Summary
Мы демонстрируем FRET между сопряженными полидиацетилена полимера (PDA) и флуорофор прикреплены к поверхности липосом для PDA зондирования биомолекул. PDA липосомы также содержатся молекулы-рецепторы на своей поверхности для биомолекул, которые будут использоваться в качестве зондов. Лиганд-рецепторного взаимодействия приводят к изменениям в эффективности FRET между флуорофором и КПК, который является основой чувствительный механизм.
Abstract
FRET является процесс, при котором энергия не является радиационно передается от возбужденной молекулы донора основного состояния молекулы акцептора через дальний диполь-дипольных взаимодействий 1. В настоящее зондирования анализа, мы используем одно интересное свойство PDA: синий сдвиг в UV-Vis электронном спектре поглощения КПК (рис. 1) после аналита взаимодействует с рецепторами прикреплены к PDA 2,3,4,7. Этот сдвиг в спектре поглощения PDA обеспечивает изменения спектрального перекрытия (J) между КПК (акцептор) и родамина (донора), что приводит к изменениям в FRET эффективности. Таким образом, взаимодействие между аналита (лигандов) и рецепторы обнаружены с помощью FRET между донором флуорофоров и КПК. В частности, мы показываем зондирования молекулы белка стрептавидина модели. Мы также демонстрируют ковалентной привязки бычьего сывороточного альбумина (БСА) в липосомы поверхность с FRET механизм. Эти взаимодействия между тОн бислой липосом и молекул белка может быть воспринято в режиме реального времени. Предлагаемый метод является общим методом для измерения небольших химических и биохимических больших молекул. С флуоресценции является принципиально более чувствительны, чем колориметрии, предел обнаружения анализ может быть в суб-наномолярных диапазоне или ниже 8. Кроме того, КПК может выступать в качестве универсального акцептора в FRET, что означает, что несколько датчиков могут быть разработаны с КПК (акцептор) функционализированные с донорами и различные рецепторы прикреплены к поверхности липосом PDA.
Protocol
А. Синтез и характеристика PDA Липосомы 4,5,6
Примечание 1: Защита PDA решение от света, используя упаковку из алюминиевой фольги на каждом контейнере на протяжении всего экспериментального этапа.
Примечание 2: два различных набора раствор липосом (B и C), были подготовлены следующие процедуры (синтез и характеристику PDA липосомы).
1. Синтез N-гидроксисукцинимида Diacteylene (NHS-ВКПДР)
- Для подготовки липосомы, важным элементом ВКПДР-NHS не требуется. Мы синтезировали ВКПДР-NHS, используя следующие процедуры:
- Добавить 10,12-pentacosadiynoic кислоты (ВКПДР) (0,267 г, 0,713 ммоль), N-гидроксисукцинимид (0,0914 г, 0,786 ммоль) и 1 - (3 - (диметиламино) пропил)-3-этилкарбодиимида (0,144 г, 0,713 ммоль ) в сухом CH 2 Cl 2 (20 мл).
- Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Осторожно снимите растворителем с помощью гotary испарителе с получением сухой тонкой пленки.
- Используйте делительную воронку, чтобы извлечь остатки диэтиловый эфир (25 мл) и воды (25 мл) три раза.
- Органический слой сушат с MgSO 4 (1,0 г) в течение получаса. Фильтр и удаления растворителя на роторном испарителе для получения белого твердого порошка (0,24 г,> 90%).
- Анализ конечного соединения при ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
- 1 H ЯМР (300 МГц, ДМСО), δ (м.д.): 0,893 (т, 3Н), 1,268 (м, 26H), 1,512 (м, 4H), 1,754 (м, 2H), 2,252 (т, 4Н), 2,365 (м, 1H), 2,610 (м, 1H), 2,842 (с, 2H).
2. Липосомы подготовки 5,6,7
- Растворите ВКПДР: ВКПДР-NHS: 1,2-димиристоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) :: 8: 1: 1 в 20 мл дихлорметана.
- Фильтр решение с фильтровальной бумагой, чтобы удалить агрегатов.
- Испарения растворителя полностью до получения тонкой пленки мономеров.
- Высушите тонкой пленкой в течение ночи в вакуумвакуумного.
- Гидратов фильм с деионизированной воды (50 мл), чтобы сделать раствор липосом из требуемой концентрации (0.65-1 мМ).
- Разрушать ультразвуком полученной суспензии с помощью зонда ультразвуком при 76 ° С в течение ~ 18 мин.
- Осторожно пройти раствора через бумажный фильтр для удаления липидных агрегатов
- Охладите раствор при 4 ° С в течение ночи содействовать самосборки мономеров. Окончательное решение должно быть оптически прозрачным.
- Полимеризоваться самоорганизующихся диацетилена мономеров (липосомы) путем облучения 254 нм УФ-излучения в течение ~ 2 мин с использованием УФ-Pen Ray источника (4,5 мВт / см 2) в воздухе.
- Раствор липосом была стабильна при комнатной температуре в течение по крайней мере двух недель. Решение было более стабильным, когда в холодильнике.
В. Подготовка родамина с метками бычий сывороточный альбумин (BSA-Rh), модифицированных липосом ВКПДР
1. Связывание BSA-Rh на поверхности липосомы
- Растворите BSA-Rh в PBS буffer (ионная концентрация 0,01 М, рН 7,2), чтобы конечная концентрация 1,2 мкМ БСА-родамина решение.
- Добавить 2 мл (1,2 мкМ) BSA-родамина к 10 мл раствор липосом, полученного на стадии А.2. (См. выше) при комнатной температуре.
- Классическая реакция связывания аминогрупп от остатка лизина белка в карбоновой кислоты активируются NHS группы последовало (реакция схемы на рисунке 2). NHS-ВКПДР был разработан (рис. 2, шаг 1) для ковалентного связывания молекул белка с использованием липосом NHS-амин реакций (рис. 2, стадия 2). NHS является отличным оставив агента, который управляет амин-карбоновой кислоты реакция в прямом направлении. Выход из этой реакции при соответствующих условиях должно быть количественной.
- Удаление свободного BSA-Rh: Замочить Spectra / Por Biotech эфиров целлюлозы (CE) мембраны (MW C O: 100.000) в деионизированной WВодный течение 15 мин. Эта мембрана используется для диализа непрореагировавшего BSA-родамина (молекулярная масса ~ 66000 Da) в деионизированной воде.
- Осторожно передать решение в к диализной мембраны.
- Меняйте воду на 2 часа, 8 часов, 14 часов, 24 часов и 36 часа во время диализа.
- Сбор окончательное решение во флаконе покрыты алюминиевой фольгой.
С. Подготовка SR-диаминов и биотин-меченый Липосомы
1. Вместо DMPC в шаге 2.1, мы будем использовать биотин-меченых (1,2-диолеоил-Sn-глицеро-3-phosphoethanolamine-N-(биотинил) (биотин-DOPE).
- Выполняйте все шаги через 2,2 до 2,9.
- Вместо того, BSA-Rh в шаге B, использовать Diamine отмеченных Sulphorhodamine (SR-диамин).
- Соблюдайте все дальнейшие шаги в B.
- Липосомы в этом препарате, содержащейся биотин и SR-диаминов на их поверхности. Последующие шаги были похожи на А и В (см. выше), но с одним исключением: стрептавидин был добавлен в solutiк исследованию биотин-стрептавидин взаимодействия путем внесения изменений в FRET эффективности.
D. Представитель Результаты
Название рис. Мультфильм объяснения реакции и FRET процессов, происходящих на поверхности липосомы (подготовлен следующий шаг B).
А. Мониторинг белка привязанность к липосомы использованием FRET 1
Мониторинг FRET между родамина и КПК липосом, полученных в шаге B.
Возбуждение и спектров излучения BSA-Rh и спектр поглощения PDA принимаются (рис. 3А). Мы можем ясно видеть, что спектр излучения BSA-Rh перекрывается со спектром поглощения КПК. Это удовлетворяет резонанс требования к FRET механизм. BSA-родамина отмеченных липосом до и после полимеризации были проанализированы с УФ-Vесть и флуоресцентной спектроскопии. Для изолированного донора и акцептора, FRET эффективность сильно зависит от донорно-акцепторных расстояние (г) и J 1 (J-значение). Закалки в излучение наблюдается (рис. 3В) из-за FRET между родамина и КПК в связи с появлением электронного спектра поглощения синих PDA после фотополимеризации. В нашем случае, FRET эффективность равна нулю для неполимеризованных липосом и родамина потому, что J = 0 для Неполимеризованные липосом в видимой области.
Мы проводили подобные эксперименты только с КПК липосомы, которые не содержат NHS на их поверхности. В этих случаях, BSA-Rh не был привязан к поверхности липосом. В этом случае среднее расстояние между родамина и КПК (г средняя) было гораздо больше, чем Форстер радиуса (R 0 = 2,8 нм). Таким образом, мы не наблюдали значительное уменьшение интенсивности флуоресценции. Это наблюдениеРБП предполагает, что тушение флуоресценции является доминирующим при г <2,8 нм.
J и R 0 значения были рассчитаны с использованием следующей формулы: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0,211 [K 2 N -4 Q D J (λ)] 1/6
Коэффициент экстинкции (ε) сине-КПК в диапазоне 2000-10000 ~ М -1 см -1 до того стрептавидина. Коэффициент экстинкции сине-PDA зависит от фото-полимеризации состоянии. [2] Например, ε значение будет больше на решение, которое было полимеризоваться длительного времени. Кроме того, самосборка диацетилена мономеров может также повлиять на ε значения. J Calculобъема учитывать эти изменения, и они отражают изменения в PDA коэффициенты вымирания в связи с биотин-стрептавидин молекулярных взаимодействий. J значения рассчитываются с использованием экспериментальных поглощения КПК и SR-101 данные о выбросах. Изменениях в J значения за счет сдвига в электронном спектре поглощения КПК после того стрептавидина к решению (рис. 4в). Единица J значений М -1 см -1 нм 4.
B. Контроль FRET с добавлением стрептавидина с биотин-меченый раствор липосом
Примечание 1: Мониторинг FRET между родамина и КПК липосом, полученных в шаге C выше.
Возбуждение и спектров излучения Sulphorhodamine с метками диамина (SR-диамин) и спектр поглощения PDA принимаются (рис. 4а). Неполимеризованные и полимеризованный биотин отмеченных липосомы были проанализированы с помощью UV-Visи флуоресцентной спектроскопии. Выбросов родамина (SR-101) уменьшается примерно на 45% после полимеризации (рис. 4В), что свидетельствует выбросов тушение из-за беспокоиться. Добавить 40 мкл аликвоты (1 мкМ) стрептавидина решение 2 мл раствор липосом. С добавлением стрептавидина к решению, изменения в стоимости J наблюдается (рис. 4в). Как биотин связывается с стрептавидин, синий пик интенсивности КПК липосомы (с центром в ~ 645 нм на рисунке 1) была снижена в то время как увеличение пика поглощения при 540 нм наблюдается (F igure 1S). Рис 4D показывает изменения в FRET эффективность. FRET эффективность уменьшается с увеличением концентрации стрептавидин также согласуется с нашим предсказанием.
Запись выбросов SR после каждых 40 мкл аликвоты того стрептавидином. Мы наблюдали устойчивый рост родамина выбросов после добавления streptавидином (рис. 5). Это увеличение родамина выбросов связано с уменьшением J значение для спектра излучения sulphorhodamine и КПК спектре поглощения после биотин-стрептавидин взаимодействия. На молекулярном уровне, биотин-стрептавидин взаимодействия приводят к тонким изменениям в эффективную длину сопряжения PDA, что приводит к снижению сине-PDA формой к более термодинамически стабильным красно-PDA форме 2. Это является основой изменений в J значения. Интересно, что тонкие различия в молекулярных взаимодействий в ковалентно или нековалентно связанного биотина для КПК липосомы могут быть исследованы с помощью нашего зондирования анализа 4.
Мы провели также контрольные опыты и мониторинг выбросов контрольных образцов в тех же экспериментальных условиях, как и для стрептавидин-биотин системы. Контрольные эксперименты состоят из: (1) липосомами решения, содержащиеся биотина на ихповерхности были добавлены буферный раствор того же объема и концентрации, а также (2) липосомами решение без биотином рецепторами на их поверхности были добавлены стрептавидин того же объема и концентрации. Интенсивность биотин-меченый раствор липосом после того стрептавидина показал повышенной интенсивности, но интенсивность липосомы Решение контрольных экспериментах (например, см. рис 2S), с другой стороны, выставлены снизилась в интенсивности излучения. Это связано с разбавлением раствора. Эти эксперименты ясно показали, что расширенные выбросов решение было связано с конкретными молекулярных взаимодействий.
Форстер радиуса (R 0) для родамина и КПК пара рассчитывается (eq.2) составляет ~ 2,80 нм. Это означает, что для изолированных PDA-родамина пар, 50% от возбужденных молекул родамина государство будет иметь свою энергию, передаваемую на КПК, когда г 2,80 нм.
Мы набл erved, что, когда биотин ковалентно присоединен к КПК позвоночника, увеличение объема выбросов в 2-3 раза больше, чем у не-ковалентно связанных биотина в липосомы. 4 Эти результаты убедительно показывают, что предлагаемый нами система чувствительна к различить тонкие различия во взаимодействиях на преобразователь (линкер между биотином и липосомы бислой), в связи с ковалентно и не ковалентно связанные рецепторы прикреплены к липосомы. В зависимости от сканирования и сбора данных возможностей спектрофотометра, мониторинг в реальном времени (в миллисекундах на второй шкале времени) белковых взаимодействий (в UV-Vis спектроскопии) возможно с этой сенсорной системы.
Рисунок 1. Спектры поглощения синего и красного PDA решений. (Вставка) оптического микроскопа, сделанных цифровой камерой.
г "/>
Рисунок 2. Реакция схемы ВКПДР-NHS синтеза (шаг 1). Реакция ВКПДР-NHS до амина заместитель белков (шаг 2). Шаг 2 лежит в основе связывания остатка лизина белка в карбоновой кислоты ВКПДР мономера. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3А. Изменение в наблюдаемый FRET эффективности связано с изменениями в спектре поглощения КПК. Перед полимеризацией нет перекрытия между BSA-Rh выбросов и КПК поглощения, но после полимеризации PDA перекрывает поглощения с BSA-Rh выбросов, который является требованием для FRET. Родамина является донором (красный) и полимеризованный PDA липосом действовать как акцептор (синий).
Рисунок3В. Спектры флуоресценции BSA-Rh отмеченных липосом до (синий) и после ВКПДР полимеризации (красный). Значительное уменьшение выбросов родамина наблюдается в связи с FRET между родамина и КПК.
.. Рис. 4а спектрального перекрытия (J) изменения для КПК (синий или красный) спектра поглощения и Sulphorhodamine спектра излучения (оранжевый) Рисунок 4а является представителем спектре для экстремальных условий, то есть, когда избыток стрептавидин был добавлен в раствор. На рисунке 4а показаны почти полное сине-красные PDA преобразования после добавления избытка стрептавидином. Хорошо видно, что J (спектральный перекрытия) увеличивается с сине-сдвиг спектра поглощения PDA
Рисунок 4B. Спектры флуоресценции до (синий) и после (гред) липосомы полимеризации.
Рисунок 4C условия для FRET. J изменений между донором (sulphorhodamine) и акцептора (PDA) с стрептавидин того, чтобы раствор липосом.
Рисунок 4D. FRET эффективность изменений между донором (sulphorhodamine) и акцептора (PDA) с стрептавидин того, чтобы раствор липосом.
Рисунок 5. Родамина спектр излучения после добавления аликвоты стрептавидин на КПК раствор липосом. Врезка показывает увеличить выбросы изменений в SR-101 спектров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы провели избирательного связывания остатка лизина белка на поверхности липосомы использованием NHS-амин реакции. Это FRET метода, основанного на это способна в режиме реального времени мониторинг биотин-стрептавидина и белка (БСА) привязку к поверхности липосомы. Подобная процедура может быть применена для изучения обязательных динамики различных взаимодействий белков с их избирательной рецепторов. Существует гибкость в выборе флуорофоров, что обеспечит изменениях в J значения в зависимости от спектральных характеристик флуорофоров. КПК является универсальным акцептором. Таким образом, использование КПК (акцептор), наряду с несколькими флуорофоров и рецепторов повышает возможность предоставления нам несколько датчиков. Чувствительность наших датчиков является суб-наномолярных и с оптимизацией, она может быть расширена. Специфика датчиков настраивается с помощью молекулярного взаимодействия между рецепторами и лигандами. Эти датчики могут также использоваться для более крупных частиц сУч как вирусы и бактерии.
Мы также смогли собрать ценную информацию, как расстояние между донорно-акцепторной, FRET эффективности и J-значения и т.д. расстояние между донором и акцептором рассчитывается как 2,8 нм. Это согласуется с нашим предсказанием. Так же есть большая необходимость мониторинга коварные вирусы, бактерии и другие вредные микроорганизмы, мы хотим производить ручные устройства, которые можно выполнять в режиме реального времени зондирования опасных биомолекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансовая поддержка для этой работы была предоставлена через Национальный научный фонд, Национальный институт здоровья (NIH), материалы технический центр (MTC) и ОРДА в SIUC. Мы благодарим NSF на получение гранта (CHE-0959568) на приобретение FE-SEM. Мы хотели бы поблагодарить профессора Мэтью McCarroll за полезные обсуждения. Юлия Рейес хотел бы поблагодарить COLCIENCIAS, Колумбийский университет агентства и Pedagogica у Tecnologica Колумбии за ее стипендии и финансовую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
