Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Summary

Une méthode pour générer de l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) via un rétrovirus médiation expression ectopique de OCT4, SOX2, KLF4 et MYC est décrite. Un moyen pratique pour identifier l'homme colonies iPSC fondées sur l'expression de GFP est également discuté.

Abstract

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont pluripotentes et une source précieuse pour cellulaires dans la modélisation des maladies in vitro et la médecine régénérative ^1. Il a été montré précédemment que des cellules somatiques humaines peuvent être reprogrammées pour la pluripotence par l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et Myc) et devenir cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2-4. Comme les CSEh, CSPi humaines sont pluripotentes et une source potentielle de cellules autologues. Nous décrivons ici le protocole de reprogrammer des cellules de fibroblastes humains avec les quatre facteurs de reprogrammation clonés dans GFP-rétroviral contenant un squelette ^4. En utilisant le protocole suivant, nous générons CSPi de l'homme dans les 3-4 semaines dans des conditions de culture des CSE humaines. Homme colonies iPSC ressemblent CSEh dans la morphologie et afficher la perte de la GFP de fluorescence en résultat de l'inactivation transgène rétroviral. colonies isolées iPSC mécaniquement sous un microsco fluorescencepe se comporter de la même façon que les CSEh. Dans ces cellules, nous avons détecter l'expression de multiples gènes de pluripotence et des marqueurs de surface.

Protocol

1. Reprogrammation par rétrovirus exprimant les facteurs de reprogrammation

1. Des fibroblastes humains sont cultivées dans un milieu des fibroblastes (10% de FBS dans DMEM avec Pen / Strep).
2. Un jour avant l'infection, la plaque de 1x10 ⁵ fibroblastes humains dans un puits d'une plaque à 6 puits.
3. Aspirer à moyen et à éliminer les cellules mortes et ajoutez 2 ml de milieu de fibroblastes frais. Ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 5 ng / ml.
4. Soigneusement ajouter la quantité appropriée de chacun des virus GFP-exprimer correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) ⁵ 5.
5. Un jour après l'infection, retirer le surnageant viral, laver trois fois avec 2 ml de PBS, puis ajoutez les 2 moyennes des fibroblastes ml.
6. Trois jours après l'infection, vérifier la fluorescence de la GFP et de reconstituer le puits avec 2 moyennes des fibroblastes ml.
7. Quatre jours après l'infection, la plaque de 1x10 cellules nourricières ⁴ / cm ² de fibroblastes embryonnaires irradiés (MEF) dans le milieu des fibroblastes SUR UNE10-cm boîte de Pétri revêtues de 0,1% de gélatine. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
8. Cinq jours après l'infection, se détacher des fibroblastes humains infectés avec 1 ml 0,05% typsin / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° C, et centrifuger pendant 5 minutes à 200 g. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu de fibroblastes. Transférer les cellules dans un pré-enduit la plaque de 10 cm.
9. Après 24 heures, remplacer le milieu de milieu de culture des CSEh (20% Knock-Out de remplacement du sérum, DMEM/F12, 0,1 ml non-acides aminés essentiels, 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamate, le bêta-merceptoethanol). Changer le support quotidien. ESC-like colonies commencent à apparaître 20 à 27 par jour après l'infection.

2. L'isolement et l'expansion des CSPi

1. Sous un microscope à fluorescence, vérifier l'absence de fluorescence de la GFP dans une colonie qui montre une morphologie similaire à CSEh.
2. En utilisant une pipette de 10 ul, choisissez individuels colonies IPSC et les placer dans un puits d'une gélatine et MEF-coaTed de 12 puits de plaque et complétée avec le milieu de CSEh. Changer le milieu tous les jours.
3. Pour repiquage, laver la plaque avec 1 ml de DMEM/F12, puis ajoutez 0,5 ml de collagénase, et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C.
4. Laver les cellules deux fois avec DMEM/F12.
5. Ajouter 2 ml de milieu CSEh frais. L'utilisation d'un lève-cellule, de briser les colonies en petits morceaux et détacher les cellules restantes de la plaque.
6. Transférer les morceaux de remises en suspension des colonies dans un puits d'une gélatine et MEF-enduit des plaques 6 puits.

3. Analyse par immunofluorescence de marqueurs pluripotentes

1. Laver les cellules trois fois avec du PBS et le fixer avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante.
2. Lavez délicatement les cellules trois fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min.
3. Bloquer non-spécifiques de liaison par incubation des cellules avec de la BSA 3% dans du PBS pendant deux heures.
4. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire nuit à 4 ° C.
<li> Laver les cellules trois fois avec du PBS et laisser incuber les cellules avec l'anticorps secondaire spécifique pendant une heure à température ambiante, le blindage de la lumière.
5. Laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter DAPI lors du dernier rinçage suivie d'une incubation à température ambiante pendant 5 minutes.
6. Détecter la coloration avec un microscope à fluorescence.

4. Quantitative en temps réel PCR pour les marqueurs pluripotentes

1. Isoler l'ARN total à partir des CSPi humaines dérivées de fibroblastes humains en utilisant le kit RNeasy de Qiagen.
2. Synthétiser l'ADNc de premier brin en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II.
3. Effectuer qPCR pour détecter les gènes de pluripotence en utilisant des amorces précédemment rapportés. ⁶

5. Les résultats représentatifs

1. Changement morphologique lors de la reprogrammation
   Nous fibroblastes humains infectés BJ1 et Detroit 551 avec un cocktail de rétrovirus transportant OCT4, SOX2, KLF4 et MYC,et étaient capables de détecter des changements morphologiques lors de la reprogrammation (Figure 1). Vingt-et-un jours après l'infection, nous reconnaissons de petites colonies iPSC par leur morphologie CSEh. En outre, nous reconnaissons CSPi par la fluorescence de la GFP. Les cellules souches pluripotentes, comme les CES et iPSCs, expriment la machinerie moléculaire de réprimer l'expression du gène proviral ^7-9. Notre unique vecteur rétroviral exprime la GFP en collaboration avec la reprogrammation des gènes par LTR rétroviral. Ainsi, les cellules exprimant la GFP en continu sont considérés à exprimer des transgènes sans gene silencing proviral. Fidèlement reprogrammées colonies iPSC qui acquièrent le réseau pluripotence moléculaire montrent l'absence d'expression de GFP (Figure 2) ^10.
   
2. Caractérisation de la pluripotence des CSPi humaines
   Nous avons analysé colonies issues de Detroit-551 fibroblastes par l'intermédiaire d'immunohistochimie avec Tra-1-81, Tra-1-60, AESS-4, SSEA-3, et des anticorps OCT4 NANOG ( (figure 3A). Nous avons également analysé l'expression génique par l'intermédiaire RT-PCR quantitative d'analyse. Nous avons observé que l'expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC et NANOG a été significativement augmenté par rapport à des cellules de fibroblastes parentaux, mais en rapport avec celle de CSEh H9 (figure 3B).

Figure 1. Les modifications morphologiques des rétrovirus-infectés fibroblastes humains. (AD) Progressive changement morphologique dans les colonies de Detroit-551 fibroblastes infectés avec des facteurs de reprogrammation. Jour 5 (A), Jour 10 (B), Jour 14 (C), jour 21 (D). Les cellules montrent la morphologie de CSEh comme après 21 jours.

Figure 2. Représentant GFP fluorescente expression dans les cellules subissant une reprogrammation. 4, et incubées dans un milieu CSEh pendant quatre semaines. Fibroblastes BJ (A, B) et Detroit 551 (C, D) montrent similaires morphologique. De jour 21, les colonies GFP négatifs commencent à se former, qui représentent les CSPi de bonne foi ^10. (E, F) montrent transformé Detroit 551 cellules qui n'ont pas subi une reprogrammation appropriée. (A, C, E) des colonies sous vue contraste de phase. (B, D) correctement reprogrammé les cellules qui montrent le silence GFP. (F) expression de la GFP lumineux de la colonie transformée.

Figure 3. Caractérisation des humains cellules souches pluripotentes induites. (A) de l'homme des colonies de cellules iPS-551-K1 expriment des marqueurs communs aux cellules pluripotentes. Coloration DAPI indique le contenu de la cellule total par domaine. (B) quantitative en temps réel-PCR (RT-qPCR) pour l'expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC dans f parentaleibroblast, 551-iPS-K1 CSPi et H9 cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les données ont été normalisées par rapport gène de ménage β-actine et tracées par rapport au niveau d'expression dans les cellules de fibroblastes parentaux ^4.

Discussion

L'expression de facteurs de transcription quatre fibroblastes humains à la reprogrammation des CSPi. De nombreuses tentatives ont été faites pour produire des CSPi humaines en utilisant des approches non-intégration ou non-génétiques pour générer CSPi cliniquement sûres. Jusqu'à présent, ces méthodes montrent l'efficacité très faible et nécessitent une optimisation plus poussée pour améliorer la reproductibilité ^11-14. Rétro-méthodes ou lentiviral sont facilement utilisée pour calculer et appliquer CSPi pour l'homme dans les modèles in vitro de maladies, qui sont moins dépendantes sur les questions de sécurité engendrés par l'intégration virale. Reprogrammation méthode décrite ici est disponible pour la dérivation efficace des CSPi humaines. Sélection des CSPi humaines est principalement basée sur la morphologie des colonies qui ressemble CES de l'homme. Plus important encore, notre méthode tire parti de la fonctionnalité de réduire au silence des répétitions terminales rétrovirales longue (LTR) dans les cellules souches pluripotentes ^7,15. Le vecteur rétroviral utilisé dans le présent protocole contient le gène de la GFP liée à la reprogrammationfacteurs par le biais d'une séquence d'entrée interne des ribosomes (IRES) et ^5. Expression de la GFP est entraînée par LTR proviral. Les fibroblastes infectés par ces virus montre d'abord l'expression de la GFP lumineux. Une fois entièrement reprogrammé, CSPi perdra expression de la GFP, qui est facilement visualisées sous un microscope à fluorescence. Dans ce protocole, nous avons décrit la génération de CSPi à partir de fibroblastes fœtales et néonatales (Detroit 551 et BJ1). Cependant, ce vecteur rétroviral a été utilisé pour générer à partir de fibroblastes CSPi adultes normaux ainsi qu'une variété de patients souffrant de troubles mendéliens et complexe ^4,16,17.

Précédemment, nous avons analysé l'évolution des marqueurs de surface cellulaires au cours de cellules somatiques humaines reprogrammation ^10. Il ya un changement progressif dans les marqueurs de surface cellulaire. Fibroblastes expriment CD13, ce qui est réprimé par l'expression de la reprogrammation. Les cellules en cours de démarrage à la reprogrammation d'exprimer SSEA4 avec la GFP. Puis, ils perdent l'expressisur de la GFP par l'intermédiaire silecing proviral et expresse machine supplémentaire pluripotence TRA1-60 ^10. L'expression de TRA1-60 est bien corrélé avec silencieux GFP et la formation de tératome bien développé, ce qui suggère que TRA1-60 est un marqueur de CSPi fidèlement reprogrammées. GFP silence est le marqueur de remplacement pour TRA1-60 expression et permet l'identification des colonies iPSC sans coloration cellulaire laborieuse en direct. Utilisation de la perte d'expression de la GFP comme marqueur de CSPi, endiguer scientifiques des cellules qui n'ont aucune expérience préalable dans la reprogrammation sera facilement et systématiquement isoler CSPi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment