ensemble de cellules.
- Remplir l'électrode avec l'solution de la pipette contenant 2 mM de dopamine et le monter sur le manipulateur droit. Envelopper le tube contenant la solution contenant DA pipette avec une feuille d'aluminium. Garder sur la glace. La dopamine est oxydable. Garder la solution sur de la glace, à l'abri de la lumière diminue le taux d'oxydation de la dopamine.
- Retirez délicatement un ProCFE (Dagan) électrode basse en fibre de carbone ampérométrique de bruit à partir de la boîte de remisage, remplir avec du mercure, montage sur l'adaptateur ampérométrique (comme le montre la figure 1), puis monter sur le maniupulator droite. Protéger la pointe de la fibre de carbone contre les dommages en maintenant l'extrémité de la fibre de carbone. Vérifiez l'électrode avec un microscope de laboratoire pour garantir la pointe est propre et intacte.
- Examiner l'intégrité de l'électrode ampérométrique en mettant l'électrode dans une boîte de Petri en verre contenant une solution de fond externe. Enregistrer un courant de référence en l'absence de la dopamine. Ajouter 10 ul d'une solution 1 mM DA au plat. Une nouvelle électrode ampérométrique bonnecâblés d'une augmentation du courant d'oxydation. Répétez cette étape au début et à la fin de chaque expérience afin de s'assurer de l'électrode ampérométrique fonctionne correctement.
3. Préparer la culture primaire de neurones à dopamine des neurones ou des cellules modifiées génétiquement pour exprimer transporteur de la dopamine dans les plats de Pétri en verre de fond
- Lavez délicatement les cellules appelées neurones dopaminergiques trois fois avec une solution externe au chaud.
- Monter le fond en verre de Pétri sur la platine du microscope.
4. Visualisez cellulaire et exécuter l'expérience
- Trouver le bon point focal de visualiser clairement les cellules. Exercer une pression positive sur l'électrode de patch. Ensuite, amener doucement vers le bas les deux électrodes dans la solution, et à proximité de la cellule.
- Positionner l'électrode ampérométrique à côté de la cellule (à gauche), et l'électrode de patch sur la droite.
- Réaliser un joint d'étanchéité gigaohm sur la cellule de l'électrode de patch. La rupture du joint avec aspirationatteindre configuration cellule entière.
- Permettre 5-8 min pour la dialyse de la solution interne contenant la dopamine dans la cellule.
- Utiliser désiré échelon de tension ou d'un protocole de rampe. Acquérir simultanément les données provenant à la fois de la pipette de patch et l'électrode ampérométrique pour mesurer les courants de cellules entières et inverser le transport de la dopamine par le transporteur de la dopamine tandis que le potentiel de la membrane est contrôlée par l'intermédiaire de la pipette de patch.
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Representative Results
Patch-clamp combinée avec ampérométrie peut mesurer la tension en fonction de DAT DA induite par efflux. Figure 2A montre une configuration représentative expérimentale et l'enregistrement des DAT DA induite par efflux lorsque le milieu intracellulaire et le potentiel de membrane sont serrées par une pipette de patch de cellule entière. En utilisant cette technique, les cellules exprimant les protéines YFP-DAT sont serrées en tension avec une pipette de patch pendant toute cellule d'une électrode ampérométrique est placée sur la membrane plasmique (figure 2A). L'électrode de cellule entière est remplie d'une solution de pipette contenant 2 mM de DA. L'électrode ampérométrique toucher la membrane plasmatique est maintenue à +700 mV, un potentiel supérieur au potentiel d'oxydo-réduction de DA. DAT à médiation courants (cellules entières et-la figure 2C-ampérométrique figure 2D) sont enregistrés par le renforcement de la pipette à cellules entières à une tension de membrane entre -60 et +100 mV partir d'un potentiel de maintien de mV -40 (figure 2B figure 2D) dans les courants ampèremétriques correspond à un flux vers l'extérieur de la DA. Déplacement de la fibre de carbone loin de le patch provoque la réponse oxydative à devenir plus petits et plus lents. Comme prévu à l'oxydation DA, la réponse oxydative diminue lorsque la tension en fibre de carbone est réduite à +300 mV et disparaîtra complètement sur une réduction supplémentaire. Figure 2E-2F sont représentatifs des enregistrements acceptables et inacceptables. Figure 2E est un exemple d'un GΩ serré à cellules entières d'étanchéité et le signal correspondant ampérométrique. Figure 2F représentationts qui fuit une cellule entière patch. L'enregistrement correspondant ampérométrique mesures fuite DA.
Figure 1. Préparation et assemblage de l'électrode ampérométrique. Retirez délicatement un ProCFE électrode basse de fibre de carbone ampérométrique de bruit à partir de la boîte de remisage, remplir avec du mercure. Préparez l'adaptateur en enfilant le fil d'argent dans le porte-patch-clamp, puis visser l'adaptateur sur le support de patch-clamp et doucement monter l'électrode ampérométrique. L'extrémité de la fibre de carbone ne doit pas toucher quoi que ce soit.
Figure 2. Représentant d'enregistrement à germes entiers et ampérométrique à des tensions multiples lorsque la pipette de patch est en configuration cellule entière. (A) Caricature illustrant la configuration expérimentale.Les cellules exprimant le transporteur de la dopamine ont été serrée avec une tension de pipette de patch-ensemble de cellules tandis que l'électrode ampérométrique est placé à proximité de la membrane cellulaire. L'oxydation des résultats DA dans un courant positif ampérométrique. (B) Illustration de la pince protocole de tension de forme d'onde. (C) DAT médiées par des courants enregistrés pas à pas la tension de la membrane entre -60 et +100 mV partir d'un potentiel de maintien de -40 mV à la pipette à cellules entières. La solution de la pipette contenant 2 mM de dopamine, comme décrit précédemment 7-9. (D) Le courant ampérométrique acquise en même temps que le courant de cellule entière représentée dans le panneau C (ci-dessus). Au début de l'étape de tension, pour des tensions supérieures à +20 mV, les enregistrements d'une électrode ampérométrique courant d'oxydation (positif) qui a augmenté pendant toute la durée de l'étape de tension. (E) et (F) sont représentatifs de l'ensemble acceptables et inacceptables de cellules expériences de patch-clamp, respectivement. Figure 2E est un exemple d'un virage serré avec GΩCellule trou-joint et le signal correspondant ampérométrique. figure 2F représente une fuite de cellule entière patch. La résistance d'étanchéité atteint la plage au lieu de MQ GΩ avant ou après la rupture dans la cellule pour obtenir le mode de cellule entière. L'enregistrement correspondant amperomtric mesures fuite DA. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l'enregistrement. L'identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d'un marqueur fluorescent pour la protéine d'intérêt à l'expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configuration expérimentale permet la livraison uniforme et contrôlée d'agents pharmacologiques ou l'autre par l'intermédiaire de la pipette de patch, ou par addition de ces agents dans la solution de bain 10. La technique du patch clamp ampérométrie simultanée permet l'étude du rôle des différents canaux et des transporteurs sur la libération du transmetteur oxydable avec une résolution temporelle milliseconde tandis que la membrane potentiel est commandé. La même information peut pas être obtenu par des méthodes biochimiques 8. Un des aspects uniques de ce approach est qu'il permet la manipulation de l'environnement intracellulaire par dialyse via la pipette de patch 7,11. Cependant, cette technique présente l'inconvénient que l'électrode ampérométrique ne peut détecter que les émetteurs oxydables. En outre, la sensibilité de l'électrode ampérométrique diminue en présence de base importante, la libération spontanée d'un composé oxydable; par conséquent, la mesure de la libération après, par exemple, le préchargement d'un composé oxydable qui est spontanément libéré peut produire une diminution de la oxydatif courant. Le principal inconvénient de cette technique est la nécessité d'une expertise technique et un équipement coûteux.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Chirwa Sanika à l'examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DA026947, DA021471 et NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
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