Summary
amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.
Abstract
시냅스 갈라진 틈, 도파민에 출시 된 이후의 사전 및 사후 신경 목표 1을 통해 자사의 생물학적 특성을 발휘. 도파민 신호는 확산 2-3, 세포 효소 4, 막 수송 (5)에 의해 종료됩니다. 도파민 뉴런의 사망시 신경 분열에 위치한 도파민 수송은 안쪽 도파민 유량 (통풍 관)를 통해 출시 아민을 지 웁니다. 도파민 수송은 바깥쪽으로 교통이나 도파민 5 유출이라는 프로세스에서 내부에서 외부로 아민을 공개 역방향으로 작업 할 수 있습니다. . 앞으로 (통풍 관) 및 역방향 (유출) 5 : 20 년 이상 전 Sulzer 외는 도파민 수송이 두 활동의 모드에서 작동 할 수 있습니다 발표했다. 전송을 통해 유출을 통해 발표 신경 전달 물질은 세포 공간으로 도파민 많은 양의 이동 할 수 있으며, 세포 도파민 H의 주요 규제 역할을 보여왔다omeostasis 6. 여기 동시 패치 클램프 및 amperometry 녹음이 막 잠재력이 통제 밀리 초 시간 해상도 유출 메커니즘을 통해 출시 도파민을 측정하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 경우 전체 세포 현재와 산화 (amperometric) 신호는 Axopatch 200B 앰프 (분자 장치, 전체 셀 현재 기록은 1,000 Hz에서 로우 패스 베셀 필터가 설정된)를 사용하여 동시에 측정합니다. 탄소 섬유 전극을 기록 amperometry는 두 번째 앰프 (Axopatch 200B)에 연결되어 있고 플라즈마 막에 인접 배치하고 700 뮤직 비디오에서 개최 때문입니다. 전체 셀과 산화 (amperometric) 전류가 기록 할 수 있으며, 전류 전압 관계는 전압 단계 프로토콜을 사용하여 생성 할 수 있습니다. 농도로 변환을 필요로하는 일반적인 amperometric 보정 달리, 현재는 효과적인 볼륨 7 고려하지 않고 직접보고됩니다. 따라서, 결과 데이터일부 송신기는 대량 솔루션으로 손실되기 때문에 도파민 유출에 하한을 나타냅니다.
Protocol
1. 장비 및 용품
- 배경 잡음을 줄일 수있는 안티 진동 테이블 (TMI)의 상단에 패러데이 케이지를 탑재합니다.
- 동시 패치 클램프 amperometry 기록 시스템은 우수한 DIC 광학 및 긴 작동 거리 렌즈와 역 현미경이 필요합니다. 자동차 배터리에 등대 현미경을 연결합니다. 시스템이 DC 광원은 또한 전기 노이즈를 감소합니다.
- 유압 마이크로 (Siskiyou) 추가 감소 소음. 우리의 구성에서, 우리는 전체 셀 녹음 오른쪽 손잡이 속이는, 그리고 amperometry에 넘겨 왼쪽을 사용합니다.
2. 녹음을위한 전극을 준비
- P-2000 풀러 (셔터)에 석영 피펫을 사용하여 패치 전극을 당겨. 우리 풀다운 두 열 사이클과 함께 약 5 초 정도 소요됩니다. 이 열 시간은 우리의 전체 세포 패치 피펫에 일관성 저항 (MΩ 3-4) 결과입니다.
- 로 전극을 기입2 밀리미터 도파민과 오른쪽 속이는에 마운트를 포함하는 피펫 솔루션입니다. 알루미늄 호일로 DA를 포함하는 피펫 솔루션을 가지고있는 용기를 넣어. 얼음 계속. 도파민은 oxidizable입니다. 빛으로부터 보호 얼음에 솔루션을 유지하는 것은 도파민의 산화 속도를 감소합니다.
- 부드럽게, 저장 상자에서 ProCFE (Dagan) 저소음 탄소 섬유 amperometric 전극을 제거 amperometric 어댑터 (그림 1에 묘사)에 수은, 마운트로 입력하고 다음 오른쪽 maniupulator에 탑재합니다. 탄소 섬유의 맨 끝을 잡고 손상에서 탄소 섬유의 끝을 보호합니다. 끝이 깨끗하고 손상되지 않도록하기 위해 실험실 현미경으로 전극을 검사합니다.
- 외부 솔루션을 포함하는 유리 바닥 배양 접시에 전극을 넣어 amperometric 전극의 무결성을 검사합니다. 도파민의 부재에서 기준 전류를 기록합니다. 요리에 1mM DA 솔루션 10 μl를 추가합니다. 좋은 amperometric 전극 재코드 산화 현재의 증가. 특정 amperometric 전극이 제대로 작동하기 위해 각 실험의 시작과 끝에서이 단계를 반복합니다.
3. 유리 바닥 배양 접시에 도파민 전송을 표현하는 엔지니어링 도파민 뉴런 또는 셀의 기본 Neuronal 문화 준비
- 부드럽게 따뜻한 외부 솔루션을 셀이나 도파민 뉴런을 세 번 씻는다.
- 현미경 단계에 유리 바닥 페트리 접시를 탑재합니다.
4. 셀을 시각화 및 실험을 수행
- 명확하게 세포를 시각화 할 수있는 올바른 초점을 찾아보세요. 패치 전극에 긍정적 인 압력을 넣습니다. 그런 다음, 부드럽게 솔루션으로 두 전극을 가지고 있으며, 셀을 닫습니다.
- 셀 (왼쪽), 그리고 오른쪽에있는 패치 전극 옆에있는 amperometric 전극을 배치합니다.
- 패치 전극과 같은 감방에 gigaohm 인감을 충족해야합니다. 에 흡입과 파열 인감전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다.
- 셀에 도파민을 포함하는 내부 솔루션의 투석을위한 5-8 분 소요됩니다.
- 원하는 전압 단계 또는 램프 프로토콜을 사용합니다. 막 가능성이 패치 피펫을 통해 제어되는 동안 동시에 패치 피펫 및 전체 셀 전류를 측정하고 도파민 수송을 통해 도파민의 전송을 바꿀 수있는 amperometric 전극 모두에서 데이터를 수집.
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Representative Results
amperometry와 함께 패치 클램프 전압에 따라 달라 DAT로 인한 DA 유출. 그림 2A는 세포 내 환경과 막 잠재력이 전체 셀 패치 피펫으로 고정 아르 DAT로 인한 DA 유출의 대표 실험 구성 및 기록을 보여줍니다 측정 할 수 있습니다. 이 기법 사용, YFP - DAT 단백질을 표현 세포는 전압 고정 amperometric 전극이 플라즈마 막 (그림 2A)에 위치하는 동안 전체 세포 패치 피펫으로. 전체 전지 전극은 2 MM DA를 포함하는 피펫 솔루션으로 가득합니다. 플라즈마 막을 터치 amperometric 전극은 700 뮤직 비디오, DA의 산화 환원 전위보다 더 큰 가능성에서 개최됩니다. DAT로 인한 전류는 (전체 셀 - 그림 2C와 amperometric - 그림 2D) -40 mV의 개최 가능성 (그림 2B에서 -60 및 100 뮤직 비디오 사이의 막 전압에 전체 셀 피펫을 스테핑으로 기록됩니다 그림 2D)은 DA의 외부 자속에 해당합니다. 패치에서 떨어져 탄소 섬유를 이동하면 작고 속도가 느린 될 수있는 산화 반응이 발생합니다. 으로 DA 산화에 대한 기대, 산화 반응은 탄소 섬유 전압은 300 뮤직 비디오로 축소되어 더욱 감소에 완전히 사라집니다 때 낮 춥니 다. 2E-2F 그림은 허용하고 용납 할 수없는 레코딩을 대표합니다. 그림 2E는 꼭 GΩ의 예입니다 전체 셀 인감과 해당 amperometric 신호. 그림 2 층 represenTS는 새는 전체 셀 패치. 해당 amperometric 녹화가 유출 DA를 측정합니다.
1 그림. 준비와 amperometric 전극의 조립이. 부드럽게 저장 상자에서 ProCFE 저소음 탄소 섬유 amperometric 전극을 제거 수은이 작성. 패치 클램프 홀더에 은색 와이어를 스레딩하여 어댑터를 준비 후, 패치 클램프 홀더에 어댑터에 실을 꿰다 부드럽게 amperometric 전극을 탑재합니다. 탄소 섬유의 끝은 아무것도 만지지 않습니다.
그림 2. 여러 전압의 대표 전체 셀과 amperometric 녹음이 패치 피펫은 전체 셀 구성에있을 때. (A) 만화는 실험 구성을 보여주는.amperometric 전극은 세포막 근처에 배치되었을 때 도파민 수송을 표현 세포 전압 전체 셀 패치 피펫으로 고정되었습니다. 긍정적 인 amperometric 현재의 DA 결과의 산화. 전압 클램프 파형 프로토콜 (B) 그림. (C) DAT로 인한 전류 -60과 전체 셀 피펫으로 -40 mV의 개최 가능성에서 100 뮤직 비디오 사이의 막 전압을 스테핑으로 기록. 이전 7-9에 설명 된대로 피펫 솔루션은, 2 MM의 도파민이 포함되어 있습니다. (D) amperometric 현재는 패널 C (위)에 표시된 전체 셀 전류와 동시에 인수했다. 전압 단계의 시작에서, 20 뮤직 비디오보다 높은 전압, amperometric 전극 기록은 산화가 (긍정적 인) 그 전압 단계의 전체 기간 동안 현재 증가했다. (E)와 (F) 각각 허용하고 용납 할 수없는 전체 세포 패치 클램프 실험의 대표적인 있습니다. 그림 2E는 꼭 GΩ w의 예입니다구멍 세포 인감과 해당 amperometric 신호. 그림 2 층 새는 전체 셀 패치를 나타냅니다. 씰 저항은 GΩ 이전 또는 전체 셀 모드를 달성하기 위해 세포에 침입 한 후 대신 MΩ 범위에 도달했습니다. 해당 amperomtric 녹화가 유출 DA를 측정합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
동시 전압 클램프와 amperometry은 다음과 같은 이점이 있습니다. 모든 세포 유형은 액세스 할 수 있습니다 및 녹음에 사용할 수 있습니다. 녹음이 완료되어있는 셀이나 신경 세포의 식별은 간단하고 간단합니다. 셀이 휘황 관심 단백질에 형광 태그를 추가하여 표시하는 경우 특히, 실험 쉽게 대상 셀이나 신경을 선택할 수 있습니다. 실험 구성은 패치 피펫을 통해, 또는 목욕 솔루션 10이 요원의 추가에 의해 어느 약리 대리인의 균일하고 제어 전송을 할 수 있습니다. 동시 패치 클램프 amperometry 기술은 밀리 초 시간 해상도로 oxidizable 송신기의 릴리스에 다른 채널과 수송의 역할에 대한 조사를 허용하는 동안 막 잠재력은 제어됩니다. 동일한 정보는 생화학 방법 8를 통해 얻을 수 없습니다. 이 approac의 독특한 측면 중 하나H는 패치 피펫 7,11 통해 투석에 의해 세포 내 환경의 조작을 할 수 있다는 것입니다. 그러나,이 기술은 amperometric 전극은 oxidizable 송신기를 감지 할 수있는 단점이 있습니다. 자발적으로 출시 oxidizable 화합물의 preloading 예를 들어, 이후 릴리스 측정, 따라서 감소를 생성 할 수 있습니다, 또한, amperometric 전극의 감도는 oxidizable 화합물의 실질적인 기초, 자연 릴리스의 존재에 감소 현재 산화. 이 기술의 주요 단점은 기술적 인 전문 지식과 고가 장비의 요구 사항입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 원고의 중요한 검토 박사 Sanika Chirwa 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DA026947, DA021471 및 NS071122)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
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