Summary
的方法来产生人类诱导多能干细胞（iPS细胞）通过逆转录病毒介导的异位表达Oct4的，SOX2的，KLF4和MYC的描述。基于GFP的表达，以确定人类IPSC的殖民地一个切实可行的办法进行了讨论。
Abstract
人类胚胎干细胞（胚胎干细胞），多能干细胞在体外疾病建模和再生医学的宝贵来源。它已被先前的研究显示，人体细胞可以被重新编程为多能性异位表达四个转录因子（OCT4，SOX2，KLF4和 Myc），成为诱导多能干细胞（iPS细胞）2-4。胚胎干细胞一样，人类iPS细胞是多能干细胞和自体细胞的潜在来源。在这里，我们描述的协议进行重新编程人类成纤维细胞克隆到含有GFP的逆转录病毒的骨干4四个重编程因素 。使用下面的协议，我们生成人类胚胎培养条件下的人类iPS细胞在3-4周。人类IPSC的殖民地酷似胚胎干细胞形态和逆转录病毒转基因沉默的结果显示，GFP荧光的损失。 IPSC的殖民地下的荧光microsco机械分离体育作为人类胚胎干细胞类似的方式表现。在这些细胞中，我们检测的多的多能性基因的表达和表面标志。
Protocol
1。逆转录病毒重新编程，重编程因子的表达
- 人成纤维细胞培养成纤维细胞培养基（10％与PEN /链球菌培养液胎牛血清）。
- 感染前的一天，1×10板5到6孔板人成纤维细胞。
- 抽吸介质，去除死皮细胞和新鲜的成纤维细胞培养基中添加2毫升。在终浓度为5微克/毫升，加入硫酸鱼精蛋白。
- 仔细地添加适量的每个表达GFP病毒的感染复数（MOI）5。
- 感染后的一天，清除病毒上清，2毫升PBS洗三次，然后加入2毫升的成纤维细胞培养基。
- 感染后3天，检查GFP荧光，以及补充成纤维细胞培养基2毫升。
- 感染四天后，板1×10 4 /厘米2辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在成纤维细胞培养基中饲养细胞到一个涂有0.1％明胶的10厘米的培养皿。孵育37℃过夜。
- 五天后感染，感染人成纤维细胞分离与1毫升0.05％胰蛋白酶/ EDTA 5分钟，在37°C间，在200克离心5分钟。抽吸的介质，悬浮细胞，成纤维细胞培养基10毫升。细胞转移到10厘米预涂板。
- 24小时后，取代胚胎干细胞培养基血清替代20％击倒，DMEM/F12培养液，0.1毫升的非必需氨基酸，4 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子，PEN /链球菌/谷氨酸，β-merceptoethanol的介质。改变中等每日。 ESC - 殖民地将开始出现在感染后20-27天。
2。 iPS细胞的分离和扩展的
- 荧光显微镜下，检查GFP荧光在殖民地的情况下，显示了一个类似的形态胚胎干细胞。
- 使用10μL移液器，挑选个别IPSC的殖民地，并放入明胶和MEF-COA特德与胚胎干细胞培养基的12孔板和补充。每天改变介质。
- 对于传代，用1毫升的DMEM/F12板，再加入0.5毫升胶原酶，孵育10分钟，在37°C
- 与DMEM/F12培养液洗细胞两次。
- 加入2毫升的新鲜胚胎干细胞培养基。使用细胞升降机，打破成小块殖民地和分离板的剩余细胞。
- 转入的明胶涂层和MEF 6孔板殖民地的再悬浮件。
3。多能干标记免疫分析
- 洗细胞三次，用PBS，并固定为4％多聚甲醛在室温下20分钟。
- 用PBS轻轻洗细胞三次，通透与0.2％的Triton的PBS X-100的30分钟。
- 阻止了两个小时，在PBS 3％的BSA孵育细胞非特异性结合。
- 孵育与小学抗体细胞一夜之间在4°C。 <李>洗细胞三次，用PBS孵育一小时在室温下与特定的二级抗体的细胞，从遮光。
- 洗细胞与PBS及附加的DAPI随后在室温下孵育5分钟的最后一次洗涤三次。
- 用荧光显微镜检测染色。
4。为多能干标记实时定量PCR检测
- 隔离使用Qiagen公司的RNeasy试剂盒的人成纤维细胞的人类iPS细胞的总RNA。
- 合成cDNA第一链的使用上标II逆转录酶。
- 执行定量PCR检测使用以前报道的引物的全能性基因。
5。代表结果
- 编程期间的形态学变化
感染人成纤维细胞与账面OCT4，SOX2，KLF4和MYC基因的逆转录病毒的鸡尾酒BJ1和底特律551，能够探测到的形态学变化，在重新规划（ 图1）。感染后二十一日内，我们承认他们的人类胚胎干细胞一样的形态小IPSC的殖民地。此外，我们认识到iPSCs的GFP荧光。如胚胎干细胞和iPS细胞，多能干细胞表达的分子机制，压制7-9前病毒基因的表达。我们独特的逆转录病毒载体表达绿色荧光蛋白基因与逆转录病毒LTR的重新编程。因此，持续表达GFP的细胞被认为是没有前病毒基因沉默表达外源基因。忠实地重新编程的IPSC的殖民地获得全能性的分子网络显示的情况下GFP的表达（ 图2）10。 - 人类iPS细胞的全能性的表征
我们分析了从底特律-551成纤维细胞与TRA-1-81，TRA-1-60，SSEA-4，SSEA-3，OCT4和NANOG的抗体通过免疫组化派生的殖民地（
图1。逆转录病毒感染人成纤维细胞的形态变化。（AD）的进步从底特律-551感染的成纤维细胞重编程因子的菌落的形态变化。第5天（一），第10天（二），第14天（三），（四）21天。细胞显示经过21天的人类胚胎干细胞样形态。
图2。代表GFP荧光表达细胞进行重新编程。 4，四个星期在人类胚胎干细胞培养基中培养。北京成纤维细胞（甲，乙）和底特律551（C和D）显示出类似的形态。从第21天，GFP阴性殖民地开始形成，它代表了真正的10善意iPSCs的。 （，E，F）显示底特律551没有进行适当的重新编程的细胞转化。在相衬视图（一个C，E）的殖民地。 （B，D）正确地重新编程细胞显示了GFP沉默。 （六）从转化菌落明亮的绿色荧光蛋白表达。
图3。人类诱导多能干细胞的特征。（一）人力551-IPS-K1细胞克隆表达常见的多能干细胞的标记。 DAPI染色显示每场总的单元格的内容。 （二）实时定量聚合酶链反应（RT-QPCR）时间为表达Oct4的，SOX2的，KLF4的，myc在父母f551-IPS-K1 ibroblast，iPS细胞，人类胚胎干细胞和H9（胚胎干细胞）。数据正常化对β-actin的看家基因，并绘制相对表达水平在父母的成纤维细胞4。
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Discussion
四个转录因子重编程iPSCs的人类成纤维细胞中的表达。作了许多尝试使用非集成或者非遗传方法来生成临床安全iPSCs的人类iPS细胞生成。到目前为止，这些方法效率极低，需要进一步优化，提高了重复性11-14。复古或慢病毒的方法，很容易获得和运用人类iPS细胞， 在体外的疾病模型，这是减少病毒整合所造成的安全问题上的依赖。重新编程的方法，这里描述的是人类iPS细胞的效率推导。人类iPSCs的选择主要是根据菌落形态类似于人类胚胎干细胞。更重要的是，我们的方法是沉默的逆转录病毒长末端重复序列（LTR）的7,15多能干细胞的功能优势。在本协议所使用的逆转录病毒载体含有GFP基因与重新规划通过内部核糖体进入序列（IRES）和5个因素。 GFP的表达是由前病毒LTR的。这些病毒感染的成纤维细胞，初步显示了明亮的绿色荧光蛋白表达。一旦完全重新编程的iPS细胞将失去GFP的表达，这是很容易在荧光显微镜下可视化。在这个协议中，我们描述了一代iPSCs的胎儿和新生儿的成纤维细胞（底特律551和BJ1）。然而，这种逆转录病毒载体已被用于从正常成年成纤维细胞产生iPS细胞，以及各种与孟德尔和复杂疾病的患者4,16,17。
此前我们已经分析了在细胞表面标志物的变化，在人类体细胞重新编程10。有一个逐步改变在细胞表面标志。成纤维细胞表达CD13快递，这是由重整的表达压抑。细胞进行重新编程开始与GFP表达SSEA4在一起。然后，他们失去了expressiGFP通过前病毒silecing快递额外的全能性制造商TRA1-60 10。的TRA1-60的表达与GFP沉默和发达的畸胎瘤形成很好的相关性，表明TRA1-60是一个忠实地重新编程的iPS细胞的标记。绿色荧光蛋白沉默替代TRA1-60表达的标记，并允许不费力的活细胞染色鉴定IPSC的殖民地。用绿色荧光蛋白表达的损失，作为一个标记为iPSCs的干细胞科学家在重新编程容易和一贯隔离iPSCs的人没有以前的经验。
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Acknowledgments
这项工作是由耶鲁大学的查尔斯·胡德基金会的医学和儿童健康研究奖的学校。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| Knockout Serum Replacer | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | Invitrogen | 11140050 | 0.1 mM |
| β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG | Invitrogen | M-6250 | 0.1 mM |
| bFGF-2 10 μg/ml | GIBCO, by Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| FBS | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| Table 1. Culture Medium | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD Biosciences | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD Biosciences | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD Biosciences | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa-Flur 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa-Flur 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Collagenase type IV | Invitrogen | 17104019 | 1mg/ml |
| Gelatin, Porcine | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0.1% |
| Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0.2% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| BSA | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| MEF feeder cells | EMD Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
| Table 2. Reagents and equipment | |||
References
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