Summary
Vi visar FRET mellan konjugerad polymer polydiacetylen (PDA) och fluorofor fäst till ytan av PDA liposomer för avkänning av biomolekyler. PDA liposomer innehöll också receptormolekyler på sina ytor för biomolekyler som kan användas som prober. Ligand-receptor interaktioner leder till förändringar i FRET effektivitet mellan fluoroforen och PDA som utgör grunden för den avkännande mekanismen.
Abstract
FRET är en process där energi är icke-radiativt överförs från en exciterad donatormolekyl till jord-state acceptormolekyl genom långväga dipol-dipol-interaktioner 1. I föreliggande avkänning analysen använder vi en intressant egenskap hos PDA: blå-förskjutning i UV-Vis elektronisk absorptionsspektrum av PDA (figur 1) efter en analyt interagerar med receptorer kopplade till PDA 2,3,4,7. Denna förskjutning av PDA absorptionsspektrum ger förändringar i spektral överlappning (J) mellan PDA (acceptor) och rodamin (donator) som leder till förändringar i FRET effektivitet. Sålunda är interaktionen mellan analyt (ligand) och receptorer detekteras genom FRET mellan donator fluoroforer och PDA. I synnerhet, visar vi avkänningen av en modell proteinmolekyl streptavidin. Vi visar också kovalent-bindning av bovint serumalbumin (BSA) till liposomytan med FRET mekanism. Dessa interaktioner mellan tHan tvåskiktsmembran liposomer och proteinmolekyler kan kännas i realtid. Den föreslagna metoden är en generell metod för att avkänna små kemiska och stora biokemiska molekyler. Eftersom fluorescens är inneboende mer känslig än kolorimetri, kan detektionsgränsen för analysen vara i sub-nanomolära området eller lägre 8. Vidare, kan PDA fungera som en universell acceptor i FRET, vilket innebär att flera sensorer kan utvecklas med PDA (acceptor) funktionaliserade med givare och olika receptorer fästa på ytan av PDA liposomer.
Protocol
A. Syntes och karakterisering av PDA Liposomer 4,5,6
Anmärkning 1: Skydda PDA lösningen från ljus med omslag aluminiumfolie på varje behållare i alla experimentella steg.
Anm 2: Två olika uppsättningar av liposom lösning (B och C) framställdes följande förfarande A (Syntes och karakterisering av PDA liposomer).
1. Syntes av N-hydroxisuccinimid Diacteylene (NHS-PCDA)
- För att förbereda liposomer är en viktig ingrediens PCDA-NHS krävs. Vi har syntetiserat PCDA-NHS med följande procedur:
- Lägg 10,12-pentacosadiynoic syra (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hydroxisuccinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) och 1 - (3 - (dimetylamino) propyl)-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (0,144 g, 0,713 mmol ) i torr CH 2 Cl 2 (20 ml).
- Rör om lösningen vid rumstemperatur under 2 timmar.
- Ta försiktigt bort lösningsmedlet genom rotary indunstare för erhållande av en torr tunn film.
- Använd separationstratt att extrahera återstoden med dietyleter (25 ml) och vatten (25 ml) tre gånger.
- Torka det organiska skiktet med MgSO 4 (1,0 g) under en halv timme. Filtrera och avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning för erhållande av ett vitt fast pulver (0,24 g,> 90%).
- Analysera slutliga föreningen enligt kärnmagnetisk resonans (NMR).
- 1 H-NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).
2. Liposomberedningen 5,6,7
- Lös PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DMPC) :: 8: 1: 1 i 20 ml diklormetan.
- Filtrera lösningen med ett filterpapper för att avlägsna aggregat.
- Indunsta lösningsmedlet fullständigt för att ge en tunn film av monomerer.
- Torka den tunna filmen natten under vacuum.
- Hydratisera filmen med avjoniserat vatten (50 ml) för att göra en liposom lösning av önskad koncentration (0,65 till 1 mM).
- Sonikera den resulterande suspensionen med en sond-sonikator vid 76 ° C under ~ 18 minuter.
- Försiktigt passera lösningen genom ett pappersfilter för att avlägsna lipidaggregat
- Kyl lösningen vid 4 ° C över natten för att främja självorganisering av monomererna. Den slutliga lösningen skall vara optiskt klar.
- Polymerisera de self-assembled diacetylen monomerer (liposom) genom bestrålning med 254 nm UV-strålning för ~ 2 minuter med användning av en penna källa Ray UV (4,5 mW / cm 2) i luft.
- Liposomlösningen var stabil vid rumstemperatur under åtminstone två veckor. Lösningen var mer stabil när kylda.
B. Framställning av rodamin-märkta bovint serumalbumin modifierade (BSA-RH) PCDA liposomer
1. Bindning av BSA-Rh till liposomytan
- Lös BSA-Rh i PBS buffer (jonisk koncentration var 0,01 M, pH 7,2) för att göra den slutliga koncentrationen av 1,2 pM BSA-Rhodamine lösning.
- Tillsätt 2 ml (1,2 pM) i BSA-Rhodamine till 10 ml av liposomlösningen framställd i steg A.2. (Se ovan) vid rumstemperatur.
- Klassiska reaktion för bindning av amingrupper från lysinresten av proteiner till karboxylsyra aktiverad av NHS-gruppen har följts (Reaktionsschema i Figur 2). NHS-PCDA utformades (figur 2, steg 1) för kovalent bindande proteinmolekyler med liposomer med användning av NHS-amin reaktioner (figur 2, steg 2). NHS är ett utmärkt lämnande medel som driver amin-karboxylsyra reaktionen i riktning framåt. Utbytet för denna reaktion under lämplig villkor ska vara kvantitativ.
- Borttagning av BSA-Rh: Blöt en Spectra / Por Biotech cellulosaester (CE) membran (MW C O: 100.000) i avjoniserat watten under 15 min. Detta membran används för dialys av oreagerad BSA-Rhodamine (molekylvikt ~ 66.000 Da) i avjoniserat vatten.
- Försiktigt överföra lösningen i på dialysmembranet.
- Byt vatten vid 2 timmar, 8 timmar, 14 timmar, 24 timmar och 36 timmar under dialys.
- Samla den slutliga lösningen i en flaska täckt med aluminiumfolie.
C. Framställning av SR-diamin och Biotin-märkta liposomer
1. Istället för att använda DMPC i steg 2,1, kommer vi att använda biotin-märkt-(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(biotinyl) (biotin-DOPE).
- Följ alla steg till 2,2 till 2,9.
- Istället för BSA-Rh i steg B, använd diamin taggade Sulforodamine (SR-diamin).
- Följ alla ytterligare steg i B.
- Liposomerna i denna beredning innehöll biotin och SR-diamin på sina ytor. Efterföljande steg var liknande till A och B (se ovan) med ett undantag: streptavidin tillsattes till Solutipå att undersöka biotin-streptavidin interaktioner genom förändringar i FRET effektivitet.
D. Representativa resultat
Titel Figur. En tecknad förklarar reaktionen och FRET process uppträder vid liposomytan (framställd genom att följa steg B).
A. Övervakning av protein anknytning till liposomer med FRET 1
Övervakning av FRET mellan Rhodamine och PDA liposomer framställda i steg B.
Excitations-och emissionsspektra av BSA-Rh och absorptionsspektrum av PDA tas (figur 3A). Vi kan tydligt se att emissionsspektrum av BSA-Rh överlappar med absorptionsspektrumet för PDA. Detta uppfyller resonans krav för FRET mekanismen. BSA-Rhodamine märkta liposomer före och efter polymerisation analyserades med UV-Vär och fluorescensspektroskopi. För isolerade donator och acceptor, FRET effektivitet är starkt beroende av donator-acceptor-avstånd (r) och J 1 (j-värde). Den släckning i emissionen observeras (Figur 3B) på grund av FRET mellan rodamin och PDA på grund av uppkomsten av elektronisk absorptionsspektrum av blå PDA efter fotopolymerisation. I vårt fall FRET effektivitet är noll för opolymeriserade liposomer och Rhodamine eftersom J = 0 för opolymeriserade liposomer i det synliga området.
Vi utfört liknande försök med enbart PDA liposomer som inte innehöll NHS på sin yta. I dessa fall, BSA-Rh inte taggade till ytan av liposomerna. I så fall var det genomsnittliga avståndet mellan rodamin och PDA (r genomsnitt) mycket större än Forster radie (R 0 = 2,8 nm). Därför har vi observerar inte en stor minskning i fluorescensintensiteten. Denna observation enLSO tyder på att fluorescensdämpning dominerar när r <2,8 nm.
J och R 0 värden beräknades med användning följande formler: [1]
J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ
R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6
Extinktionskoefficienten (ε) av blå-handdator är i intervallet ~ 2000-10000 M -1 cm -1 före tillsatsen av streptavidin. Extinktionskoefficienten för blå-PDA är beroende på foto-polymerisations tillstånd. [2] Till exempel kommer e värdena vara större för en lösning som polymeriserades en längre tid. Vidare kan självorganisering av diacetylen monomererna påverkar även e-värden. J calculheten ta hänsyn dessa förändringar, och de speglar förändringar i PDA extinktionskoefficienter grund biotin-streptavidin molekylära interaktioner. J-värden beräknas med hjälp av experimentell PDA absorption och SR-101 utsläppsdata. Förändringarna i J-värden beror att förskjutas i den elektroniska absorptionsspektrumet av PDA efter tillsats av streptavidin till lösningen (figur 4C). Enheten för J-värden är M -1 cm -1 nm 4.
B. Övervakning av FRET med tillsats av streptavidin till biotin-märkta liposom lösning
Not 1: Övervakning av FRET mellan Rhodamine och PDA liposomer framställda i steg C ovan.
Excitation och emissionsspektra för Sulforodamine taggade-diamin (SR-diamin) och absorptionsspektrum av PDA tas (figur 4A). Opolymeriserade och polymeriserade biotin märkta liposomer analyserades med användning av UV-Visoch fluorescensspektroskopi. Utsläppen av rodamin (SR-101) minskas med ca 45% efter polymerisation (Figur 4B) tyder utsläppen släckning grund FRET. Lägg 40 ul alikvoter (1 pM) av streptavidin lösning till 2 ml av liposomlösningen. Med tillsats av streptavidin till lösningen, är förändringar i J observerade värdet (figur 4C). Såsom biotin binder till streptavidin, blå toppintensiteten av PDA liposom (centrerad vid ~ 645 nm i figur 1) har minskat medan en ökning i absorptionstoppen vid 540 nm observeras (F igure 1S). Figur 4D visar förändringar i FRET effektivitet. FRET effektivitet minskade med ökningen av streptavidin koncentration är också förenligt med vår prognos.
Spela SR utsläpp efter varje 40 ul alikvot tillägg av streptavidin. Vi observerade en stadig ökning av rodamin emissionen efter tillsats av streptavidin (Figur 5). Denna ökning i rodamin utsläppen beror på en minskning i J-värdet för Sulforodamine emissionsspektrum och PDA absorbansspektrum efter biotin-streptavidin interaktioner. På molekylär nivå, biotin-streptavidin samspel leder till subtila ändringar i den effektiva längden konjugering av PDA, vilket resulterar i en minskning i den blå-PDA form till en mer termodynamiskt stabil röd-PDA formen 2. Detta är grunden för förändringar i J-värden. Intressant nog kan de subtila skillnaderna i de molekylära interaktioner för kovalent eller icke-kovalent bunden biotin till PDA liposom sonderas med vår avkänning analys 4.
Vi har också utfört kontroll experiment och har övervakat utsläpp av kontrollprover under samma experimentella villkor som de som gäller för streptavidin-biotin-systemet. Kontrollexperimenten består av: (1) liposom lösningar som innehöll biotin på derasyta sattes buffertlösning av samma volym och koncentration, och (2) Liposom lösning utan biotin receptorer på sin yta sattes streptavidin av samma volym och koncentration. Intensiteten av biotin-märkta liposom lösning efter tillsats av streptavidin visade förstärkt intensitet men intensiteten av liposom lösning av kontrollexperimenten (till exempel, se figur 2S), å andra sidan, uppvisade en minskad i emissionsintensitet. Detta tillskrivs utspädning av lösningen. Dessa experiment visade klart att den förbättrade emissionen av lösningen berodde på specifika molekylära interaktioner.
Forster radie (R 0) för rodamin och PDA par beräknas (eq.2) är ~ 2,80 nm. Detta innebär att för isolerade PDA-Rhodamine par kommer 50% av de exciterade molekylerna statliga rodamin ha sin energi överförs till handdatorn när r är 2,80 nm.
Vi obs erved att när biotin kovalent fäst till PDA ryggraden, var ökade utsläpp 2-3 gånger större än den hos icke-kovalent bundet biotin till liposomer. 4 Dessa resultat tyder starkt på att vårt föreslagna systemet är känsligt att särskilja subtila skillnader i interaktioner vid omvandlaren (linkern mellan biotin och liposombiskiktet) på grund av kovalent och icke-kovalent bundna receptorer bundna till liposomer. Beroende på skanning och datafångst kapacitet spektrofotometer, övervakning i realtid (i millisekund till andra gången skala) för proteininteraktioner (i UV-Vis-spektroskopi) är möjligt med denna avkänningssystem.
Figur 1. Absorptionsspektra blå och röda PDA lösningar. (Infälld) optiska mikrofoton tagna med en digitalkamera.
g "/>
Figur 2. Reaktionsschema för PCDA-NHS-syntes (steg 1). Reaktion av PCDA-NHS till aminen substituenten av proteiner (steg 2). Steg 2 är grunden för bindning av lysin rester av proteiner till karboxylsyra av PCDA monomer. Klicka här för att se större bild .
Figur 3A. Förändring observerade FRET effektivitet beror på förändringar i absorptionsspektrum av PDA. Före polymerisation finns det ingen överlappning mellan BSA-Rh utsläpp och PDA absorptionen men efter polymerisation PDA absorption överlappar BSA-Rh emission som är kravet för FRET. Rodamin är en givare (röd) och polymeriserade PDA liposomer fungerar som en acceptor (blå).
Figur3B. Fluorescensspektra av BSA-Rh märkta liposomer före (blå) och efter PCDA polymerisation (röd). En stor minskning av rodamin emission observeras beroende på FRET mellan rodamin och PDA.
.. Figur 4A spektral överlappning (J) förändring för PDA (blå eller röd) absorptionsspektrum och Sulforodamine emissionsspektrum (orange) Figur 4A är företrädare spektrum för extrema tillstånd, det vill säga när ett överskott av streptavidin tillsattes till lösningen. Figur 4A visar en nästan fullständig blå-till-röd PDA omvandling efter tillsats av ett överskott av streptavidin. Det framgår tydligt att J (spektral överlappning) ökar med blå-förskjutning av PDA-absorptionsspektrum
Figur 4B. Fluorescensspektra före (blå) och efter (red) liposom polymerisation.
Figur 4C Villkor för FRET:. J förändring mellan donator (Sulforodamine) och acceptor (PDA) med streptavidin tillägg till liposomlösningen.
Figur 4D. FRET effektivitet förändring mellan donatorn (Sulforodamine) och acceptor (PDA) med streptavidin tillägg till liposomlösningen.
Figur 5. Rhodamine emissionsspektrum efter tillsats av streptavidin alikvoter till PDA liposomlösningen. Infällda bilden visar en större bild av utsläpp förändringar i SR-101-spektra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utfört selektiv bindning av lysinrest av protein på liposomytan med NHS-amin reaktion. Detta FRET metod är kapabel att göra Realtidsövervakning av biotin-streptavidin-bindning och protein (BSA) bindning till liposomytan. Liknande förfarande kan användas för att studera de bindande dynamiken i olika proteininteraktioner med sina selektiva receptorer. Det finns flexibilitet i valet fluoroforer som ger förändringar i J-värden beroende på de spektrala egenskaperna hos fluoroforerna. PDA är en universell acceptor. Således medför användningen av PDA (acceptor) tillsammans med flera fluoroforer och receptorer möjligheten att ge oss flera sensorer. Känsligheten hos våra sensorer är sub-nanomolära och optimering, kan det vara ytterligare. Specificiteten av sensorerna är avstämd genom användning av molekylära interaktioner mellan receptorer och ligander. Dessa sensorer kan även användas för större partiklar sUCH som virus och bakterier.
Vi kunde också samla värdefull information som avstånd mellan donator-acceptor, FRET effektivitet och J-värde etc. Avståndet mellan givaren och mottagaren beräknas till 2,8 nm. Detta var i linje med vår prognos. Eftersom det finns ett stort behov av övervakning av lömska virus, bakterier och andra skadliga mikroorganismer, vill vi att tillverka en handhållen enhet som kan utföra realtid avkänning av farliga biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd till detta arbete ges genom National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) och ORDA på SIUC. Vi tackar NSF om bidrag (CHE-0.959.568) för inköp av en FE-SEM. Vi vill tacka professor Matthew McCarroll för hjälp diskussioner. Julia Reyes kommer tacka Colciencias, colombianska Agency och Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia för hennes stipendium och finansiellt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,12-pentacosadiynoic acid (PCDA) | GFS chemicals | 3261 | Light sensitive |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Acros organics | 157270250 | Moisture sensitive |
| 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar lipids | 850345P | |
| Rhodamine-tagged Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-(biotinyl)(biotin-DOPE) | Avanti Polar lipids | 870282 |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-588 (1993).
- Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors. Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).
- Xuelian, L. i, Kohli, P. unit Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).
- Li, X., Matthews, S., Kohli, P. Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes. J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).
- Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes. Langmuir. 22, (2006).
- New, R. R. C. Liposomes: A Practical Approach. New, R. R. C. , Oxford University Press. Oxford. 33-104 (1990).
- Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -M., Yoon, J. Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules. Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).
- Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene. Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).
