Summary
De amperometrische techniek meet dopamine afgifte van een enkele cel door het detecteren van de stroom die door oxidatieve spontane dopamine oxidatie. Gelijktijdig spanning klem en amperometrie methodologie onthullen de mechanistische relatie tussen de totale "activiteit" van dopamine transporter en de regulerende rol van deze activiteit op de achterzijde transport van dopamine.
Abstract
Na de introductie in de synaptische spleet, dopamine oefent zijn biologische eigenschappen via de pre-en post-synaptische doelstellingen 1. De dopamine signaal wordt beëindigd door diffusie 2-3, extracellulaire enzymen 4 en membraan transporters 5. De dopamine transporter, gelegen in het peri-synaptische spleet van dopamine neuronen wist de vrijgekomen aminen door middel van een naar binnen dopamine flux (opname). De dopamine transporter kan ook in omgekeerde richting om aminen vrijgeven van binnen naar buiten in een proces genaamd naar buiten vervoer of efflux van dopamine 5. . Meer dan 20 jaar geleden Sulzer et al. rapporteerden de dopamine transporter kan in twee vormen van activiteit: vooruit (opname) en achteruit (efflux) 5. De neurotransmitter model via efflux door de transporter kunt een grote hoeveelheid dopamine naar de extracellulaire ruimte, en blijkt een belangrijke regulerende rol spelen in extracellulaire dopamine homeostasis 6. Hier beschrijven we hoe gelijktijdige patch clamp en amperometrie registratie kan worden toegepast om model dopamine meten via de efflux mechanisme milliseconde tijdsresolutie wanneer de membraanpotentiaal wordt geregeld. Hiervoor zijn gehele celstroom en oxidatieve (amperometrische) signalen gelijktijdig gemeten met een Axopatch 200B versterker (Molecular Devices, een low-pass filter set Bessel bij 1000 Hz voor whole-cell huidige opname). Voor amperometrie opnemen van een koolstofvezel elektrode is verbonden met een tweede versterker (Axopatch 200B) en grenzend aan het plasmamembraan en +700 mV gehouden. De volledige cel en oxidatieve (amperometrische) stromen kunnen worden opgenomen en de stroom-spanning relatie kan worden gegenereerd met een spanningssprong protocol. In tegenstelling tot de gebruikelijke amperometrische kalibratie, die omzetting concentratie is vereist, wordt de stroom direct gerapporteerd zonder de effectieve volume 7. Aldus de verkregen datavertegenwoordigen een ondergrens aan dopamine efflux omdat sommige zender wordt verloren aan de bulk oplossing.
Protocol
1. Apparatuur en benodigdheden
- Monteer een Faraday kooi bovenop de anti triltafel (TMI) om de achtergrondruis te verminderen.
- De gelijktijdige patch clamp amperometrie opname systeem vereist een omgekeerde microscoop met uitstekende DIC optiek en een lange werkafstand lens. Sluit de microscoop vuurtoren op een auto-accu. Deze DC lichtbron voor het systeem verdere daling van het elektrische ruis.
- Hydraulische micromanipulators (Siskiyou) verdere daling lawaai. In onze configuratie, gebruiken we een rechtshandige manipulator voor de hele cel opname, en de linker overhandigd voor amperometrie.
2. Bereid Elektroden voor opnemen
- Trek patch elektroden gebruik van kwarts pipetten op een P-2000 trekker (Sutter). Onze pull duurt ongeveer 5 sec, met twee warmte cycli. Deze warmte tijd heeft geresulteerd in een constante weerstand (3-4 MQ) in onze hele cel patch pipetten.
- Vul de elektrode met depipetoplossing die 2 mM dopamine en monteren op de juiste manipulator. Wikkel de container met de pipet oplossing die DA met aluminiumfolie. Blijf op ijs. Dopamine oxideerbaar. Houd de oplossing op ijs beschermd tegen licht vermindert de oxidatiesnelheid van dopamine.
- Verwijder een ProCFE (Dagan) een laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode uit de opbergdoos, vullen met kwik, mount op de amperometrische adapter (zoals afgebeeld in figuur 1), en dan monteren op de juiste maniupulator. Bescherm de tip van de koolstofvezel tegen beschadiging door die het einde van de koolstofvezel. Inspecteer de elektrode met een lab microscoop te zorgen voor de tip schoon en onbeschadigd.
- Onderzoek de integriteit van de amperometrische elektrode zetten de elektrode in een glazen bodem petrischaal met externe oplossing. Neem een basislijn stroom in afwezigheid van dopamine. Voeg 10 ul van een 1 mM oplossing DA de schotel. Een goede amperometrische elektrode rekoorden een verhoging van de oxidatieve stroom. Herhaal deze stap aan het begin en einde van elk experiment om er zeker van de amperometrische electrode werkt.
3. Bereid de primaire neuronale Cultuur van dopamine neuronen of cellen Ontworpen om Dopamine Transporter Express in Glass Bottom Petrischalen
- Voorzichtig wassen de cellen of dopamine neuronen drie keer met warm externe oplossing.
- Monteer de glazen bodem petrischaal op de microscoop podium.
4. Visualiseer Cel-en uitvoeren Experiment
- Zoek de juiste brandpunt om duidelijk te visualiseren de cellen. Plaats positieve druk op de patch elektrode. Daarna voorzichtig brengen beide elektroden naar beneden in de oplossing, en dicht bij de cel.
- Plaats de amperometrische elektrode naast de cel (aan de linkerkant) en de patch elektrode rechts.
- Gigaohm bereiken een afdichting op de cel met de patch elektrode. Breuk van de afdichting met afzuiging naarbereiken gehele cel configuratie.
- Toestaan 5-8 min. voor dialyse van interne oplossing die dopamine in de cel.
- Gebruik de gewenste spanning stap of ramp-protocol. Gelijktijdige meten gegevens van de patch pipet en amperometrische elektrode gehele cel stromen te meten en terug transport van dopamine door de dopamine transporter terwijl de membraanpotentiaal wordt via de patch pipet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gecombineerde patch clamp met amperometrie kan meten spanningsafhankelijke DAT-gemedieerde efflux DA. Figuur 2A toont een representatieve experimentele configuratie en opnemen van DAT-gemedieerde efflux DA wanneer de intracellulaire milieu en de membraanpotentiaal worden vastgeklemd door een volledige cel patch pipet. Met deze techniek cellen die YFP-DAT eiwitten voltage-geklemd met een gehele cel patch pipet terwijl een amperometrische elektrode wordt op de plasmamembraan (Figuur 2A). De hele cel-elektrode gevuld met een pipet oplossing die 2 mM DA. De amperometrische elektrode raken plasmamembraan gehouden +700 mV, een potentieel groter dan de redoxpotentiaal van DA. DAT-gemedieerde stromen (whole-cell-figuur 2C en amperometrische-figuur 2D) worden opgenomen door de intensivering van de whole-cell pipet aan op een membraan spanning tussen -60 en +100 mV van een bedrijf dat potentieel van -40 mV (Figuur 2B Figuur 2D) in de amperometrische stromen overeen met een flux van buiten DA. Verplaatsen van de koolstofvezel weg van de patch ervoor dat de oxidatieve reactie kleiner en langzamer. Zoals verwacht DA oxidatie, de oxidatieve reactie afneemt wanneer de koolstofvezel spanning verlaagd tot +300 mV en zal volledig verdwijnen verdere vermindering. Figuur 2E-2F representatief zijn aanvaardbaar en onaanvaardbaar opnamen. Figuur 2E is een voorbeeld van een strakke GΩ whole-cell afdichting en de bijbehorende amperometrische signaal. Figuur 2F vertegents een lekkende whole-cell patch. De overeenkomstige amperometrische opname meet gelekt DA.
Figuur 1. Voorbereiding en montage van amperometrische elektroden. Voorzichtig een ProCFE laag geluidsniveau koolstofvezel amperometrische elektrode te verwijderen uit de opbergdoos, vullen met kwik. Bereid de adapter door het inrijgen van de zilveren draad in de patch-clamp houder, rijg vervolgens de adapter op de patch-clamp-houder en voorzichtig monteer de amperometrische elektrode. De tip van de koolstofvezel mag niets aanraken.
Figuur 2. Representatieve whole-cell en amperometrische opname op verschillende spanningen wanneer de pleister pipet in whole-cell configuratie. (A) Cartoon illustreert de experimentele configuratie.Cellen die dopamine transporter werden spanning geklemd met een gehele-cel patch pipet terwijl een amperometrische elektrode is naast het celmembraan. De oxidatie van DA tot een positief amperometrische stroom. (B) Illustratie van spanningsklem golfvorm protocol. (C) DAT-gemedieerde opgenomen door het membraan stappen spanning tussen -60 en +100 mV van een bedrijf potentiaal van -40 mV met het whole-cell pipet. De pipetoplossing bevatte 2 mM dopamine, zoals eerder beschreven 7-9. (D) De amperometrische huidige verkregen gelijktijdig met de gehele celstroom weergegeven in paneel C (boven). Aan het begin van de spanning stap voor spanningen hoger dan +20 mV, de amperometrische elektrode legt een oxidatie stroom (positief) dat meer tijdens de gehele duur van de spanning stap. (E) en (F) zijn representatief aanvaardbaar en onaanvaardbaar whole-cell patch clamp experimenten respectievelijk. Figuur 2E is een voorbeeld van een strakke GΩ whole-cel afdichting en de bijbehorende amperometrische signaal. Figuur 2F is een lekkende whole-cell patch. De afdichting weerstand bereikt MQ gebied ipv GΩ vóór of na het breken in de cel volledige cel modus te bereiken. De bijbehorende amperomtric opname meet gelekt DA. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelijktijdige voltage-clamp en amperometrie heeft de volgende voordelen. Alle celtypen zijn toegankelijk en kunnen worden gebruikt voor opname. De identificatie van de cellen of neuron waar de opnames worden gedaan, is eenvoudig en ongecompliceerd. Met name wanneer de cel fluorescent gelabelde door toevoeging van een fluorescerend label aan het eiwit van belang de experimentator kan eenvoudig de doelcel of neuron. De experimentele configuratie maakt uniforme en gecontroleerde afgifte van farmacologische middelen hetzij via de patch pipet of door toevoeging van deze middelen aan de badoplossing 10. De gelijktijdige patch clamp amperometrie techniek maakt het mogelijk onderzoek naar de rol van de verschillende kanalen en vervoerders over de vrijlating van oxideerbare zender met milliseconde tijdsresolutie terwijl het membraan potentieel wordt gecontroleerd. Dezelfde informatie kan niet verkregen worden door biochemische methoden 8. Een van de unieke aspecten van dit approach is dat manipulatie van de intracellulaire omgeving kunnen door dialyse via de patch 7,11 pipet. Deze techniek heeft het nadeel dat de amperometrische elektrode alleen oxideerbare zenders detecteren. Bovendien is de gevoeligheid van de amperometrische electrode af in de aanwezigheid van aanzienlijke basale, spontane afgifte van een oxideerbare verbinding; dus meting van de afgifte na bijvoorbeeld de voorspanning van een oxideerbare verbinding die spontaan model kan een afname in de oxidatieve stroom. Het grootste nadeel van deze techniek is de eis van technische expertise en dure apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Dr Sanika Chirwa voor kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DA026947, DA021471, en NS071122).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
| Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
| Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
| 1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
| 1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
| Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
| Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
| Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
| Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
| Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
| 12-volt car battery | widely available | ||
| Car battery charger | widely available | ||
| Reagent | |||
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Dextrose | Sigma | G7528 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2∙2H20) | Sigma | 223506 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H20) | Sigma | M2670 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
References
- Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
- Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
- Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
- Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
- Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
- Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
- Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
- Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).
