Summary
Demonstramos FRET entre polydiacetylene polímero conjugado (PDA) e fluoróforo ligado à superfície dos lipossomas de PDA para a detecção de biomoléculas. PDA lipossomas também continha moléculas receptoras nas suas superfícies de biomoléculas a ser utilizados como sondas. Interacções ligando-receptor conduzir a alterações na eficiência de TERF entre o fluoróforo e o PDA, que é a base de mecanismo de detecção.
Abstract
FRET é um processo pelo qual a energia é não-radiativamente transferido de uma molécula dadora para uma molécula animado aceitador estado fundamental por meio de longo alcance interacções dipolo-dipolo 1. No presente ensaio de detecção, utiliza-se uma propriedade interessante de PDA: deslocamento de azul no espectro de absorção de UV-Vis de PDA electrónica (Figura 1) depois de um analito interage com os receptores ligados a PDA 2,3,4,7. Esta mudança no espectro de absorção no PDA proporciona mudanças nas sobreposição espectral (J) entre os PDA (aceitador) e rodamina (dador) que levam a alterações na eficiência de TERF. Assim, as interacções entre a substância a analisar (ligante) e os receptores são detectados através de FRET entre fluoróforos doadores e PDA. Em particular, mostramos a detecção de uma molécula de estreptavidina modelo de proteína. Nós também demonstram a ligação covalente-albumina de soro bovino (BSA) a superfície do lipossoma com FRET mecanismo. Essas interações entre tele lipossomas de bicamada e moléculas de proteína pode ser detectado em tempo real. O método proposto é um método geral para detecção química pequenas e grandes moléculas bioquímicas. Uma vez que a fluorescência é intrinsecamente mais sensível do que a colorimetria, o limite de detecção do ensaio pode ser na gama sub-nanomolar ou inferior 8. Além disso, o PDA pode actuar como um aceitador FRET universal, o que significa que vários sensores podem ser desenvolvidos com PDA (aceitador) funcionalizado com doadores e receptores diferentes ligados à superfície dos lipossomas de PDA.
Protocol
A. Síntese e Caracterização de Lipossomas de PDA 4,5,6
Nota 1: Proteger a solução da luz PDA usando embalagem de alumínio em cada recipiente ao longo de todas as etapas experimentais.
Nota 2: Dois conjuntos diferentes de solução de lipossoma (B e C) foram preparadas seguinte procedimento A (Síntese e caracterização de lipossomas de PDA).
1. Síntese de N-hidroxi-succinimida Diacteylene (NHS-PCDA)
- Para preparar os lipossomas, um ingrediente essencial PCDA-NHS é necessária. Temos sintetizado PCDA-NHS usando seguinte procedimento:
- Adicionar ácido 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hidroxissuccinimida (0,0914 g, 0,786 mmol) e 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (0,144 g, 0,713 mmol ) em CH 2 Cl 2 seco (20 ml).
- Agita-se a solução à temperatura ambiente durante 2 hr.
- Cuidadosamente remover o solvente usando rotary evaporador para se obter uma película fina seca.
- Use funil de separação para extrair o resíduo com éter dietílico (25 ml) e água (25 ml) três vezes.
- Seca-se a camada orgânica com MgSO4 (1,0 g) durante meia hora. Filtrar e remover o solvente por evaporação rotativa para se obter um pó branco sólido (0,24 g,> 90%).
- Analise composto final sob Ressonância Magnética Nuclear (NMR).
- 1 H RMN (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Preparação do lipossoma 5,6,7
- Dissolver PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 em 20 ml de diclorometano.
- Filtra-se a solução com papel de filtro para remover agregados.
- Evapora-se o solvente completamente para se obter uma película fina de monómeros.
- Seca-se a película fina a noite sob vacuum.
- Filme o hidrato com água desionizada (50 ml) para fazer uma solução de lipossomas de concentração desejada (0,65-1 mM).
- Sonicar a suspensão resultante com um sonicador de sonda a 76 ° C durante ~ 18 min.
- Cuidadosamente passar a solução através de um filtro de papel para remover os agregados lipídicos
- Arrefece-se a solução a 4 ° C durante a noite para promover a auto-montagem dos monómeros. A solução final deve ser opticamente transparente.
- Polimerizar os monómeros de auto-montagem diacetileno (lipossomas) por irradiação com 254 nm de radiação UV para ~ 2 min utilizando uma fonte de UV Pen Ray (4,5 mW / cm 2) em ar.
- A solução de lipossoma era estável à temperatura ambiente durante pelo menos duas semanas. A solução foi mais estável quando refrigerado.
B. Preparação de Rodamina-tagged albumina sérica bovina (BSA-Rh) lipossomas modificados PCDA
1. A ligação de BSA-Rh para a superfície do lipossoma
- Dissolve-Rh BSA em PBS buffer (concentração iónica foi de 0,01 M, pH 7,2) para fazer uma concentração final de 1,2 uM de BSA Rodamina-solução.
- Adicionar 2 ml (1,2 ^ M) de BSA-Rodamina a 10 ml de solução de lipossoma preparado no passo A.2. (Ver acima), à temperatura ambiente.
- Reacção clássica para a ligação dos grupos amina do resíduo de lisina de proteínas ao ácido carboxílico activado por NHS grupo foi seguido (Esquema de reacção na Figura 2). NHS-PCDA foi concebido (Figura 2, passo 1) para a ligação covalente de moléculas de proteína com lipossomas utilizando NHS-amina reacções (Figura 2, Passo 2). NHS é um excelente agente de deixar que conduz a reacção de amina do ácido carboxílico na direcção para a frente. O rendimento desta reacção sob condições apropriadas deve ser quantitativa.
- Remoção de livre BSA-Rh: Molhe um Spectra / Por Biotech éster de celulose membrana (CE) (MW C O: 100.000) em w deionizadaater, durante 15 min. Esta membrana é utilizada para a diálise de BSA-Rodamina que não reagiu (peso molecular ~ 66000 Da), em água desionizada.
- Transferir cuidadosamente a solução em que a membrana de diálise.
- Troque a água em 2 horas, 8 horas, 14 horas, 24 horas e 36 horas durante a diálise.
- Recolher a solução final num frasco coberto com folha de alumínio.
C. Preparação de SR-diamina e marcado com biotina Lipossomas
1. Em vez de usar DMPC na etapa 2.1, iremos utilizar marcado com biotina-(1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (DOPE-biotina).
- Siga todos os passos através de 2,2-2,9.
- Em vez de BSA-Rh na etapa B, utilize diamina Sulphorhodamine etiquetado (SR-diamina).
- Siga todos os passos adicionais na B.
- Os lipossomas nesta preparação contida biotina e SR-diamina nas suas superfícies. Os passos subsequentes são semelhantes a A e B (ver acima), com uma única excepção: foi adicionada estreptavidina à solutipara investigar interacções biotina-estreptavidina através de alterações na eficácia da FRET.
D. Representante Resultados
Figura título. Um desenho que explica o processo de reacção e de FRET ocorre na superfície do lipossoma (preparado seguindo o passo B).
A. Monitorização da ligação da proteína de lipossomas utilizando uma FRET
Monitorização da FRET entre Rodamina e lipossomas preparados de PDA no passo B.
Os espectros de excitação e emissão de BSA-Rh e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 3A). Nós podemos ver claramente que o espectro de emissão do BSA-Rh coincide com o espectro de absorção de PDA. Isso satisfaz o requisito de ressonância para o mecanismo de FRET. BSA-Rodamina lipossomas marcados, antes e após a polimerização foram analisados com UV-Vé e espectroscopia de fluorescência. Para o doador e aceitador isolada, a eficiência de TERF é altamente dependente da distância dador-aceitador (r) e J 1 (j-valor). A extinção da emissão é observada (Figura 3B) por causa da FRET entre rodamina e PDA, devido ao aparecimento de espectro de absorção electrónica de PDA azul após a fotopolimerização. No nosso caso, FRET eficiência é zero para os lipossomas não polimerizados e rodamina porque J = 0 para lipossomas não polimerizada na região visível.
Foram realizadas experiências semelhantes com apenas lipossomas PDA que não continham NHS na sua superfície. Nestes casos, a BSA-Rh não foi marcado na superfície dos lipossomas. Nesse caso, a distância média entre a rodamina e PDA (r médio) era muito maior do que o raio de Forster (R 0 = 2,8 nm). Assim, não observamos uma grande diminuição na intensidade de fluorescência. Esta observação de umalso sugere que a extinção de fluorescência é dominante quando R <2,8 nm.
J e R 0 Os valores foram calculados usando as fórmulas seguintes: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6
O coeficiente de extinção (ε) de azul-PDA está no intervalo de 2000-10000 ~ M -1 cm -1 antes da adição de estreptavidina. O coeficiente de extinção de azul-PDA está dependente da condição foto-polimerização. [2] Por exemplo, os valores de £ será maior para uma solução que foi polimerizado um tempo mais longo. Além disso, a auto-montagem dos monômeros diacetileno também pode afetar os valores de £. O calcul Jções levar em conta essas alterações, e refletem mudanças nos coeficientes de extinção PDA devido a biotina-estreptavidina interações moleculares. valores de J são calculados usando absorção PDA experimental e SR-101 dados de emissão. As mudanças nos valores de J são devidas à mudança no espectro de absorção electrónica de PDA a seguir à adição de estreptavidina para a solução (Figura 4C). A unidade de valores de J é M -1 cm -1 nm 4.
B. Controlo da FRET com adição de estreptavidina para a biotina marcada com solução de lipossomas
Nota 1: Monitoramento das FRET entre Rodamina e lipossomas PDA preparados no passo C acima.
Os espectros de excitação e emissão de Sulphorhodamine-tagged diamina (SR-diamina) e espectro de absorção do PDA sejam tomadas (Figura 4A). Não polimerizados e polimerizados biotina lipossomas marcados foram analisados por meio de UV-Vise espectroscopia de fluorescência. A emissão da rodamina (SR-101) é diminuída em cerca de 45% após a polimerização (Figura 4B), sugerindo quenching emissão devido a FRET. Adicionar 40 ul de aliquotas (1 uM) de solução de estreptavidina a 2 ml de solução de lipossoma. Com a adição de estreptavidina para a solução, as variações no valor J é observado (Figura 4C). Como a biotina liga-se a estreptavidina, a intensidade do pico de azul PDA lipossoma (centrado em ~ 645 nm na Figura 1) foi diminuído, enquanto que um aumento do pico de absorção a 540 nm é observada (F igura 1 S). Figura 4D mostra a evolução do FRET eficiência. A eficiência de TERF diminuiu com o aumento da concentração de estreptavidina é também consistente com a nossa previsão.
Gravar a emissão SR após cada adição aliquota de 40 ul de estreptavidina. Observou-se um aumento constante na emissão de rodamina, após a adição de streptavidina (Figura 5). Este aumento na emissão de rodamina é devido a uma diminuição do valor J para o espectro de emissão sulfo e espectro de absorvância PDA seguindo as interacções biotina-estreptavidina. Ao nível molecular, as interacções biotina-estreptavidina levar a alterações subtis no comprimento de conjugação eficaz do PDA, que resulta num decréscimo na forma azul-PDA a um termodinamicamente mais estável forma vermelho-PDA 2. Esta é a base das alterações nos valores de J. Interessantemente, as diferenças subtis nas interacções moleculares para covalentemente ou não covalentemente a biotina ligada a lipossomas PDA pode ser sondado com o nosso ensaio de detecção 4.
Temos também realizados experimentos de controle e foram monitorizadas a emissão das amostras de controlo sob as mesmas condições experimentais como os de estreptavidina-biotina. As experiências de controlo consistir em: (1) a biotina soluções de lipossomas que continham no seusuperfície foram adicionados uma solução tampão de mesmo volume e concentração, e (2) solução de lipossomas, sem receptores de biotina na sua superfície de estreptavidina foram adicionados mesmo volume e concentração. A intensidade da solução de lipossoma marcado com biotina, após a adição de estreptavidina mostrou intensidade melhorado, mas a intensidade da solução de lipossoma das experiências de controlo (por exemplo, ver Figura 2 S), por outro lado, mostraram uma diminuição na intensidade de emissão. Isto é atribuído à diluição da solução. Essas experiências indicaram claramente que a emissão melhorada da solução foi devido a interacções específicas moleculares.
Forster raio (R 0) para o par rodamina e PDA é calculada (Eq.2) ser ~ 2,80 nm. Isto significa que para isolados PDA-rodamina pares, 50% das moléculas de rodamina estado excitado terá a energia transferida para PDA quando r é 2,80 nm.
Nós obs erved que, quando a biotina é ligado covalentemente ao esqueleto de PDA, o aumento das emissões foi 2-3 vezes maior do que a de uma forma não covalente a biotina ligada a lipossomas. 4 Estes resultados sugerem fortemente que o sistema proposto é sensível para distinguir diferenças subtis nas interacções no transdutor (ligante entre biotina e bicamada de lipossomas), devido à covalentemente ou não covalentemente ligados receptores ligados a lipossomas. Dependendo das capacidades de digitalização e de aquisição de dados a monitorização de espectrofotómetro e em tempo real (em milisegundos a escala de tempo de segundo) de interacções de proteínas (na espectroscopia de UV-Vis), são possíveis com este sistema de detecção.
Figura Espectros de absorção 1. Dos azuis e vermelhos soluções PDA. (Inset) micrografias ópticas tirada com uma câmera digital.
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Figura 2. O esquema reaccional para a síntese PCDA-NHS (passo 1). Reacção do PCDA-NHS para o substituinte de amina de proteínas (passo 2). O passo 2 é a base da ligação do resíduo de lisina de proteínas para o ácido carboxílico da PCDA monómero. para ver figura maior .
Figura 3A. Observada alteração na eficiência de TERF é devido às mudanças no espectro de absorção do PDA. Antes de polimerização, não há sobreposição entre BSA-Rh emissão e absorção de PDA, mas depois de sobreposições de polimerização PDA absorção com BSA-Rh emissão, que é a exigência de FRET. Rodamina é um doador (vermelho) e lipossomas polimerizados PDA actuar como um aceitador (azul).
Figura3B. Espectros de fluorescência do BSA-Rh lipossomas marcados antes (azul) e depois PCDA polimerização (vermelho). Uma grande redução na emissão de rodamina foi observada devido a FRET entre rodamina e PDA.
Figura 4A.. Sobreposições espectrais (J) para a mudança de PDA espectro de absorção (azul ou vermelha) e espectro de emissão Sulphorhodamine (laranja) Figura 4A é o espectro representativo para a condição extrema, isto é, quando um excesso de estreptavidina foi adicionado à solução. A Figura 4A mostra uma transformação quase completa azul-a-vermelho PDA, após a adição de um excesso de estreptavidina. Vê-se claramente que J (sobreposição espectral) aumenta com o deslocamento de azul do espectro de absorção no PDA
Figura 4B. Espectros de fluorescência antes (azul) e após (red) polimerização de lipossomas.
Figura 4C Condição para FRET: J. Mudança entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas.
Figura 4D. FRET variação da eficiência de entre o doador (sulfo) e receptor (PDA) com a adição de estreptavidina para a solução de lipossomas.
Figura 5. Rodamina espectro de emissão após a adição de alíquotas da solução de estreptavidina a PDA lipossoma. Inserção mostra uma visão ampliada de mudanças de emissão no espectro SR-101.
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Discussion
Realizamos a ligação selectiva do resíduo de lisina da proteína na superfície dos lipossomas utilizando NHS-amina reacção. Este método baseado em FRET é capaz de fazer o acompanhamento em tempo real de ligação biotina-estreptavidina e proteína (BSA), a ligação à superfície do lipossoma. Procedimento semelhante pode ser aplicado para estudar a dinâmica das interacções de ligação proteína diferentes com os seus receptores selectivos. Há flexibilidade na escolha de fluoróforos que irá proporcionar mudanças nos valores de J, dependendo das características espectrais dos fluoróforos. PDA é um aceitador universal. Assim, o uso de PDA (aceitador), juntamente com fluoróforos múltiplos e receptores levanta a possibilidade de proporcionar nos vários sensores. A sensibilidade dos nossos sensores é sub-nanomolar e com otimização, que pode ser ainda mais reforçada. A especificidade dos sensores é ajustado através do uso de interacções moleculares entre receptores e ligandos. Estes sensores também podem ser usados para as partículas maiores sUCH como vírus e bactérias.
Pudemos também para recolher informação valiosa como a distância entre o dador-aceitador, FRET eficiência e J-valor, etc A distância entre o dador eo aceitador é calculada para ser 2,8 nm. Isto foi consistente com a nossa previsão. Uma vez que existe uma grande necessidade de monitorização de vírus insidiosos, bactérias e outros microorganismos nocivos, desejamos a fabricar um dispositivo de mão que pode realizar em tempo real de detecção de biomoléculas perigosas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através da National Science Foundation, Instituto Nacional de Saúde (NIH), Tecnologia de Materiais Center (MTC) e ORDA em SIUC. Agradecemos a NSF para uma subvenção (CHE-0959568) para a compra de um FE-SEM. Gostaríamos de agradecer ao Prof Mateus McCarroll para discussões úteis. Julia Reyes vai agradecer a COLCIENCIAS, Agência colombiano e Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colômbia por sua bolsa de estudos e apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
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