Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Summary

En metode for å generere menneskeskapt påvirkning pluripotent stamceller (iPSCs) via retrovirus-mediert ektopisk uttrykk for OCT4, er Sox2, KLF4 og MYC beskrevet. En praktisk måte å identifisere menneskelige iPSC kolonier basert på GFP uttrykket er også diskutert.

Abstract

Humane embryonale stamceller (hESCs) er pluripotent og en uvurderlig mobilnettet kilder for in vitro sykdom modellering og regenerativ medisin ^en. Det er tidligere vist at humane somatiske celler kan omprogrammeres til pluripotency ved ektopisk uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og myc) og bli indusert pluripotent stamceller (iPSCs) ^2-4. Som hESCs, menneskelige iPSCs er pluripotent og en potensiell kilde for autologe celler. Her beskriver vi protokollen for å omprogrammere menneskelige fibroblast celler med de fire omprogrammering faktorene klonede inn GFP-inneholder retrovirale ryggrad ^4. Bruk følgende protokoll, genererer vi menneskelige iPSCs i 3-4 uker etter menneskelig ESC kultur tilstand. Menneskelige iPSC kolonier likne hESCs i morfologi og vise tap av GFP fluorescens som følge av retrovirale transgenet stanse. iPSC kolonier isolert mekanisk under en fluorescens microscope oppføre seg i en lignende måte som hESCs. I disse cellene, oppdager vi uttrykket av flere pluripotency gener og overflate markører.

Protocol

1. Omprogrammering av Retrovirus Uttrykke Reprogrammering faktorer

1. Menneskelige fibroblaster dyrkes i fibroblast medium (10% FBS i DMEM med penn / Strep).
2. En dag før infeksjon, plate 1x10 ⁵ humane fibroblaster i ett godt av en seks-brønns plate.
3. Sug medium for å fjerne døde celler og tilsett 2 ml av frisk fibroblast medium. Legg protamin sulfat på en endelig konsentrasjon på 5 mikrogram / ml.
4. Forsiktig legge til riktig mengde av hver GFP-uttrykke virus som tilsvarer et mangfold av infeksjon (MOI) ⁵ 5.
5. En dag etter smitte, fjerne viral supernatanten, vask tre ganger med 2 ml PBS, legg deretter 2 ml fibroblast medium.
6. Tre dager etter smitte, sjekk GFP fluorescens og fylle brønnen med 2 ml fibroblast medium.
7. Fire dager etter smitte, plate 1x10 ⁴ / cm ² av bestrålt mus embryonale fibroblast (MEFs) mater celler i fibroblast medium inn mot et10-cm petriskål belagt med 0,1% gelatin. Inkuber ved 37 ° C over natten.
8. Fem dager etter smitte, løsner smittet menneskelige fibroblaster med 1 ml 0,05% typsin / EDTA i 5 minutter ved 37 ° C, og sentrifuger i 5 minutter ved 200 gr. Aspirer medium og resuspender cellene med 10ml av fibroblast medium. Overfør cellene til en pre-belagt 10-cm plate.
9. Etter 24 timer, må du bytte medium med hESC kultur medium (20% Knock-Out serum erstatning, DMEM/F12, 0,1 ml Non-essensielle aminosyrer, 4 ng / ml bFGF, penn / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol). Endre medium daglig. ESC-lignende kolonier vil begynne å vises etter dag 20-27 etter smitte.

2. Isolering og Utvidelse av iPSCs

1. Under en fluorescens mikroskop, sjekk for fraværet av GFP fluorescens i en koloni som viser en lignende morfologi til hESCs.
2. Bruke en 10 mL pipette, plukke individuelle iPSC kolonier og plassere dem i en brønn av en gelatin-og MEF-CoAted 12-brønn plate og supplert med hESC medium. Endre medium daglig.
3. For passaging, vaske tallerkenen med 1 ml DMEM/F12, deretter tilsett 0,5 ml collagenase, og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
4. Vask cellene to ganger med DMEM/F12.
5. Tilsett 2 ml av frisk hESC medium. Ved hjelp av en celle løfter, bryte opp koloniene i små biter og ta gjenværende celler fra platen.
6. Overfør resuspendert stykker av koloniene i en brønn av en gelatin-og MEF-belagt seks-brønns plate.

3. Immunfluorescens Analyse av pluripotent Markers

1. Vask cellene tre ganger med PBS og fikse med 4% paraformaldehyde i 20 min ved romtemperatur.
2. Vask forsiktig cellene tre ganger med PBS og permeabilize med 0,2% Triton X-100 i PBS i 30 min.
3. Blokker ikke-spesifikk binding ved å inkubere celler med 3% BSA i PBS i to timer.
4. Inkuber cellene med primær antistoff natten ved 4 ° C.
<li> Vask cellene tre ganger med PBS og Inkuber cellene med sekundære antistoff i én time i romtemperatur, skjerming mot lys.
5. Vask cellene tre ganger med PBS og legg DAPI under siste vask etterfulgt av inkubasjon ved romtemperatur i 5 minutter.
6. Oppdage farging med en fluorescens mikroskop.

4. Kvantitativ Real-time PCR-analyse for pluripotent Markører

1. Isoler total RNA fra de menneskelige iPSCs avledet fra humant fibroblaster med Qiagen sin RNeasy kit.
2. Syntetisere den første tråd cDNA ved hjelp Hevet II revers transkriptase.
3. Utfør qPCR å oppdage pluripotency gener med primere tidligere rapportert. ⁶

5. Representative Resultater

1. Morfologisk endring under omprogrammering
   Vi smittet menneskelige fibroblaster BJ1 og Detroit 551 med en cocktail av retrovirus bærer OCT4, Sox2, KLF4 og MYC,og var i stand til å oppdage morfologiske endringer under omprogrammering (figur 1). Tjueen dager etter smitte, erkjenner vi små iPSC kolonier av deres hESC-lignende morfologi. Videre erkjenner vi iPSCs av GFP fluorescens. Pluripotent stamceller, for eksempel ESCs og iPSCs og uttrykke det molekylære maskineri for å undertrykke proviral genuttrykk ^7-9. Vår unike retrovirale vektor uttrykker GFP sammen med omprogrammering gener ved retrovirale LTR. Dermed blir cellene kontinuerlig uttrykker GFP anses å uttrykke transgener uten proviral genet Silencing. Trofast omprogrammeres iPSC koloniene som anskaffer den pluripotency molekylære nettverk viser fravær av GFP uttrykk (figur 2) ^10.
   
2. Karakterisering av pluripotency menneskelige iPSCs
   Vi analyserte kolonier som stammer fra Detroit-551 fibroblaster via immunhistokjemi med Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 og NANOG antistoffer ( (figur 3A). Vi har også analysert genekspresjon via kvantitativ RT-PCR-analyse. Vi observerte at uttrykket av OCT4, ble Sox2, KLF4, MYC og NANOG betydelig økt i forhold til foreldrenes fibroblast celler, men i forhold at av H9 hESCs (Figur 3B).

Figur 1. Morfologiske endringer av retrovirus-infiserte humane fibroblaster. (AD) Progressive morfologisk endring i kolonier fra Detroit-551 fibroblaster smittet med omprogrammering faktorer. Dag 5 (A), Dag 10 (B), Dag 14 (C), dag 21 (D). Celler viser hESC-lignende morfologi etter 21 dager.

Figur 2. Representant GFP fluorescerende uttrykk i cellene gjennomgår omprogrammering. fire, og inkubert i hESC medium for fire uker. BJ fibroblaster (A, B) og Detroit 551 (C, D) viser lignende morfologisk. Fra dag 21, GFP negative kolonier begynner å danne, representere som bona fide iPSCs ^10. (E, F) viser forvandlet Detroit 551 celler som ikke har gjennomgått tilstrekkelig omprogrammering. (A, C, E) kolonier under fase kontrast visning. (B, D) skal omprogrammeres celler som viser GFP Silencing. (F) lys GFP uttrykk fra forvandlet koloni.

Figur 3. Karakterisering av de menneskelige induserte pluripotent stamceller. (A) Menneskelige 551-IPS-K1 celle kolonier uttrykke markører som er felles for pluripotent celler. DAPI farging angir totalt celleinnhold per felt. (B) Kvantitativ sanntids-PCR (RT-qPCR) for uttrykk av OCT4, Sox2, KLF4, MYC i foreldrenes fibroblast, 551-IPS-K1 iPSCs og H9 humane embryonale stamceller (hESCs). Data ble normalisert mot β-actin husholdningsgenet og plottet i forhold til uttrykket nivå i foreldrenes fibroblast celler ^4.

Discussion

Uttrykk av fire transkripsjonsfaktorer omprogrammerer menneskelige fibroblaster til iPSCs. Mange forsøk ble gjort for å generere menneskelige iPSCs med ikke-integrere eller ikke-genetiske tilnærminger for å generere klinisk trygge iPSCs. Så langt disse metodene viser svært lav virkningsgrad og krever ytterligere optimalisering for å forbedre reproduserbarhet ^11-14. Retro-eller lentiviral metoder lett brukes til å utlede og anvende iPSCs for human in vitro sykdom modeller, som er mindre avhengig av de sikkerhetsmessige problemer forårsaket av viral integrering. Omprogrammering metoden som er beskrevet her er tilgjengelig for effektiv avledning av menneskelige iPSCs. Valg av menneskelige iPSCs er primært basert på kolonien morfologi som ligner menneskelige ESCs. Enda viktigere, tar vår metode nytte av funksjonen stanse av retrovirale lange terminale repetisjoner (LTR) i pluripotent stamceller ^7,15. Den retrovirale vektor brukt i denne protokollen inneholder GFP-genet knyttet til omprogrammeringfaktorene via en intern ribosomet oppføring Sequence (IRES) og ^5. GFP uttrykk er drevet av proviral LTR. De fibroblaster smittet med disse virusene utgangspunktet viser den lyse GFP uttrykket. Når du er fullt omprogrammeres, vil iPSCs miste GFP uttrykk, noe som er lett å visualisere under et fluorescens mikroskop. I denne protokollen, beskrev vi den generasjonen iPSCs fra føtale og neonatale fibroblaster (Detroit 551 og BJ1). Men denne retrovirale vektoren blitt brukt til å generere iPSCs fra normale voksne fibroblaster samt en rekke pasienter med mendelsk og sammensatte lidelser ^4,16,17.

Tidligere har vi analysert endring i mobilnettet overflate markører under human somatisk celle omprogrammering ^10. Det er en progressiv endring i celleoverflaten markører. Fibroblaster CD13 Express, som er undertrykt av uttrykket av omprogrammering. Celler gjennomgår omprogrammering start å uttrykke SSEA4 sammen med GFP. Deretter mister de expressipå av GFP via proviral silecing og ekspress ekstra pluripotency maker TRA1-60 ^10. Uttrykk for TRA1-60 er godt korrelert med GFP Silencing og velutviklet teratom formasjon, noe som tyder på at TRA1-60 er en markør for trofast omprogrammeres iPSCs. GFP Silencing er alternativet markør for TRA1-60 uttrykk og tillater identifisering av iPSC kolonier uten arbeidskrevende levende celle farging. Bruke tap av GFP uttrykk som en markør for iPSCs, stamceller forskere som ikke har erfaring i omprogrammering vil lett og konsekvent isolere iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment