La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Summary

Un método para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a través de retrovirus mediada por la expresión ectópica de Oct4, Sox2, Klf4 y MYC se describe. Una forma práctica para identificar las colonias de humanos IPSC basadas en la expresión de GFP también se discute.

Abstract

Las células madre embrionarias (hESCs) son pluripotentes y una fuente inestimable para celulares en el modelado de la enfermedad in vitro y la medicina regenerativa ^1. Se ha demostrado previamente que las células somáticas humanas pueden ser reprogramadas para pluripotencia por la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y Myc) y se convierten en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ^2-4. Al igual que hESCs, iPSCs humanos son pluripotentes y una fuente potencial de células autólogas. A continuación se describe el protocolo de reprogramar las células de fibroblastos humanos con los cuatro factores de reprogramación clonados en las buenas prácticas agrarias que contienen columna vertebral de retrovirales ^4. Utilizando el protocolo siguiente, generamos iPSCs humanos en 3-4 semanas bajo condiciones de la cultura humana ESC. Humanos colonias IPSC se parecen mucho a hESCs en la morfología y mostrar la pérdida de la fluorescencia de GFP como resultado de silenciamiento de transgenes retrovirales. colonias aisladas IPSC mecánicamente bajo una fluorescencia microscópicaPE se comportan de una manera similar como hESCs. En estas células, se detecta la expresión de múltiples genes pluripotencia y marcadores de superficie.

Protocol

1. Reprogramación por retrovirus Expresando factores de reprogramación

1. Fibroblastos humanos se cultivaron en medio de fibroblastos (10% de FBS en DMEM con Pen / Strep).
2. Un día antes de la infección, la placa de 1x10 ⁵ fibroblastos humanos en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
3. Aspirar el medio para eliminar las células muertas y añadir 2 ml de medio de fibroblastos fresco. Añadir sulfato de protamina a una concentración final de 5 mg / ml.
4. Añadir cuidadosamente la cantidad apropiada de cada virus que expresan GFP correspondiente a una multiplicidad de infección (MOI) ⁵ 5.
5. Un día después de la infección, separar el sobrenadante viral, lavar tres veces con 2 ml de PBS, a continuación, agregar 2 ml de medio de fibroblastos.
6. Tres días después de la infección, consulte la fluorescencia de GFP y reponer el bien con 2 ml de medio de fibroblastos.
7. Cuatro días después de la infección, la placa de 1x10 ⁴ / cm ² de fibroblastos de embriones de ratón irradiados (MEFs) células alimentadoras en medio de fibroblastos sobre una10-cm placa de Petri revestidas con gelatina al 0,1%. Incubar a 37 ° C durante la noche.
8. Cinco días después de la infección, separar los fibroblastos humanos infectados con 1 ml de 0,05% typsin / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C, y se centrifuga durante 5 minutos a 200 g. Aspirar el medio y resuspender las células con 10 ml de medio de fibroblastos. Transferir las células en un pre-recubiertas 10-cm placa.
9. Después de 24 horas, vuelva a colocar el medio con un medio de hESC la cultura (20% Knock-Out reemplazo de suero, DMEM/F12, 0,1 ml no aminoácidos esenciales, de 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamato, el beta-merceptoethanol). Cambiar el medio día. ESC-como colonias comenzarán a aparecer durante el día 20-27 después de la infección.

2. El aislamiento y la expansión de iPSCs

1. Bajo un microscopio de fluorescencia, comprobar la ausencia de la fluorescencia de GFP en una colonia que muestra una morfología similar a hESCs.
2. Con una pipeta 10 l, escoja colonias individuales IPSC y colocarlos en un pocillo de una gelatina y el MEF-CoATed de 12 pocillos y se completará con medio de hESC. Cambiar medio diario.
3. Para los pases, se lava la placa con 1 ml de DMEM/F12, a continuación, agregar 0,5 ml de colagenasa, y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C.
4. Se lavan las células dos veces con DMEM/F12.
5. Añadir 2 ml de medio de hESC fresco. El uso de un elevador de la célula, romper las colonias en pequeños pedazos y separar las células restantes de la placa.
6. Transferir los trozos de colonias resuspendidas en un pocillo de una gelatina y MEF recubierto-6-así placa.

3. El análisis de inmunofluorescencia de marcadores pluripotentes

1. Se lavan las células tres veces con PBS y fijar con paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente.
2. Lave suavemente las células tres veces con PBS y permeabilizar con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 30 min.
3. Bloque no específicos de unión mediante la incubación de células con 3% de BSA en PBS durante dos horas.
4. Se incuban las células con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C.
<li> Se lavan las células tres veces con PBS y se incuban las células con anticuerpo secundario específico durante una hora a temperatura ambiente, protegiendo de la luz.
5. Se lavan las células tres veces con PBS y DAPI complemento durante el último lavado, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Detectar la tinción con un microscopio de fluorescencia.

4. Cuantitativo en tiempo real PCR para los marcadores pluripotentes

1. Aislar ARN total de las iPSCs humanos derivados de fibroblastos humanos utilizando RNeasy kit de Qiagen.
2. Sintetizar el cDNA primer capítulo de la transcriptasa reversa utilizando SuperScript II.
3. Realizar qPCR para la detección de genes usando cebadores pluripotencia se informó anteriormente. ⁶

5. Los resultados representativos

1. El cambio morfológico durante la reprogramación
   Estamos infectados fibroblastos humanos BJ1 y Detroit 551 con un cóctel de los retrovirus que llevan Oct4, Sox2, Klf4 y MYC,y fueron capaces de detectar cambios morfológicos durante la reprogramación (Figura 1). Veintiún días después de la infección, reconocemos pequeñas colonias de IPSC por su hESC-como la morfología. Además, reconocemos iPSCs por la fluorescencia de GFP. Las células madre pluripotentes, como los CES e IPSCs, expresan la maquinaria molecular para reprimir la expresión del gen proviral ^7-9. Nuestro único vector retroviral expresa GFP junto con los genes reprogramación por LTR retroviral. Así, las células que expresan GFP de forma continua se consideran para expresar transgenes, sin silenciamiento génico proviral. Fielmente reprogramadas colonias IPSC que adquieren la red molecular pluripotencia muestran la ausencia de expresión de las buenas prácticas agrarias (Figura 2) ^10.
   
2. Caracterización de la pluripotencia de iPSCs humanos
   Se analizaron colonias derivadas de Detroit-551 fibroblastos a través de inmunohistoquímica con Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, 3-SSEA, Oct4 y anticuerpos NANOG ( (Figura 3). También se analizó la expresión génica a través de RT-PCR cuantitativa análisis. Hemos observado que la expresión de Oct4, Sox2, Klf4, MYC y NANOG se incrementó significativamente en comparación con las células de fibroblastos de los padres, sino a la de las H9 hESCs (Figura 3B).

Figura 1. Los cambios morfológicos de los infectados por retrovirus fibroblastos humanos. (AD), el cambio progresivo morfológica en las colonias de Detroit-551 fibroblastos infectados con factores de reprogramación. Día 5 (A), el día 10 (B), el día 14 (C), el día 21 (D). Las células muestran la morfología hESC-al igual que después de 21 días.

Figura 2. Representante de las buenas prácticas agrarias fluorescente de expresión en las células sometidas a una reprogramación. 4, y se incubaron en medio hCME durante cuatro semanas. Fibroblastos BJ (A, B) y Detroit 551 (C, D) muestran similares morfológica. Desde el día 21, las colonias de las buenas prácticas agrarias negativos comienzan a formarse, que representan las iPSCs de buena fe ^10. (E, F) muestran transformado Detroit 551 células que no se han sometido a una reprogramación adecuada. (A, C, E) colonias bajo punto de vista de contraste de fase. (B, D) adecuadamente reprogramado las células que muestran el silenciamiento de las buenas prácticas agrarias. (F) la expresión de GFP luminosa de la colonia transformada.

Figura 3. Caracterización de las células madre pluripotentes inducidas (A). Humanos 551-iPS-K1 colonias de células expresan marcadores comunes a las células pluripotentes. DAPI indica el contenido total de células por campo. (B) cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR) para la expresión de Oct4, Sox2, Klf4, MYC en f los padresibroblast, 551-IPS-K1 iPSCs y H9 células madre embrionarias humanas (hESCs). Los datos se normalizaron contra limpieza de genes β-actina y trazan en relación con el nivel de expresión en las células de fibroblastos parentales ^4.

Discussion

Expresión de los cuatro factores de transcripción reprograma fibroblastos humanos a iPSCs. Muchos intentos se hicieron para generar iPSCs humanos utilizando los enfoques no integrar o no genéticos para generar iPSCs clínicamente seguros. Hasta ahora, estos métodos presentan una eficiencia extremadamente baja y requieren una mayor optimización para mejorar la reproducibilidad ^11-14. Métodos de retro-o lentiviral son fácilmente utilizados para obtener y aplicar iPSCs para personas en modelos de enfermedad in vitro, que son menos dependientes de los problemas de seguridad causados ​​por la integración viral. La reprogramación método descrito aquí está disponible para la derivación eficaz de CMPi humanos. Selección de iPSCs humanos se basa principalmente en la morfología de la colonia que se asemeja a los CES humanos. Más importante aún, nuestro método se aprovecha de la función de silenciamiento de las repeticiones terminales largas (LTR retrovirales) en células madre pluripotentes ^7,15. El vector retroviral utilizado en este protocolo contiene el gen GFP vinculada a la reprogramaciónfactores a través de una secuencia de entrada interna del ribosoma (IRES) y ^5. La expresión de GFP es impulsado por LTR proviral. Los fibroblastos infectados con estos virus inicialmente muestran la expresión de las buenas prácticas agrarias brillante. Una vez totalmente reprogramado, iPSCs perderá la expresión de GFP, lo que es fácil de visualizar bajo un microscopio de fluorescencia. En este protocolo, que describe la generación de iPSCs de fibroblastos fetales y neonatales (Detroit 551 y BJ1). Sin embargo, este vector retroviral se ha utilizado para generar CMPi de fibroblastos normales de un adulto, así como una variedad de pacientes con trastornos mendelianos y complejos ^4,16,17.

Anteriormente hemos analizado el cambio en los marcadores de superficie celular durante la reprogramación de células somáticas humanas ^10. Hay un cambio progresivo en los marcadores de la superficie celular. Los fibroblastos expresan CD13, que es reprimida por la expresión de reprogramación. Células en proceso de inicio de la reprogramación de expresar SSEA4, junto con las buenas prácticas agrarias. Entonces, pierden la expressiel de las buenas prácticas agrarias a través de silecing proviral y expresa el fabricante más pluripotencia TRA1-60 ^10. La expresión de TRA1-60 se correlaciona bien con las buenas prácticas agrarias y el silenciamiento de la formación de teratomas bien desarrollado, lo que sugiere que TRA1-60 es un marcador de iPSCs fielmente reprogramadas. Las buenas prácticas agrarias silenciamiento es el marcador alternativa para TRA1-60 expresión y permite la identificación de las colonias de IPSC sin tinción laboriosa de células vivas. Uso de la pérdida de expresión de GFP como un marcador de iPSCs, los científicos provienen de células que no tienen experiencia previa en la reprogramación será fácil y sistemática aislar iPSCs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment