Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Summary

Метод для создания человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) с помощью ретровируса, опосредованного эктопической экспрессии Oct4, Sox2, KLF4 и MYC описано. Практический способ определения человека IPSC колоний на основе выражения GFP также обсуждается.

Abstract

Человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) являются плюрипотентные и бесценный сотовой источники в пробирке моделирования болезни и регенеративная медицина ^1. Ранее было показано, что соматических клеток человека можно перепрограммировать на плюрипотентности по эктопической экспрессии четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, Klf4 и Myc) и стать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) ^2-4. Как и ЭСК, человеческие иПСК являются плюрипотентные и потенциальный источник аутологичных клеток. Здесь мы опишем протокол для перепрограммирования человеческих клеток фибробластов с помощью четырех факторов перепрограммирования клонировали в GFP-содержащих ретровирусных основа ^4. Используя следующий протокол, мы получаем человека иПСК в течение 3-4 недель в человеческое состояние культуры ESC. Человека IPSC колонии напоминают ЭСК по морфологии и отображения потери флуоресценции GFP в результате антиретровирусной глушителей трансгена. IPSC колонии изолированы механически под флуоресцентным microscoPE себя аналогичным образом, как ЭСК. В этих клетках, мы обнаруживаем выражение нескольких генов плюрипотентности и поверхностных маркеров.

Protocol

1. Перепрограммирование по ретровируса выражая Перепрограммирование факторы

1. Фибробласты человека культивируют в фибробластов среды (10% FBS в DMEM с ручкой / Strep).
2. За день до инфекции, пластина 1х10 ⁵ фибробластов человека в одну и 6-луночного планшета.
3. Аспирируйте среду, чтобы удалить мертвые клетки и добавьте 2 мл свежей среды фибробластов. Добавить протамина сульфата в конечной концентрации 5 мкг / мл.
4. Аккуратно добавить соответствующее количество каждого выражения GFP-вируса соответствующие множественности заражения (МВД) ⁵ 5.
5. На следующий день после инфекции, вирусных удалить супернатант, вымыть три раза с 2 мл PBS, затем добавить 2 мл фибробластов среды.
6. Через три дня после инфекции, проверить флуоресценции GFP и пополнения и с 2 средних фибробластов мл.
7. Через четыре дня после заражения, пластины 1x10 ⁴ / см ² облученных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) фидерных клеток фибробластов в среду на10 см, чашка Петри покрыты 0,1% желатина. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
8. Через пять дней после заражения, отсоедините инфицированных фибробластов человека с 1 мл 0,05% typsin / ЭДТА в течение 5 минут при 37 ° С, а центрифуги в течение 5 минут при 200 гр. Аспирируйте среды и ресуспендирования клеток фибробластов 10 мл среды. Передача клеток в предварительно покрытых 10-см пластины.
9. После 24 часов, замените носитель с чЭСК культуральной среде (20% Knock-out сыворотки замены DMEM/F12, 0,1 мл без незаменимых аминокислот, 4 нг / мл bFGF, ручка / Strep / глутамат, бета-merceptoethanol). Изменение средних ежедневно. ESC-колонии, как начнут появляться днем ​​20-27 после заражения.

2. Выделение и расширение иПСК

1. Под флуоресцентным микроскопом, проверьте отсутствие флуоресценции GFP в колонии, которая показывает аналогичную морфологии ЭСК.
2. С помощью пипетки 10 мкл, подобрать индивидуальный IPSC колоний и поместить их в одну лунку желатин и MEF-шаТед 12-луночного планшета и дополнены чЭСК среды. Изменение средних ежедневно.
3. Для пассажей, помыть тарелку с 1 мл DMEM/F12, затем добавьте 0,5 мл коллагеназы и инкубировать 10 минут при 37 ° C.
4. Промойте клетки дважды DMEM/F12.
5. Добавить 2 мл свежей среды чЭСК. Использование сотового ручка, разбить колоний на мелкие кусочки и снять оставшиеся клетки от пластинки.
6. Передача ресуспендированного части колоний в одну лунку желатин и MEF-покрытием 6-луночного планшета.

3. Иммунофлуоресценции анализа плюрипотентных маркеров

1. Промойте клетки три раза PBS и закрепите с помощью 4% параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре.
2. Осторожно промыть клетки три раза PBS и permeabilize 0,2% Тритон Х-100 в PBS в течение 30 мин.
3. Блок неспецифическое связывание путем инкубации клеток с 3% BSA в PBS в течение двух часов.
4. Инкубируйте клетки с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C.
<LI> Промойте клетки три раза PBS и инкубировать клеток со специфическими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре, защищая от света.
5. Промойте клетки три раза PBS и добавьте DAPI в течение последних мыть с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 5 минут.
6. Обнаружение окраски флуоресцентного микроскопа.

4. Количественная ПЦР в реальном времени анализ на маркеры плюрипотентных

1. Изолировать общей РНК из человеческих иПСК полученных из фибробластов человека RNeasy использованием комплекта Qiagen в.
2. Обобщить первой цепи кДНК использованием Надстрочный II обратной транскриптазы.
3. Выполните КПЦР для обнаружения генов плюрипотентности использованием праймеров сообщалось ранее ^6.

5. Представитель Результаты

1. Морфологические изменения при перепрограммировании
   Мы инфицированных фибробластов человека BJ1 и Детройта 551 коктейль из ретровирусов проведение Oct4, Sox2, KLF4 и MYC,и смогли обнаружить морфологических изменений при перепрограммировании (рис. 1). Двадцать один день после заражения, мы признаем, небольшие колонии IPSC их чЭСК морфологией. Кроме того, мы признаем, иПСК по флуоресценции GFP. Плюрипотентных стволовых клеток, таких, как стволовые клетки и иПСК, выражают молекулярные машины для подавления экспрессии генов провирусной ^7-9. Наша уникальная ретровирусных вектор выражает GFP вместе с перепрограммирования генов ретровирусных LTR. Таким образом, клетки непрерывно выражения GFP считаются выразить без трансгенов провирусной глушителей гена. Искренне перепрограммировать IPSC колоний, которые приобретают плюрипотентности молекулярной сети показывают отсутствие GFP выражении (рис. 2) ^10.
   
2. Характеристика плюрипотентности человека иПСК
   Мы проанализировали колонии, полученные из Детройта-551 фибробластов с помощью иммуногистохимии с TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 и NANOG антитела ( (рис. 3А). Мы также проанализировали экспрессию генов с помощью количественной ПЦР-анализа. Мы заметили, что выражение Oct4, Sox2, KLF4, MYC и NANOG была значительно увеличена по сравнению с родительскими клетками фибробластов, но соразмерно у H9 ЭСК (рис. 3В).

Рисунок 1. Морфологические изменения ретровирус-инфицированных фибробластов человека. (AD), Прогрессивная морфологические изменения в колониях из Детройта-551 фибробластов, инфицированных перепрограммирования факторов. День 5 (А), 10 день (B), 14-й день (C), 21-й день (D). Клетки показать чЭСК морфологией после 21 дней.

Рисунок 2. Представитель GFP флуоресцентные экспрессии в клетках проходит перепрограммирования. 4, и инкубировали в чЭСК среду в течение четырех недель. BJ фибробластов (A, B) и Detroit 551 (C, D) показывают, что аналогичные морфологические. С 21-й день, GFP негативных колоний начинают формироваться, которые представляют собой добросовестные иПСК ^10. (E, F) показывают, превращается Детройта 551 клеток, которые не прошли надлежащей перепрограммирования. (A, C, E) колоний на этапе зрения контраста. (B, D), должным образом перепрограммировать клетки, которые показывают GFP глушителей. (F) яркое выражение GFP из трансформированных колоний.

Рисунок 3. Характеристика человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. (А) человека 551-IPS-K1 колонии клетки выразить маркеры, общие для плюрипотентных клеток. DAPI окрашивания указывает на общее содержание клеток на поле. (B) количественные реальном времени ПЦР (RT-КПЦР) для выражения Oct4, Sox2, KLF4, MYC в родительских еibroblast, 551-IPS-K1 иПСК и H9 человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Данные были нормированы к β-актина хозяйства генов и построены по сравнению с уровнем экспрессии в родительских клеток фибробластов ^4.

Discussion

Выражение из четырех транскрипционных факторов перепрограммирует фибробластов человека для иПСК. Многие были предприняты попытки создания человеческой иПСК с использованием не-интеграция или не-генетические подходы для получения клинически безопасной иПСК. До сих пор эти методы показывают крайне низкую эффективность и требуют дальнейшей оптимизации для улучшения воспроизводимости ^11-14. Ретро-или лентивирусов методы легко использованы для получения и применения иПСК для человека в лабораторных моделей болезни, которые меньше зависят от вопросов безопасности вызваны вирусной интеграции. Перепрограммирование метод, описанный здесь для эффективного вывода человека иПСК. Выбор человека иПСК, прежде всего, на основе морфологии колоний, который напоминает человеческие эмбриональные клетки. Более того, наш метод использует особенности молчание ретровирусных длинных концевых повторов (LTR) в плюрипотентные стволовые клетки ^7,15. Ретровирусных векторов, используемые в настоящем протоколе содержится ген GFP, связанные с перепрограммированиемпропускается через внутренний Рибосома последовательности Entry (IRES) и ^5. GFP выражения приводится провирусной LTR. Фибробластов, инфицированных этими вирусами сначала показать яркое выражение GFP. После полной перепрограммировать, иПСК потеряет GFP выражение, которое легко визуализировать под флуоресцентным микроскопом. В этом протоколе, мы описали поколения иПСК из плода и новорожденного фибробластов (Detroit 551 и BJ1). Тем не менее, это ретровирусных вектор был использован для создания иПСК от нормальных фибробластов взрослого, а также различных пациентов с менделевской и сложных нарушений ^4,16,17.

Ранее мы проанализировали изменения в клеточных поверхностных маркеров в человеческих соматических клеток перепрограммирования ^10. Существует прогрессивные изменения в маркеры клеточной поверхности. Фибробласты экспресс-CD13, который подавляется экспрессия перепрограммирования. Клетки проходят перепрограммирования начала выражать SSEA4 вместе с GFP. Тогда они теряют expressiна о GFP через провирусной silecing и выражают дополнительные плюрипотентности производитель TRA1-60 ^10. Выражение TRA1-60 хорошо согласуется с GFP глушителей и хорошо развитой тератома образование, предполагая, что TRA1-60 является маркером точно перепрограммировать иПСК. GFP глушителей является альтернативой маркером TRA1-60 выражение и позволяет идентифицировать IPSC колонии без трудоемкого окрашивания живых клеток. Использование потеря GFP выражение в качестве маркера для иПСК, стволовых клеток ученые, которые не имеют опыта работы в перепрограммировании будет легко и последовательно изолировать иПСК.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment