Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Summary

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Abstract

Menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) zijn pluripotent en een onschatbare cellulaire bronnen voor in-vitro-en vaatziekten modellering en regeneratieve geneeskunde ^1. Het is eerder aangetoond dat de menselijke somatische cellen kunnen worden geherprogrammeerd om pluripotentie door ectopische expressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4 en Myc) en worden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ^2-4. Net als hESC 's, de menselijke iPSCs zijn pluripotent en een potentiële bron voor autologe cellen. Hier beschrijven we het protocol voor de menselijke fibroblast cellen te herprogrammeren met de vier herprogrammering factoren gekloneerd in GFP-bevattende retrovirale backbone ^4. Met behulp van de volgende protocol, genereren we de menselijke iPSCs in 3-4 weken in de menselijke cultuur ESC staat. Human IPSC kolonies lijken op hESC 'in morfologie en aangeven dat de GFP als gevolg van retrovirale transgene silencing. IPSC kolonies mechanisch geïsoleerd onder een fluorescentie microscoie zich op een vergelijkbare manier als hESC 's. In deze cellen zien wij de expressie van meerdere genen en pluripotentie oppervlaktemerkers.

Protocol

1. Herprogrammering door Retrovirus uitdrukken herprogrammeren factoren

1. Menselijke fibroblasten worden gekweekt in fibroblast medium (10% FBS in DMEM met Pen / Strep).
2. Een dag voor infectie, plaat 1x10 ⁵ menselijke fibroblasten in een putje van een 6-wells plaat.
3. Zuig medium om de dode cellen te verwijderen en 2 ml vers fibroblast medium toe te voegen. Voeg protaminesulfaat bij een uiteindelijke concentratie van 5 pg / ml.
4. Voorzichtig toevoegen geschikte hoeveelheid van elk GFP-expressie virus overeenkomt met een multipliciteit van infectie (MOI) ⁵ 5.
5. Op een dag na infectie, verwijder dan de virale supernatant, Was driemaal uit met 2 ml PBS, voeg 2 ml fibroblast medium.
6. Drie dagen na infectie, controleer dan de GFP-fluorescentie en vervult de goed met 2 ml fibroblast medium.
7. Vier dagen na infectie plaat 1x10 ⁴ / cm ² bestraalde muis embryo fibroblasten (MEF) feeder cellen fibroblast medium op een10 cm petrischaal bekleed met 0,1% gelatine. Incuberen bij 37 ° C geroerd.
8. Vijf dagen na infectie los geïnfecteerd humane fibroblasten met 1 ml 0,05% typsin / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 200 g. Zuig het medium en resuspendeer de cellen met 10 ml van fibroblast medium. Breng de cellen in een voorgecoate 10 cm plaat.
9. Na 24 uur, vervang dan de medium met hESC kweekmedium (20% Knock-Out serum vervanging, DMEM/F12, 0,1 ml Niet-essentiële aminozuren, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutamaat, beta-merceptoethanol). Dagelijks veranderen het medium. ESC-achtige kolonies start te verschijnen op dag 20-27 na de infectie.

2. Isolatie en uitbreiding van iPSCs

1. Onder een fluorescentiemicroscoop, controleren op de afwezigheid van GFP-fluorescentie in een kolonie die een vergelijkbare morfologie toont aan hESC 's.
2. Met behulp van een pipet 10 ul, pak individuele IPSC kolonies en plaats ze in een putje van een gelatine-en MEF-CoAted 12-well plaat en aangevuld met hESC medium. Dagelijks veranderen medium.
3. Voor passages de plaat was 1 ml DMEM/F12, voeg 0,5 ml collagenase, en incuberen gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
4. Twee keer Spoel de cellen met DMEM/F12.
5. Voeg 2 ml vers hESC medium. Met behulp van een cel lifter, breken de kolonies in kleine stukjes en los resterende cellen van de plaat.
6. Breng de geresuspendeerde stukken kolonies in een putje van een gelatine-en MEF beklede 6-wells plaat.

3. Immunofluorescentie Analyse van pluripotente Markers

1. Was de cellen drie keer met PBS en vast met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
2. Voorzichtig te wassen van de cellen drie keer met PBS en permeabilize met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten.
3. Blokkeren van niet-specifieke binding door incubatie cellen met 3% BSA in PBS gedurende twee uur.
4. Overnacht incuberen van de cellen met primaire antilichaam bij 4 ° C.
<li> Was de cellen drie keer met PBS en geïncubeerd de cellen met specifieke secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur afscherming van licht.
5. Was de cellen drie keer met PBS en voeg DAPI de laatste wassen gevolgd door incubatie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
6. Detecteer de kleuring met een fluorescentie microscoop.

4. Kwantitatieve real-time PCR-test voor de pluripotente Markers

1. Isoleer totaal RNA uit de menselijke iPSCs uit humane fibroblasten met RNeasy kit Qiagen's.
2. Samenstel de eerste streng cDNA met SuperScript II Reverse Transcriptase.
3. Voer qPCR om pluripotentie genen met behulp van primers eerder gemeld op te sporen. ⁶

5. Representatieve resultaten

1. Morfologische verandering tijdens de herprogrammering
   We geïnfecteerd menselijke fibroblasten BJ1 en Detroit 551 met een cocktail van retrovirussen die OCT4, SOX2, KLF4 en MYC,en waren in staat om morfologische veranderingen te detecteren tijdens de herprogrammering (figuur 1). Eenentwintig dagen na infectie, herkennen we kleine IPSC kolonies door hun hESC-achtige morfologie. Verder herkennen we iPSCs door de GFP-fluorescentie. Pluripotente stamcellen, zoals de SER's en iPSCs, drukken de moleculaire machinerie van de provirale genexpressie onderdrukken ^7-9. Onze unieke retrovirale vector uitdrukt GFP samen met de herprogrammering genen door retrovirale LTR. Zo worden de cellen continu uiten GFP als transgenen te uiten zonder provirale gene silencing. Trouw geprogrammeerd IPSC kolonies die de pluripotentie moleculair netwerk te verwerven blijkt de afwezigheid van GFP expressie (Figuur 2) ^10.
   
2. Karakterisering van pluripotentie menselijke iPSCs
   We analyseerden kolonies afgeleid van Detroit-551 fibroblasten via immunohistochemie met Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 en NANOG antilichamen ( (Figuur 3A). Ook geanalyseerd genexpressie via kwantitatieve RT-PCR analyse. We zagen dat de expressie van OCT4, SOX2, KLF4, MYC en NANOG aanzienlijk werd verhoogd ten opzichte van het ouderlijk fibroblast cellen, maar in verhouding met die van H9 hESC 's (Figuur 3B).

Figuur 1. Morfologische veranderingen van het retrovirus-geïnfecteerde menselijke fibroblasten. (AD) Progressive morfologische verandering in kolonies van Detroit-551 fibroblasten die besmet zijn met herprogrammering factoren. Dag 5 (A), dag 10 (B), dag 14 (C), dag 21 (D). Cellen geven de hESC-achtige morfologie na 21 dagen.

Figuur 2. Vertegenwoordiger GFP fluorescentie expressie in cellen ondergaan herprogrammering. 4 en geïncubeerd in hESC medium voor vier weken. BJ fibroblasten (A, B) en Detroit 551 (C, D) vertonen gelijkaardige morfologische. Vanaf dag 21, GFP negatieve kolonies beginnen te vormen, die staan ​​voor de bonafide iPSCs ^10. (E, F) tonen getransformeerd Detroit 551 cellen die geen behandeling hebben ondergaan juiste herprogrammering. (A, C, E) kolonies in fase contrast. (B, D) op de juiste geherprogrammeerd cellen die de GFP silencing te laten zien. (F) heldere GFP expressie van getransformeerde kolonie.

Figuur 3. Karakterisering van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. (A) Menselijke 551-iPS-K1 celkolonies uiten markers gebruikelijk om pluripotente cellen. DAPI kleuring geeft het totale celinhoud per veld. (B) Kwantitatieve real-time-PCR (RT-qPCR) voor de expressie van OCT4, SOX2, KLF4, MYC in ouderlijke fibroblast, 551-iPS-K1 iPSCs, en H9 menselijke embryonale stamcellen (hESC 's). Gegevens werden genormaliseerd tegen β-actine-gen huishoudelijke en uitgezet ten opzichte van het expressieniveau in de parentale fibroblastcellen ^4.

Discussion

Expressie van vier transcriptiefactoren herprogrammeert humane fibroblasten met iPSCs. Veel pogingen werden gedaan om de menselijke iPSCs behulp van niet-integratie of niet-genetische benaderingen van klinisch veilige iPSCs genereren. Tot nu toe, deze methoden blijkt extreem lage efficiëntie en de verdere optimalisatie van de reproduceerbaarheid ^11-14 te verbeteren. Retro-of lentivirale methoden gemakkelijk worden gebruikt voor het afleiden en toe te passen iPSCs voor menselijke in vitro ziekte-modellen, die minder afhankelijk zijn van de veiligheid van problemen veroorzaakt door virale integratie. Herprogrammeren hier beschreven is voor de efficiënte winning van menselijke iPSCs. Selectie van de menselijke iPSCs is voornamelijk gebaseerd op kolonie morfologie die lijkt op de menselijke sociaal-economische raden. Wat nog belangrijker is, onze methode maakt gebruik van de functie van zwijgen van de retrovirale lange terminale herhalingen (LTR) in pluripotente stamcellen ^7,15. De retrovirale vector in dit protocol omvat het GFP-gen verbonden met de herprogrammeringfactoren via een interne Ribosoom Entry Sequence (IRES) en ^5. GFP expressie wordt gedreven door provirale LTR. De fibroblasten geïnfecteerd met deze virussen in eerste instantie geven de heldere GFP expressie. Eenmaal volledig opnieuw geprogrammeerd, zal iPSCs verliezen GFP expressie, die gemakkelijk zichtbaar onder een fluorescentie microscoop. In dit protocol beschrijven we de generatie van iPSCs van foetale en neonatale fibroblasten (Detroit 551 en BJ1). Dit is echter retrovirale vector gebruikt om iPSCs van normale volwassen fibroblasten en een aantal patiënten met Mendeliaanse en complexe aandoeningen ^4,16,17 genereren.

Eerder hebben we hebben de verandering in de celoppervlak markers in menselijke somatische cellen herprogrammeren van ^10. Er is een geleidelijke verandering van celoppervlaktemerkers. Fibroblasten express CD13, die wordt onderdrukt door de expressie van herprogrammering. Cellen die een herprogrammering het begin tot het SSEA4 te uiten, samen met GFP. Dan verliezen ze de expressieen van GFP via provirale silecing en express extra pluripotentie maker TRA1-60 ^10. De expressie van TRA1-60 is goed gecorreleerd met GFP silencing en de goed ontwikkelde teratoom formatie, wat suggereert dat TRA1-60 is een marker voor trouw opnieuw geprogrammeerd iPSCs. GFP silencing is het alternatief marker voor TRA1-60 expressie en maakt de identificatie van de IPSC kolonies zonder omslachtige live cell vlekken. Met behulp van het verlies van GFP expressie als een marker voor iPSCs, stamcelonderzoek wetenschappers die nog geen ervaring in de herprogrammering zal gemakkelijk en consequent te isoleren iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment