Summary
A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.
Abstract
Depois de sua libertação para o sináptica de dopamina fissura, exerce suas propriedades biológicas através de suas metas pré-e pós-sináptica 1. O sinal de dopamina é terminada por difusão 2-3, enzimas extracelulares 4, e transportadores de membrana 5. O transportador de dopamina, localizado na fenda peri-sináptica dos neurônios dopaminérgicos limpa as aminas liberados através de um fluxo de dopamina para dentro (captação). O transportador de dopamina pode também funcionar no sentido inverso para libertar aminas a partir de dentro para fora, num processo denominado de transporte para o exterior ou o efluxo de dopamina 5. . Mais de 20 anos atrás Sulzer et al relataram o transportador de dopamina pode funcionar em dois modos de atividade: para frente (captação) e reverso (efluxo) 5. O neurotransmissor libertado através de efluxo através do transportador pode deslocar uma grande quantidade de dopamina para o espaço extracelular, e tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na regulação da dopamina extracelular homeostasis 6. Aqui descreve-se como patch clamp e gravação simultânea amperometria pode ser usado para medir a dopamina libertada através do mecanismo de efluxo com resolução de milissegundos do tempo em que o potencial de membrana é controlado. Por isso, células inteiras actuais e oxidativa (amperométrico) sinais são medidos simultaneamente utilizando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, com um filtro passa-conjunto de filtros de Bessel de 1.000 Hz para gravação de células inteiras de corrente). Para a gravação de um amperometria eléctrodo de fibra de carbono está ligado a um segundo amplificador (Axopatch 200B), e é colocado adjacente à membrana de plasma e mantido a 700 mV. As células inteiras e oxidativa (amperométrico) as correntes podem ser registados e a relação de corrente-tensão pode ser gerado utilizando um protocolo de passo de tensão. Ao contrário da calibração habitual amperométrico, que requer a conversão de concentração, a corrente é relatado directamente sem ter em conta o volume de 7 eficaz. Assim, os dados resultantesrepresentar um limite inferior para o efluxo de dopamina porque alguns transmissor é perdido para a solução a granel.
Protocol
1. Equipamentos e Suprimentos
- Montar uma gaiola de Faraday em cima da mesa de vibração anti (TMI) para diminuir o ruído de fundo.
- O simultânea patch clamp sistema de gravação amperometria requer um microscópio invertido com excelentes óptica DIC e uma lente de longa distância de trabalho. Ligue o microscópio farol para uma bateria de carro. Esta fonte de luz DC para o sistema irá reduzir ainda mais o ruído eléctrico.
- Micromanipuladores hidráulicos (Siskiyou) nova redução de ruído. Em nossa configuração, usamos um manipulador destro para a gravação de células inteiras, eo canhoto para amperometria.
2. Prepare Eletrodos para gravação
- Puxe eletrodos patch usando pipetas de quartzo em um extrator P-2000 (Sutter). Nossa puxar dura cerca de 5 segundos, com dois ciclos de calor. Desta vez, o calor tem resultado em resistência consistente (3-4 MQ) nas nossas pipetas remendo de célula completa.
- Preencha o eletrodo com opipeta solução contendo 2 mM de dopamina e montá-lo no manipulador direita. Envolva o recipiente que contém a solução de pipeta contendo DA com folha de alumínio. Manter em gelo. A dopamina é oxidável. Manter a solução em gelo, protegida da luz diminuirá a taxa de oxidação da dopamina.
- Remover suavemente a ProCFE (Dagan) de baixo ruído do eléctrodo de fibra de carbono amperométrico a partir da caixa de armazenamento, preencher com mercúrio, para o adaptador de montagem amperométrico (conforme representado na Figura 1) e, em seguida, montar no maniupulator direita. Proteger a ponta da fibra de carbono de danos, segurando a extremidade da fibra de carbono. Inspecione o eletrodo com um microscópio de laboratório para assegurar a dica é limpo e intacto.
- Examinar a integridade do eléctrodo amperométrico, colocando o eléctrodo de vidro em um prato de Petri contendo solução de fundo externa. Gravar uma corrente de linha de base na ausência de dopamina. Adicionar 10 ul de uma solução 1 mM de DA para o prato. A re eletrodo bom amperométricocabos de um aumento da corrente de oxidante. Repetir esta etapa, no início e no fim de cada experiência para fazer o eléctrodo amperométrico certo funciona adequadamente.
3. Prepare a cultura primária neuronal dos neurônios de dopamina ou células de engenharia para expressar transportador de dopamina em pratos de Petri com fundo de vidro
- Lavar cuidadosamente as células ou neurônios de dopamina três vezes com solução externa quente.
- Monte o fundo de vidro placa de Petri para o palco microscópio.
4. Visualize celular e executar Experimento
- Encontrar o ponto correto focal para visualizar claramente as células. Colocar uma pressão positiva sobre o eléctrodo de patch. Então, traga os dois eléctrodos para baixo para dentro da solução, e perto da célula.
- Posicionar o eléctrodo amperométrico para a célula seguinte (no lado esquerdo), e o eléctrodo de adesivo no lado direito.
- Alcançar uma vedação gigaohm na célula com o eléctrodo de patch. Ruptura do selo com a sucçãoobter uma configuração de célula inteira.
- 5-8 min para permitir que a diálise da solução interna contendo dopamina para dentro da célula.
- Use desejado passo de tensão ou protocolo de rampa. Simultaneamente adquirir dados a partir de ambos os @ patch pipette @ e ao eléctrodo amperométrico para medir correntes de células inteiras e o transporte reverso de dopamina através do transportador de dopamina, enquanto o potencial de membrana é controlada através da pipeta patch.
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Representative Results
Patch clamp combinado com amperometria pode medir a voltagem-dependente mediada DAT DA efluxo 2A. Figura mostra uma configuração experimental representativo e gravação de DAT mediada DA efluxo quando o meio intracelular e o potencial de membrana são fixadas por uma pipeta de remendo de células inteiras. Utilizando esta técnica, as células que expressam proteínas de YFP-DAT são voltagem fixa com uma pipeta de células inteiras remendo enquanto um eléctrodo amperométrico é colocada sobre a membrana plasmática (Figura 2A). O eléctrodo da célula inteira é preenchido com uma solução da pipeta contendo 2 mM de DA. O eléctrodo amperométrico tocar na membrana plasmática é mantida a 700 mV, um potencial maior do que o potencial redox da DA. DAT mediadas por correntes de células inteiras (Figura 2C-e-amperométrico Figura 2D) são registados através da intensificação da pipeta de células inteiras a uma tensão de membrana entre -60 e +100 mV a partir de um potencial de manutenção de -40 mV (Figura 2B Figura 2D) nas correntes amperométricos corresponde a um fluxo externo de DA. Movendo a fibra de carbono de distância do remendo faz com que a resposta oxidativa para se tornar menor e mais lento. Como esperado para a oxidação de DA, a resposta oxidativa diminui quando a tensão de fibra de carbono é reduzido para 300 mV e desaparece completamente com uma nova redução. Figura 2E-2F são representativos de gravações aceitáveis e inaceitáveis. Figura 2E é um exemplo de um GΩ apertado de células inteiras de vedação e o correspondente sinal amperométrico. Figura 2F represents um patch de célula inteira de fuga. A gravação correspondente amperométrico mede DA vazada.
Figura 1. Preparação e montagem de eletrodo amperométrico. Remova cuidadosamente um ProCFE baixo ruído eletrodo de fibra de carbono amperométrica da caixa de armazenamento, preencher com mercúrio. Prepare o adaptador por enfiar o fio de prata no suporte de fixação patch, então, passe o adaptador no suporte de fixação patch e suavemente montar o eletrodo amperométrico. A ponta da fibra de carbono não deve tocar em nada.
A Figura 2. Gravação de células inteiras e amperométrico representativa a múltiplas tensões quando a pipeta patch está na configuração de célula inteira. (A) dos desenhos ilustra a configuração experimental.As células que expressam transportador de dopamina foram voltagem fixa com uma pipeta de remendo de célula inteira, enquanto um eléctrodo amperométrico foi colocado próximo da membrana celular. A oxidação dos resultados de AD em uma corrente positiva amperométrico. (B) Ilustração de tensão protocolo braçadeira forma de onda. (C) DAT correntes mediadas gravado através da intensificação da tensão de membrana entre -60 e +100 mV a partir de um potencial de manutenção de -40 mV com a pipeta de células inteiras. A solução da pipeta continha 2 mM de dopamina, tal como descrito anteriormente 7-9. (D) A corrente amperométrica adquiridos em simultâneo com a corrente total de células representados no painel C (acima). No início do passo de voltagem, para tensões superiores a +20 mV, os registos de eléctrodos amperométricos uma oxidação de corrente (positiva) que aumentou durante toda a duração do passo de tensão. (E) e (F) são representativos da aceitáveis e inaceitáveis de célula completa experimentos patch clamp, respectivamente. Figura 2E é um exemplo de um apertado GΩ wburaco de células-seal e o sinal correspondente amperométrico. Figura 2F representa um remendo de células inteiras gotejante. A resistência do selo atingiu o intervalo em vez de MQ GΩ antes ou depois de uma falha na célula para atingir células inteiras modo. A gravação correspondente amperomtric mede DA vazada. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Simultânea de tensão-clamp e amperometria tem os seguintes benefícios. Todos os tipos de células são acessíveis e podem ser utilizados para a gravação. A identificação das células neuronais ou onde as gravações são feitas é simples e directa. Em particular, se a célula é marcado por fluorescência por adição de um marcador fluorescente para a proteína de interesse, o experimentador pode facilmente seleccionar a célula alvo ou neuronal. A configuração experimental permite a distribuição uniforme e controlada de agentes farmacológicos, quer através da pipeta patch, ou pela adição destes agentes para a solução do banho de 10. A técnica de patch simultânea amperometria grampo permite a investigação do papel dos diferentes canais e transportadores, sobre a libertação de transmissor oxidável com resolução de milissegundos do tempo enquanto que a membrana potencial é controlado. A mesma informação não pode ser obtida através de métodos bioquímicos 8. Um dos aspectos originais desta Approach é que ela permite a manipulação do ambiente intracelular por diálise utilizando a pipeta patch de 7,11. No entanto, esta técnica tem a desvantagem de que o eléctrodo amperométrico pode detectar apenas transmissores oxidáveis. Além disso, a sensibilidade do eléctrodo amperométrico diminui na presença de substancial libertação basal espontânea de um composto oxidável, portanto, a medição da libertação após, por exemplo, o pré-carregamento de um composto oxidável que é espontaneamente libertado pode produzir um decréscimo na oxidativo actual. A principal desvantagem desta técnica é a exigência de conhecimentos técnicos e equipamentos caros.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Sanika Chirwa para revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DA026947, DA021471, e NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
