Summary
amperometric तकनीक oxidative सहज dopamine oxidization द्वारा उत्पादित वर्तमान पता लगाने के द्वारा एक एकल कोशिका से dopamine रिलीज उपाय. युगपत वोल्टेज क्लैंप और amperometry पद्धति dopamine ट्रांसपोर्टर और dopamine के रिवर्स परिवहन पर इस गतिविधि के नियामक भूमिका के समग्र "गतिविधि" के बीच यंत्रवत संबंध प्रकट करते हैं.
Abstract
अन्तर्ग्रथनी फांक dopamine में अपनी रिहाई के बाद अपने पूर्व और बाद synaptic 1 लक्ष्य के माध्यम से अपने जैविक गुणों डालती है. dopamine संकेत प्रसार 2-3, कोशिकी 4 एंजाइमों, और झिल्ली 5 ट्रांसपोर्टरों द्वारा समाप्त होता है. dopamine न्यूरॉन्स की पेरी synaptic फांक में स्थित dopamine ट्रांसपोर्टर, एक आवक dopamine प्रवाह (तेज) के माध्यम से जारी amines साफ करता है. dopamine ट्रांसपोर्टर भी विपरीत दिशा में काम करने के लिए एक जावक परिवहन या 5 dopamine के तपका बुलाया प्रक्रिया में अंदर से बाहर करने के लिए amines जारी कर सकते हैं. 20 से अधिक साल पहले Sulzer एट अल बताया dopamine ट्रांसपोर्टर गतिविधि के दो मोड में काम कर सकते हैं: आगे (तेज) (तपका) और रिवर्स 5. ट्रांसपोर्टर के माध्यम से तपका के माध्यम से जारी neurotransmitter dopamine की एक बड़ी राशि को बाह्य अंतरिक्ष में ले जाने के लिए, कर सकते हैं और कोशिकी dopamine घंटे में एक प्रमुख विनियामक भूमिका निभा दिखाया गया है6 omeostasis. यहाँ हम वर्णन कैसे एक साथ पैच दबाना और amperometry रिकॉर्डिंग millisecond समय संकल्प के साथ तपका तंत्र जब झिल्ली क्षमता नियंत्रित किया जाता है के माध्यम से जारी dopamine को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस के लिए, पूरे सेल वर्तमान और oxidative संकेतों (amperometric) एक साथ मापा एक Axopatch 200B एम्पलीफायर (आण्विक उपकरण, पूरे सेल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए 1000 हर्ट्ज पर एक कम पास Bessel फिल्टर सेट के साथ) का उपयोग कर रहे हैं. है है लिए कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग amperometry एक 2 प्रवर्धक (200B Axopatch) से जुड़ा है और प्लाज्मा झिल्ली को आसन्न रखा और 700 एमवी में आयोजित. पूरे सेल और oxidative धाराओं (amperometric) और दर्ज किया जा सकता है संबंध वर्तमान वोल्टेज एक वोल्टेज कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. सामान्य amperometric अंशांकन, जो एकाग्रता के लिए रूपांतरण की आवश्यकता के विपरीत, वर्तमान प्रभावी मात्रा 7 पर विचार किए बिना सीधे सूचना दी है. इस प्रकार, परिणामी डेटाएक कम dopamine तपका सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं क्योंकि कुछ ट्रांसमीटर थोक समाधान के लिए खो दिया है.
Protocol
1. उपकरण और आपूर्ति
- पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए विरोधी कंपन (TMI) तालिका के शीर्ष पर एक फैराडे पिंजरे माउंट.
- एक साथ पैच दबाना amperometry रिकॉर्डिंग प्रणाली उत्कृष्ट डीआईसी प्रकाशिकी और एक लंबे समय से काम कर दूरी लेंस के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है. एक कार बैटरी प्रकाशस्तंभ खुर्दबीन कनेक्ट. प्रणाली के लिए इस डीसी प्रकाश स्रोत के आगे बिजली के शोर में कमी होगी.
- हाइड्रोलिक (Siskiyou) आगे कमी शोर micromanipulators. हमारे विन्यास में, हम पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए एक सही हाथ मैनिप्युलेटर, और amperometry के लिए सौंप दिया बाईं का उपयोग करें.
2. रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड तैयार
- पैच P-2000 डांड़ी (Sutter) क्वार्ट्ज pipettes का उपयोग कर इलेक्ट्रोड खींचो. हमारी पुल लगभग 5 सेकंड दो गर्मी के चक्र के साथ रहता है. इस गर्मी के समय हमारे पूरे सेल पैच pipettes में लगातार प्रतिरोध (MΩ 3-4) में हुई है.
- साथ इलेक्ट्रोड भरेंविंदुक 2 मिमी dopamine और यह सही मैनिप्युलेटर पर माउंट युक्त समाधान. विंदुक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ महंगाई भत्ते युक्त समाधान पकड़े कंटेनर लपेटें. बर्फ पर रखें. Dopamine oxidizable है. बर्फ, प्रकाश से संरक्षित रखते हुए समाधान dopamine के ऑक्सीकरण दर में कमी होगी.
- भंडारण बॉक्स से धीरे से एक ProCFE (Dagan) कम शोर कार्बन फाइबर amperometric इलेक्ट्रोड को हटाने, amperometric अनुकूलक (चित्रा 1 में चित्रित) पर पारा माउंट, साथ भरने, और फिर सही maniupulator पर माउंट. कार्बन फाइबर के अंत तक पकड़े द्वारा नुकसान से कार्बन फाइबर की नोक को सुरक्षित रखें. एक प्रयोगशाला खुर्दबीन के साथ करने के लिए सुनिश्चित करें टिप स्वच्छ और बरकरार है इलेक्ट्रोड का निरीक्षण किया.
- एक गिलास नीचे पेट्री डिश में बाहरी समाधान युक्त इलेक्ट्रोड डालने द्वारा amperometric इलेक्ट्रोड की अखंडता की जांच. Dopamine के अभाव में एक आधारभूत वर्तमान रिकार्ड. डिश के लिए एक 1mm डीए समाधान के 10 μl जोड़ें. एक अच्छा amperometric इलेक्ट्रोड फिरडोरियों oxidative वर्तमान में वृद्धि हुई है. प्रत्येक के लिए कुछ amperometric इलेक्ट्रोड बनाने के ठीक से काम करता है प्रयोग के शुरू और अंत में इस चरण को दोहराएँ.
3. Dopamine ट्रांसपोर्टर के गिलास नीचे पेट्री डिश में व्यक्त इंजीनियर dopamine न्यूरॉन्स या कोशिकाओं के प्राथमिक Neuronal संस्कृति तैयार
- धीरे गर्म बाहरी समाधान के साथ या कोशिकाओं dopamine न्यूरॉन्स तीन बार धो लो.
- खुर्दबीन मंच पर माउंट गिलास नीचे पेट्री डिश.
4. सेल कल्पना और प्रयोग
- सही फोकल बिंदु को स्पष्ट रूप से कोशिकाओं कल्पना. पैच इलेक्ट्रोड पर सकारात्मक दबाव रखें. फिर, धीरे दोनों इलेक्ट्रोड नीचे लाने के समाधान में, और सेल के करीब.
- Amperometric (बाईं ओर), सेल, और सही पर पैच इलेक्ट्रोड अगले इलेक्ट्रोड स्थिति.
- पैच इलेक्ट्रोड के साथ सेल पर एक gigaohm मुहर प्राप्त. टूटना चूषण के साथ सीलपूरे सेल विन्यास हासिल.
- आंतरिक सेल में dopamine युक्त समाधान के डायलिसिस के लिए 5-8 मिनट की अनुमति दें.
- वांछित वोल्टेज कदम या रैंप प्रोटोकॉल का उपयोग करें. इसके साथ ही दोनों पैच विंदुक और पूरे सेल धाराओं को मापने और dopamine ट्रांसपोर्टर के माध्यम से डोपामाइन के परिवहन रिवर्स amperometric इलेक्ट्रोड से डेटा प्राप्त जबकि झिल्ली क्षमता पैच विंदुक के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है.
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Representative Results
Amperometry के साथ संयुक्त पैच दबाना उपाय कर सकते हैं वोल्टेज - निर्भर DAT-मध्यस्थता डीए तपका 2A चित्रा. DAT मध्यस्थता डीए तपका के एक प्रतिनिधि प्रायोगिक विन्यास और जब intracellular परिवेश और झिल्ली क्षमता एक पैच विंदुक पूरे सेल द्वारा clamped हैं रिकॉर्डिंग से पता चलता है. इस तकनीक का उपयोग करना, YFP-DAT प्रोटीन कोशिकाओं को व्यक्त कर रहे हैं वोल्टेज clamped एक पूरे सेल पैच विंदुक के साथ है जबकि एक amperometric इलेक्ट्रोड प्लाज्मा झिल्ली (2A चित्रा) पर रखा गया है. पूरे सेल इलेक्ट्रोड एक विंदुक 2 मिमी डीए युक्त समाधान के साथ भरा है. amperometric प्लाज्मा झिल्ली को छू इलेक्ट्रोड 700 एमवी, एक दा के redox क्षमता की तुलना में अधिक से अधिक क्षमता में आयोजित किया जाता है. DAT-मध्यस्थता धाराओं (पूरे सेल चित्रा 2C और amperometric चित्रा 2 डी) -40 mV की एक होल्डिंग क्षमता (चित्रा 2B से -60 और 100 एम वी के बीच एक झिल्ली वोल्टेज विंदुक पूरे सेल कदम से दर्ज कर रहे हैं चित्रा 2 डी) amperometric धाराओं में एक उर्ध्व विक्षेपन महंगाई भत्ते की एक जावक प्रवाह के लिए मेल खाती है. कार्बन फाइबर पैच से दूर चल रहा oxidative छोटे और धीमी हो प्रतिक्रिया का कारण बनता है. , Oxidative प्रतिक्रिया डीए ऑक्सीकरण के लिए की उम्मीद कम हो जाती है जब कार्बन फाइबर वोल्टेज 300 mV से कम है और आगे की कमी पर पूरी तरह से गायब हो जाएगा 2E 2F चित्रा. स्वीकार्य और अस्वीकार्य रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि हैं. चित्रा 2E एक तंग GΩ का एक उदाहरण है पूरे सेल मुहर और इसी amperometric संकेत चित्रा 2F प्रतिनिधियों.टीएस एक टपकाया पूरे सेल पैच. इसी amperometric रिकॉर्डिंग लीक डीए उपाय.
चित्रा 1. तैयारी और amperometric इलेक्ट्रोड के विधानसभा धीरे भंडारण बॉक्स से एक ProCFE शोर कम कार्बन फाइबर amperometric इलेक्ट्रोड हटाने, पारा के साथ भरने के लिए. पैच दबाना धारक में चांदी के तार सूत्रण अनुकूलक तैयार है, तो पैच दबाना धारक पर एडाप्टर धागा और धीरे amperometric इलेक्ट्रोड माउंट. कार्बन फाइबर की नोक कुछ भी नहीं छूना चाहिए.
चित्रा 2. कई voltages पर प्रतिनिधि पूरे सेल और amperometric रिकॉर्डिंग जब पैच विंदुक पूरे सेल विन्यास में (ए) कार्टून प्रायोगिक विन्यास illustrating.Dopamine ट्रांसपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं वोल्टेज विंदुक के साथ एक पूरे सेल पैच clamped थे है जबकि एक amperometric इलेक्ट्रोड कोशिका झिल्ली के पास रखा गया था. डीए एक सकारात्मक amperometric वर्तमान में परिणाम के ऑक्सीकरण. (बी) वोल्टेज क्लैंप तरंग प्रोटोकॉल का चित्रण. (सी) DAT-मध्यस्थता धाराओं के बीच -60 और विंदुक पूरे सेल के साथ एक -40 mV की होल्डिंग क्षमता से 100 एमवी झिल्ली वोल्टेज कदम से दर्ज की गई. विंदुक समाधान 2 मिमी dopamine निहित है, के रूप में पहले से 7-9 वर्णित है. (D) amperometric वर्तमान पूरे सेल वर्तमान पैनल सी (ऊपर) में प्रतिनिधित्व के साथ एक साथ हासिल कर ली. वोल्टेज कदम के शुरू में, अधिक से अधिक 20 mV voltages के लिए, amperometric इलेक्ट्रोड रिकॉर्ड एक ऑक्सीकरण वर्तमान (सकारात्मक) है कि वोल्टेज कदम की पूरी अवधि के दौरान वृद्धि हुई है. (ई) और (एफ) स्वीकार्य और अस्वीकार्य पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं, क्रमशः. चित्रा 2E एक तंग GΩ w के एक उदाहरण हैछेद सेल सील और इसी amperometric संकेत. चित्रा 2F एक टपकाया पूरे सेल पैच का प्रतिनिधित्व करता है. सील प्रतिरोध MΩ रेंज के बजाय तक पहुँच GΩ पहले या सेल में टूट पूरे सेल मोड को प्राप्त करने के बाद. इसी amperomtric रिकॉर्डिंग लीक डीए उपाय. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
युगपत वोल्टेज दबाना और amperometry निम्नलिखित लाभ हैं. सभी प्रकार की कोशिकाओं पहुंच रहे हैं और रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकाओं या न्यूरॉन जहां रिकॉर्डिंग कर रहे हैं की पहचान सरल और सीधा है. विशेष रूप से, अगर सेल fluorescently ब्याज की प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट टैग जोड़कर लेबल है experimenter आसानी से लक्ष्य सेल या न्यूरॉन का चयन कर सकते हैं. प्रायोगिक विन्यास औषधीय एजेंटों की वर्दी और नियंत्रित वितरण या तो अनुमति देता है के पैच विंदुक माध्यम से, या स्नान 10 समाधान के लिए इन एजेंटों के अलावा द्वारा है. एक साथ पैच दबाना amperometry तकनीक oxidizable ट्रांसमीटर की रिलीज पर millisecond समय संकल्प के साथ विभिन्न चैनलों और ट्रांसपोर्टरों की भूमिका की जांच की अनुमति देता है, जबकि झिल्ली संभावित नियंत्रित किया जाता है. जैव रासायनिक 8 तरीकों के माध्यम से एक ही जानकारी प्राप्त नहीं किया जा सकता है. इस approac के अद्वितीय पहलुओं में से एकज रहा है कि यह पैच विंदुक 7,11 के माध्यम से डायलिसिस द्वारा intracellular पर्यावरण के हेरफेर की अनुमति देता है. हालांकि, इस तकनीक का नुकसान कि amperometric इलेक्ट्रोड केवल oxidizable ट्रांसमीटरों का पता लगा सकते हैं. इसके अलावा, पर्याप्त बेसल, एक oxidizable परिसर के सहज रिहाई की उपस्थिति में amperometric इलेक्ट्रोड की संवेदनशीलता कम हो जाती है, इस प्रकार, के बाद रिहाई की माप, उदाहरण के लिए, एक oxidizable यौगिक है कि अनायास जारी है preloading में कमी का उत्पादन कर सकते हैं वर्तमान oxidative. इस तकनीक का मुख्य नुकसान तकनीकी विशेषज्ञता और महंगे उपकरण की आवश्यकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ. Sanika Chirwa धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DA026947, DA021471, और NS071122) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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