Summary
Vi demonstrerer FRET mellom konjugert polymer polydiacetylene (PDA) og fluoroforen festet til overflaten av PDA liposomer for sensing av biomolekyler. PDA liposomer også inneholdt reseptormolekyler på sine overflater for biomolekyler som skal brukes som prober. Ligand-reseptor interaksjoner føre til endringer i den FRET effektivitet mellom fluoroforen og PDA som er grunnlaget for sensing mekanismen.
Abstract
FRET er en prosess der energi er ikke-radiatively overført fra en begeistret donor molekyl til et første stat akseptor molekyl gjennom langtrekkende dipol-dipol interaksjoner 1. I foreliggende sensing analysen benytter vi en interessant egenskap av PDA: blå-skift i UV-Vis elektronisk absorbsjonsspektrum av PDA (figur 1) etter en analytt reagerer med reseptorer knyttet til PDA 2,3,4,7. Dette skiftet i PDA absorpsjonsspektrum gir endringer i de spektral overlapping (J) mellom PDA (akseptor) og rhodamin (donor) som fører til endringer i FRET effektivitet. Dermed blir interaksjonen mellom analytt (ligand) og reseptorer detektert gjennom FRET mellom donor fluoroforer og PDA. Spesielt, viser vi sensing av en modell proteinmolekyl streptavidin. Vi også demonstrere kovalent-binding av bovint serumalbumin (BSA) til liposomet overflaten med FRET mekanisme. Disse interaksjonene mellom tHan dobbeltlag liposomer og protein molekyler kan sanses i sanntid. Den foreslåtte fremgangsmåte er en generell metode for avføling liten kjemisk og store biokjemiske molekyler. Siden fluorescens er egentlig mer sensitiv enn kolorimetri, kan deteksjonsgrensen til analysen være i sub-nanomolar området eller lavere 8. Videre kan PDA fungere som en universell akseptor i FRET, noe som betyr at flere sensorer kan utvikles med PDA (akseptor) funksjonalisert med givere og ulike reseptorer festet på overflaten av PDA liposomer.
Protocol
A. Syntese og karakterisering av PDA Liposomes 4,5,6
Note 1: Beskytt PDA løsning fra lys ved hjelp av aluminiumsfolie innpakning på hver container gjennom alle eksperimentelle skritt.
Merknad 2: To ulike sett med liposome løsning (B og C) var forberedt følgende prosedyre A (Syntese og karakterisering av PDA liposomer).
1. Syntese av N-hydroksysuksinimid Diacteylene (NHS-PCDA)
- For å forberede liposomer, er en viktig ingrediens PCDA-NHS kreves. Vi har syntetisert PCDA-NHS bruker følgende prosedyre:
- Legg 10,12-pentacosadiynoic syre (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hydroksysuksinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) og 1 - (3 - (dimetylamino) propyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (0,144 g, 0,713 mmol ) i tørr CH 2Cl 2 (20 ml).
- Omrør løsningen ved romtemperatur i 2 timer.
- Forsiktig fjerne løsningsmidlet ved hjelp rotary fordampningsanordning, hvorved en tørr tynnfilm.
- Bruk skilletrakt å ekstrahere residuet med dietyleter (25 ml) og vann (25 ml) tre ganger.
- Tørk det organiske lag med MgSO 4 (1,0 g) i en halv time. Filtrer og fjern løsningsmidlet ved roterende fordampning til å oppnå et hvitt, fast stoff pulver (0,24 g,> 90%).
- Analyser endelige forbindelse under Kjernemagnetisk resonans (NMR).
- 1H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Liposome forberedelse 5,6,7
- Oppløs PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) :: 8: 1: 1 i 20 ml diklormetan.
- Filtrer løsningen med et filterpapir for å fjerne aggregater.
- Fordamp løsningsmidlet helt å gi en tynn film av monomerer.
- Tørk den tynne filmen over natten under vacuum.
- Hydrat filmen med deionisert vann (50 ml) for å gjøre en liposom løsning av ønsket konsentrasjon (0,65 til 1 mM).
- Sonicate den resulterende suspensjon med en sonde sonikator ved 76 ° C i ~ 18 min.
- Nøye passere løsningen gjennom et papirfilter for å fjerne lipid aggregater
- Avkjøl løsningen ved 4 ° C over natten for å markedsføre selvbygging av monomerene. Den endelige oppløsningen skal være optisk klar.
- Polymerisere selvkonfeksjonerte diacetylene monomerer (liposome) ved bestråling med 254 nm UV-stråling for ~ 2 min ved hjelp av en penn Ray UV-kilde (4,5 mW / cm 2) i lufta.
- Liposomet løsningen var stabil ved romtemperatur i minst to uker. Løsningen var mer stabil når kjøling.
B. Fremstilling av Rhodamine-taggede okseserumalbumin (BSA-Rh) modifiserte PCDA liposomer
1. Binding av BSA-Rh til liposom overflaten
- Oppløse BSA-Rh i PBS buffer (ionisk konsentrasjon var 0.01M, pH 7,2) for å gjøre den endelige konsentrasjonen av 1,2 uM av BSA-Rhodamine løsning.
- Tilsett 2 ml (1,2 uM) av BSA-Rhodamine til 10 ml av liposom oppløsning fremstilt i trinn A.2. (Se ovenfor) ved romtemperatur.
- Klassisk reaksjonen for bindingen av amingrupper fra lysin rester av proteiner til karboksylsyren aktiveres av NHS gruppen har blitt fulgt (reaksjonsskjema i figur 2). NHS-PCDA designe (figur 2, trinn 1) for kovalent binding proteinmolekyler med liposomer med NHS-amin reaksjoner (Figur 2, trinn 2). NHS er et utmerket middel forlater som driver amin-karboksylsyre reaksjon i retning forover. Utbyttet av denne reaksjon under egnet tilstand skal være kvantitativ.
- Fjerning av gratis BSA-Rh: Sug en Spectra / Por Biotech Cellulose Ester (CE) membran (MW C O: 100.000) i avionisert water i 15 minutter. Denne membranen er brukt for dialyse av ureagert BSA-Rhodamine (Molekylvekt ~ 66000 Da) i deionisert vann.
- Nøye overføre løsningen inn til dialysemembran.
- Endre vann ved 2 hr, 8 t., 14 t, 24 t, og 36 timer og i løpet dialyse.
- Samle den endelige oppløsning i hetteglass dekket med aluminiumsfolie.
C. Fremstilling av SR-diamin og biotin-merket Liposomer
1. Stedet for å bruke DMPC i trinn 2.1, vil vi bruke biotin-merket-(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (biotin-DOPE).
- Følg alle trinnene gjennom 02.02 til 02.09.
- I stedet for BSA-Rh i trinn B, bruker Diamine merket Sulphorhodamine (SR-diamin).
- Følg alle ytterligere skritt i B.
- Liposomene i dette preparatet inneholdt biotin og SR-diamin på deres overflater. Etterfølgende trinn var lik A og B (se ovenfor) med ett unntak: streptavidin ble tilsatt til solutipå å undersøke biotin-streptavidin interaksjoner gjennom endringer i FRET effektivitet.
D. Representant Resultater
Tittelforbindelsen Figur. En tegneserie forklarer reaksjonen og FRET prosess skjer på liposom overflaten (fremstilt ved å følge trinn B).
A. Overvåking av protein vedlegg til liposomer med FRET en
Overvåking av FRET mellom Rhodamine og PDA liposomer utarbeidet i trinn B.
Eksitasjon og emisjons spektra av BSA-Rh og absorbsjonsspektrum av PDA er tatt (figur 3A). Vi kan tydelig se at emisjonsspektrum av BSA-Rh overlapper med absorbsjonsspektrum av PDA. Dette oppfyller resonans kravet for FRET mekanismen. BSA-Rhodamine taggede liposomer før og etter polymerisering ble analysert med UV-Ver og fluorescens spektroskopi. For den isolerte donator og akseptor, fret effektivitet er sterkt avhengig av donor-akseptor avstand (r) og J 1 (J-verdi). Quenching i utslipp er observert (Figur 3B) på grunn av FRET mellom rhodamin og PDA grunnet utseendet av elektronisk absorbsjonsspektrum av blå PDA etter fotopolymerisasjon. I vårt tilfelle, FRET effektivitet er null for upolymerisert liposomer og Rhodamine fordi J = 0 for upolymerisert liposomer i det synlige området.
Vi utført tilsvarende forsøk med bare PDA liposomer som ikke inneholdt NHS på overflaten. I disse tilfellene ble BSA-Rh ikke merket til overflaten av liposomene. I så fall, var den gjennomsnittlige avstanden mellom rhodamin og PDA (R Gjennomsnitt) mye større enn Forster radius (R 0 = 2,8 nm). Dermed gjorde vi ikke observere en stor nedgang i fluorescens intensitet. Denne observasjonen enlso antyder at fluorescensslukking er dominerende når R <2.8 nm.
J og R 0-verdiene ble beregnet ved hjelp av følgende formler: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6
Den ekstinksjonskoeffisient (ε) av blå-PDA er i størrelsesorden ~ 2000-10000 M -1 cm -1 før tilsetning av streptavidin. Den ekstinksjonskoeffisient av blå-PDA er avhengig bildet-polymerisasjon tilstand. [2] For eksempel vil ε verdiene være større etter en løsning som ble polymerisert en lengre tid. Videre kan selvbygging av diacetylene monomerer også påvirke ε verdier. J calculasjon ta hensyn til disse endringene, og de reflekterer endringer i PDA utryddelse koeffisienter grunn biotin-streptavidin molekylære interaksjoner. er J beregnet verdier ved hjelp av eksperimentell PDA absorpsjon og SR-101 utslippsdata. Endringene i J verdier er skyldes å skifte i det elektroniske absorpsjonsspektrum av PDA etter tillegg av streptavidin til løsningen (Figur 4C). Enheten for J verdier er M -1 cm -1 nm 4.
B. Overvåking av FRET med tilsetning av streptavidin til biotin-merket liposom løsning
Merknad 1: Overvåking av FRET mellom Rhodamine og PDA liposomer utarbeidet i trinn C over.
Eksitasjon og utslipp spektra av Sulphorhodamine-tagget diamin (SR-diamin) og absorbsjonsspektrum av PDA er tatt (Figur 4A). Upolymerisert og polymerisert biotin merket liposomer ble analysert ved hjelp av UV-Visog fluorescens spektroskopi. Utslipp av rhodamin (SR-101) er redusert med ca 45% etter polymerisering (figur 4B) som tyder utslipp quenching grunnet FRET. Legg 40 pl aliquoter (1 uM) av streptavidin løsning til 2 ml av liposom løsning. Med tillegg av streptavidin til oppløsningen, er endringer i J verdi observert (Figur 4C). Som biotin bindes til streptavidin, den blå toppintensitet av PDA liposom (sentrert ved ~ 645 nm i figur 1) ble redusert mens en økning i absorpsjon topp på 540 nm observeres (F igur 1S). Figur 4D viser endringer i FRET effektivitet. Fret effektivitet redusert med økningen i streptavidin konsentrasjonen er også konsistent med prediksjon vår.
Registrere SR utslipp etter hver 40 pl alikvot tillegg av streptavidin. Vi observerte en jevn økning i rhodamin utslipp etter tilsetningen av streptavidin (figur 5). Denne økningen i rhodamin utslipp skyldes en reduksjon i verdien for J sulphorhodamine emisjonsspektrum og PDA Absorpsjonsspekteret følge biotin-streptavidin interaksjoner. På molekylært nivå, biotin-streptavidin interaksjoner medføre subtile endringer i den effektive lengden konjugering av PDA som resulterer i en reduksjon i den blå-PDA form til en mer termodynamisk stabil rød-PDA skjema 2. Dette er grunnlaget for endringer i J verdier. Interessant, kan små forskjeller i de molekylære interaksjoner for kovalent eller ikke-kovalent bundet biotin til PDA liposome bli analysert ved hjelp av vår sensing analysen 4.
Vi har også utført kontrollforsøk og har overvåket utslipp av de kontrollprøver under de samme eksperimentelle betingelser som de for streptavidin-biotin systemet. Kontrollen eksperimenter består av: (1) Liposom løsninger som inneholdt biotin på deresoverflaten ble tilsatt buffer oppløsning av samme volum og konsentrasjon, og (2) Liposom løsning uten biotin-reseptorer på overflaten deres ble tilsatt streptavidin av samme volum og konsentrasjon. Intensiteten av biotin-merket liposom løsning etter tilsetning av streptavidin viste forbedret intensitet men intensiteten av liposom løsning av kontrollforsøk (for eksempel, se figur 2S), på den annen side, viste en redusert i utslippsintensiteten. Dette tilskrives fortynning av oppløsningen. Disse eksperimentene klart indikert at forbedret utslipp av løsningen var skyldes spesifikke molekylære interaksjoner.
Forster radius (R 0) hvor rodamin og PDA paret blir beregnet (eq.2) å være ~ 2,80 nm. Dette betyr at for isolerte PDA-Rhodamine par, vil 50% av de eksiterte tilstand Rhodamine molekyler har sin energi overført til PDA når r er 2,80 nm.
Vi obs erved at når biotin er kovalent bundet til PDA ryggrad, utslipp økningen var 2-3 ganger større enn det av ikke-kovalent bundet biotin til liposomer. 4 Disse resultatene sterkt at vårt foreslåtte systemet er følsomt for skille små forskjeller i interaksjoner ved transduseren (linkeren mellom biotin og liposom bilayer) grunnet kovalent og ikke-kovalent bundet reseptorer knyttet til liposomer. Avhengig av skanning og datafangst mulighetene i spektrofotometer, sanntids overvåking (i millisekund til andre gang skala) av protein interaksjoner (i UV-Vis spektroskopi) er mulig med denne sensing system.
Figur 1. Absorpsjonspektere av blått og rødt PDA løsninger. (Innfelt) optiske mikrografer tatt med et digitalt kamera.
g "/>
Figur 2. Reaksjonsskjema for PCDA-NHS syntese (trinn 1). Omsetning av PCDA-NHS til aminet substituent av proteiner (trinn 2). Trinn 2 er grunnlaget for binding av lysin rester av proteiner til karboksylsyre med PCDA monomer. Klikk her for å vise større figur .
Figur 3A. Endring i observerte FRET effektivitet skyldes endringene i absorpsjon spekteret av PDA. Før polymeriseringen er det ingen overlapping mellom BSA-Rh utslipp og PDA absorpsjon men etter polymerisasjonen PDA absorpsjon overlapper med BSA-Rh utslipp som er kravet for FRET. Rhodamin er en donor (rød) og polymeriserte PDA liposomer fungere som en akseptor (blå).
Figur3B. Fluorescensspektra av BSA-Rh tagget liposomer før (blå) og etter PCDA polymerisasjon (rød). En stor nedgang i rhodamine utslipp ble observert på grunn av FRET mellom rhodamine og PDA.
.. Figur 4A spektral overlapping (J) byttes for PDA (blått eller rødt) absorpsjonsspektrum og Sulphorhodamine emisjonsspektrum (oransje) Figur 4A er representant spektrum for ekstrem tilstand, det vil si, når et overskudd av streptavidin ble tilsatt til oppløsningen. Figur 4A viser en nesten fullstendig blå-til-rød PDA transformasjon etter tilsetning av et overskudd av streptavidin. Det er tydelig sett at J (spektral overlapping) øker med blå-forskyvning av PDA absorpsjonsspektrum
Figur 4B. Fluorescensspektra før (blå) og etter (red) liposome polymerisasjon.
Figur 4c Tilstand for FRET:. J endring mellom donor (sulphorhodamine) og akseptor (PDA) med streptavidin tillegg til liposomet løsningen.
Figur 4D. FRET effektivitet endring mellom donor (sulphorhodamine) og akseptor (PDA) med streptavidin tillegg til liposom løsning.
Figur 5. Rhodamine emisjonsspektrum etter tilsetningen av streptavidin alikvoter til PDA liposom løsning. Innfelt viser en større visning av utslipp endringer i SR-101 spektra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utført selektiv binding av lysin rester av protein på liposome overflaten med NHS-amin reaksjon. Dette FRET basert metode er i stand til å gjøre Sanntidsovervåkning av biotin-streptavidin binding og protein (BSA) binding til liposomet overflaten. Lignende fremgangsmåte kan brukes til å studere bindingen dynamikken ulike protein interaksjoner med deres selektive reseptorer. Det er fleksibilitet i å velge fluoroforer som vil gi endringer i J verdiene avhengig de spektrale egenskapene til fluoroforer. PDA er en universell akseptor. Således hever bruken av PDA (akseptor) sammen med flere fluoroforer og reseptorer muligheten av å gi oss flere sensorer. Sensitiviteten av våre sensorer er sub-nanomolar og med optimalisering, kan det bli ytterligere forbedret. Spesifisiteten av sensorene er stilt ved bruk av molekylære interaksjoner mellom reseptorer og ligander. Disse sensorene kan også brukes for større partikler such som virus og bakterier.
Vi var også i stand til å samle verdifull informasjon som avstand mellom donor-akseptor, FRET effektivitet og J-verdi osv. Avstanden mellom giver og akseptor er beregnet til 2,8 nm. Dette var i samsvar med prediksjon vår. Ettersom det er et stort behov for overvåking av lumske virus, bakterier og andre skadelige mikroorganismer, ønsker vi å produsere en håndholdt enhet som kan utføre sanntid sensing av farlige biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt gjennom National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) og Orda på SIUC. Vi takker NSF om stipend (CHE-0959568) for kjøp av en FE-SEM. Vi vil gjerne takke professor Matthew McCarroll for personer diskusjoner. Julia Reyes vil gjerne takke COLCIENCIAS, colombianske Agency og Universidad Pedagogica y tecnologica de Colombia for henne stipend og økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
