Immunology and Infection

شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

Published: February 8, 2012 doi: 10.3791/3807

¹Department of Biology, Boston College

Summary

تقدم علم الوراثة هو وسيلة قوية لكشف المستوى الجزيئي لكيفية

Abstract

، وتلزم على نطاق واسع داخل الخلايا، طفيل بروتوزوا المقوسة الغوندية يسبب مرض الانتهازية في المناعية للخطر المرضى ويسبب تشوهات خلقية على العدوى الخلقية. وتتميز دورة النسخ المتماثل التحللي من ثلاث مراحل: 1. نشط غزو خلية المضيفة الأنوية، 2. تكرار داخل الخلية المضيفة، 3. نشط الخروج من الخلية المضيفة. وعلى نحو متزايد آلية الخروج يجري تقديره بوصفه عملية فريدة من نوعها، تنظيما، والتي لا تزال غير مفهومة على المستوى الجزيئي. وقد اتسمت مسارات الإشارات الكامنة وراء الخروج من خلال استخدام وكلاء الدوائية تعمل على جوانب مختلفة من مسارات ^1-5. على هذا النحو، وقد تم تحديد عدة مشغلات مستقلة من الخروج التي تتلاقى كل على اطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +،} إشارة إلى أن من المهم أيضا للغزو الخلية المضيفة ^6-8. وأبلغت هذه الرؤية نهج الجين مرشح الذي أدى إلى identiتقويتها من النباتات مثل الكالسيوم بروتين كيناز تعتمد (CDPK) تشارك في الخروج ^9. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحقيق اختراقات عديدة مؤخرا في الخروج التفاهم باستخدام (مادة كيميائية) النهج الوراثية ^10-12. من الجمع بين وفرة المعلومات الدوائية مع إمكانية الوصول الوراثية المتزايدة للالتوكسوبلازما أنشأنا مؤخرا على شاشة السماح لتخصيب اليورانيوم لالمسوخ طفيلي مع وجود خلل في خروج الخلية المضيفة ^13. على الرغم من استخدام الطفرات الكيميائية باستخدام N-إيثيل-N-nitrosourea (ENU) أو إيثيل methanesulfonate (EMS) لعقود من الزمان في دراسة علم الأحياء التوكسوبلازما ^11،14،15، إلا في الآونة الأخيرة ورسم الخرائط الوراثية من الطفرات الكامنة وراء الظواهر تصبح روتينية ^{16 -18.} وعلاوة على ذلك، من خلال توليد الحرارة حساسة المسوخ، يمكن تشريح العمليات الأساسية والجينات الكامنة التي تم تحديدها مباشرة. هذه المسوخ تتصرف كما نوع البرية تحت درجة حرارة متساهلة (35 درجة مئوية)، لكنه يفشل في فroliferate في درجة الحرارة تقييدا (40 درجة مئوية) وذلك نتيجة للطفرة في السؤال. نحن هنا لتوضيح طريقة جديدة لعزل الفحص المظهري المسوخ مع النمط الظاهري الخروج حساسة للحرارة ^13. والتحدي الذي يواجه شاشات الخروج هو الفصل egressed من غير egressed طفيليات، وهي مسألة معقدة بسبب بسرعة إعادة غزو والحساسية العامة للطفيليات إلى الخلايا المضيفة. واستند شاشة الخروج المحددة سابقا على سلسلة معقدة من الخطوات للفصل بين الخلايا biotinylation من طفيليات خارج الخلية ^11. هذا الأسلوب أيضا لم تولد المسوخ الشرطي مما أدى إلى ضعف الظواهر. الطريقة الموضحة هنا يتغلب على تعلقه الشديد من egressing الطفيليات بما في ذلك من قبل منافس غليكان، كبريتات ديكستران (DS)، الذي يمنع الطفيليات من الالتصاق إلى الخلية المضيفة ^19. وعلاوة على ذلك، يتعرضون للقتل على وجه التحديد طفيليات خارج الخلية قبالة عن طريق dithiocarbamate بيروليدين (PDTC)، الذي يترك الطفيليات داخل الخلايادون أن يصاب بأذى ^20. لذلك، مع شاشة المظهري جديدة لعزل تحديدا المسوخ طفيلي مع عيوب في الخروج الناجم، ويمكن الآن قوة علم الوراثة يمكن نشرها بالكامل لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء خروج الخلية المضيفة.

Protocol

نظرة عامة

وتقدم البروتوكولات لتحديد أول جرعة من المغير مما أدى إلى مقتل 70٪ من الطفيليات (بروتوكول 1). ويرد الإجراء التالي لإثراء المسوخ الخروج الناجم عن طفيلي من تجمع mutagenized (بروتوكول 2، الشكل 2). ويعقب ذلك وضع بروتوكول لاختبار حدوث طفرات الخروج في تجمع المخصب، أو للتحقق من صحة النمط الظاهري الخروج في المسوخ الفردية (بروتوكول 3). أخيرا، يقدم بروتوكول لتوليد الحيوانات المستنسخة طفيلي واحد من السكان المخصب عن طريق الحد من تخفيف (البروتوكول 4).

1. المعايرة من المغير

توخي الحذر خاصة، مثل قفازات مزدوج، عند التعامل مع مركبات مطفرة جدا والسوائل. جمع النفايات السائلة على حدة للتخلص السليم.

تطعيم T25 قوارير زراعة الأنسجة متموجة مع خلايا القلفة البشرية (HFF) الليفية مع 1 مل من tachyzoites هي lysed طازجة وتنمو 18-25 ساعة عند 37 درجة؛ C أقل من 5٪ CO ₂ في Ed1 المتوسطة (D-الفنزويلية استكمال مصل الجنين 1٪ للحرارة المعطل البقري، 0.2 مم L-الجلوتامين، و 50 يو / مل البنسلين، الستربتومايسين 50 ميكروغرام / لتر، و 0.25 ميكروغرام / مل الامفوتريسين B ). انظر روس وآخرون. لتحقيق النمو العام ووسائل الإعلام من الخلايا HFF والطفيليات ^21.
استبدال المتوسطة مع 10 مل المتوسطة البقري بنسبة 0.1٪ الجنين المصل (المخففة Ed1 1:10 في D-MEM)، وترك في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية تحت ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ ₂ (تسمى "37 درجة مئوية حاضنة" من هنا) لمدة 10 دقيقة .
إضافة 0، 12.5، 25، 50، أو 100 ENU ميكروليتر (1 M الأسهم في DMSO) أو EMS (1 M الأسهم في DMSO) في قارورة (التخفيفات المغير العمل سيكون 1.25، 2.5، 5، و 10 مم، على التوالي). إضافة DMSO إلى 100 ميكروليتر لكل قارورة. احتضان لمدة 4 ساعات في الحاضنة 37 درجة مئوية.
يغسل ثلاث مرات لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة وذلك بدهن أحادي الطبقة مع 10 مل PBS الباردة (قبل تبريده في درجة مئوية 4).
إضافة 5 مل PBS، كشط أحادي الطبقة فضفاض مع شرطي المطاط (الخلية قرار مجلس الأمنأبر)، تمر خلايا كشط من خلال إبرة G 26.5 لإزالة بدنيا الطفيلي من الخلايا الليفية (قصاصة قبالة رمح خارج إبرة مع مقص الثقيلة على ألا تتعرض لإبرة)، ومرشح مع 3.0 ميكرون البولي مرشح. والممرات إبرة متعددة زيادة كفاءة الافراج عن الطفيليات من الخلية المضيفة.
حساب تركيز طفيلي باستخدام عدادة الكريات. السماح للطفيليات تسوية لمدة 5 دقائق في hemocytomer قبل الفرز.
إضعاف الطفيليات إلى 10،000 الطفيليات في 3 مل في Ed1 (لوهناك حاجة إلى 10 مل 33333 طفيليات).
تطعيم بئر واحدة في لوحة 6 جيدا مع 3 مل من الطفيليات المخفف (التي تحتوي على 10000 طفيليات). تمييع متسلسل الطفيليات بمقدار 10 أضعاف خلال 3 آبار في متكدسة لوحة 6 جيدا مع الخلايا التي تحتوي على 2.7 مل HFF Ed1 عن طريق تحويل 300 ميكروليتر من أول بئر. ترك لوحات دون عائق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
نضح المتوسطة، وتحديد مدة 15 دقيقة مع 3 مل / جيد الإيثانول بنسبة 100٪، وصمة عارمع 3 مل / حل جيد الكريستال البنفسجي (12.5 البنفسجي الكريستال غ في 125 مل من الايثانول مختلطة مع 500 مل أكسالات الأمونيوم 1٪) لمدة 15 دقيقة، شطف مع 3 مل / جيد في برنامج تلفزيوني (1 دقيقة)، والهواء الجاف. كل في درجة حرارة الغرفة.
عد لويحات وحدد تركيز المغير اللازمة لتحقيق البقاء على قيد الحياة من 30٪ من الطفيليات يتعرض (70٪ مما أسفر عن مقتل الجرعة: انظر الشكل 1). وقد استخدمت جرعة من قتل 70٪ ¹⁴ و تاريخيا بفعل الطفرات نقطة أقل من 100 في الجينوم (فاريل، مارث، Gubbels وآخرون، مخطوطة المقدمة).

2. تخصيب اليورانيوم من المسوخ الخروج (الشكل 2)

أداء الطفرات على النحو المبين أعلاه باستخدام جرعة المغير حمل قتل 70٪. ينمو السكان mutagenized لمدة مرور في قارورة جديدة من الخلايا المضيفة.
تصيب T25، HFF زراعة الأنسجة متكدسة قارورة مع 120000 طفيليات هي lysed حديثا من سكان mutagenized في 10 مل Ed1. احتضان لمدة 2 ساعة في حاضنة 35 درجة مئوية تحت ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪(2) ومرطب (من الآن فصاعدا ب "35 درجة مئوية حاضنة").
نضح المتوسطة وشطف 10 ثانية مع 10 PBS الباردة مل و 10 مل ثم أضف Ed1 المتوسطة تستكمل مع 25 ملغ / مل كبريتات ديكستران (DS) ^13. احتضان لمدة 26 ساعة في الحاضنة 40 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون ₍₂₎ ومرطب (من الآن فصاعدا ب "40 درجة مئوية حاضنة").
يعد حل عمل والقدرة على الخروج. تخفيف محفز الخروج من خيار في تركيز العمل في أنبوب 15 مل الصقر تحتوي على 10 مل HBSSc تستكمل مع DS ملغ / 25 مل. قبل دافئ والتخفيفات لمدة 30 دقيقة في بالحمام المائي 37 درجة مئوية. انظر الجدول رقم 1 لتركيزات العمل.
نضح متوسطة من قوارير طفيلي المصابة وإضافة ما قبل حرارة حل محفز الخروج. احتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية للمرة مبين في الجدول رقم 1.
نضح المتوسطة وشطف 10 ثانية مع 10 PBS الباردة مل و 10 مل ثم يضاف Ed1 تستكمل مع 25 ملغ / DS مل و 50 ميكرومتر dithiocarbamate بيروليدين (PDTC: إعلاند 5 ميكرولتر 100 ملم PDTC الأسهم في برنامج تلفزيوني) ^13. احتضان 5 ساعات في الحاضنة 35 درجة مئوية.
نضح المتوسطة وشطف 10 ثانية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مل 10 (درجة حرارة الغرفة) ثم قم بإضافة 10 مل Ed1 المتوسط. وضع قوارير العودة الى الحاضنة 35 درجة مئوية حتى طفيليات تدمير أحادي الطبقة: قوارير هزة يوميا. هذا الانتعاش يستغرق حوالي 7 أيام.

3. التحقق من الظواهر متحولة بواسطة فحوصات الخروج

بعد أداء الشاشة لتخصيب اليورانيوم ويشبون السكان المخصب لإحدى الفقرات في الخلايا HFF، والظواهر تحتاج إلى تأكيد من قبل فحص الخروج ^11،13. وينبغي أيضا هذا الفحص يمكن استخدامها للتحقق من صحة الحيوانات المستنسخة واحدة بعد بروتوكول 4.

تلقيح 20000 طفيليات لكل بئر إلى 24 صفيحة تحتوي على خلايا HFF جيدا متموجة نمت على coverslips (1 مل Ed1 المتوسطة لكل بئر). احتضان 8 ساعات في الحاضنة 35 درجة مئوية ثم نقل الى الحاضنة 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
تغسل مع PBS مل / جيد 1 (10 ثانية في درجة حرارة الغرفة). إضافة 1 المحرضات الخروج مل (تشمل DMSO سيطرة السلبية فقط)، قبل تحسنت والمخفف في HBSSc واحتضانها للمرة هو موضح في الجدول رقم 1.
نضح المتوسطة وإصلاح مع 1 مل / جيد الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إذا استخدمت طفيليات الأم التعبير عن بروتين autofluorescent لالطفرات، انتقل إلى الخطوة # 3.5 ^13. إذا استخدمت طفيليات بروتين غير فلوري كما أعرب عن خط الأم، وصمة عار على coverslips ثابت مع الفرق السريع وصمة عار لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ^11.
غسل 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني مل / جيد 1 في لوحة 24-جيدا في درجة حرارة الغرفة.
للطفيليات بروتين فلوري تعبير: شطف بسرعة ساترة في DDH ₂ O (غمس) وجبل على الشرائح تحت gelmount لحماية إشارة مضان. للطفيليات الفرق السريع الملون، وغسل 10 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪ والسماح للهواء الجاف قبل تصاعد على الشريحة.
باستخدام مجهر (مضان) مع40-60x الهدف حساب النسبة المئوية للفجوات egressed مقابل الفجوات التي بقيت داخل الخلايا (انظر الشكل 4).

4. استنساخ المسوخ الخروج عن طريق الحد من تخفيف

بعد المصادقة على النمط الظاهري من السكان الخروج المخصب متحولة باستخدام بروتوكول 3، وعدد السكان بولكلونل يحتاج إلى مستنسخ للحصول على استنساخ طفيلي وحيد.

عدد الطفيليات السكان في عدادة الكريات وتمييع لتركيز الطفيليات من 500 مل لكل Ed1 في المتوسط.
في لوحة 384 جيد يحتوي على أحادي الطبقة متموجة من الخلايا HFF، يستعاض عن المتوسط مع 40 ميكرولتر / جيد من Ed1 المتوسطة باستخدام الماصة متعدد القنوات. كما هو مبين في الشكل (5)، ويمكن استنساخ 4 السكان بولكلونل لكل لوحة على النحو التالي: الماصة 40 ميكروليتر / جيد من متحولة المخفف 1 في الآبار C3-C12، متحولة 2 في الآبار C13، C22، متحولة إلى 3 آبار H3-H12، ومتحولة 4 في الآبار H13-H22 (حجم نهاية في الآبار هي الآن 80 ميكرولتر). استخدام متعدد القنوات الماصة، الماصة سولution صعودا ونزولا 5 مرات، ثم نقل 40 ميكروليتر إلى الصف أسفل الصف البداية (من صف إلى C D أو H الصف الأول). مواصلة هذه التخفيفات 2-G أضعاف المسلسل عن طريق صف (المسوخ 1 و 2) أو N صف (المسوخ 3 و 4). تجاهل إضافي 40 ميكرولتر من الصف الأخير. احتضان في حاضنة 35 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام من دون إزعاج لوحة.
التحقق من الآبار على مجهر مقلوب مع هدف 10-20X عن وجود لويحات واحدة، واضحة على أنها "الثقوب" في أحادي الطبقة.
اختيار 4 آبار في متحولة مع لوحة واحدة ونقل الطفيليات في قارورة متكدسة زراعة الأنسجة مع خلايا HFF ومليئة Ed1 المتوسط. تنمو الطفيليات حتى في الحاضنة 35 درجة مئوية؛ يهز قوارير يوميا لتفريق طفيليات خارج الخلية. هذا عادة ما يستغرق 7 أيام.

5. ممثل النتائج

وENU المطفرة ونظم الإدارة البيئية ليست مستقرة عند تخزينها على مدى فترات طويلة من الزمن. لذلك، واختبار القوة من مطفرةالأسهم أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج يمكن استنساخه. وتظهر نتائج المعايرة النموذجية وقتل منحنيات لكلا ENU ونظم الإدارة البيئية في الشكل 1. ومع ذلك، فمن المستحسن لإجراء فحوصات لوحة لكل تجربة الطفرات للتأكد من أنه تم استخدام الجرعة المناسبة. للحفاظ على التنوع في السكان طفيلي mutagenized، من المهم المضي قدما على الشاشة متحولة الخروج بأسرع وقت ممكن. عادة، يتم تنفيذ أحد المقاطع من الطفيليات في قارورة جديدة للسماح للطفيليات على قيد الحياة يتعافى قبل مضي قدما مع الشاشة. وينبغي أن يوضع في الاعتبار أن تفعل هذا سيؤدي إلى تقسيم المسوخ. ولذلك لا يمكن استبعاد أن المسوخ نسيلي متعددة معزولة بعد استكمال الإجراءات كلها تحتوي على بالضبط النمط الجيني نفسه. لتجنب عزل نفسه عدة مرات متحولة فمن المستحسن لعزل فقط متحولة خروج واحد لكل الطفرات، ما لم الظواهر الخاصة (مثل الحساسيات محفز الفرق الخروج) هيتختلف كثيرا عن بعضها البعض. من ناحية أخرى، ليس كل النتائج الشاشة في عزلة من المسوخ مع النمط الظاهري المطلوب. ولا سيما الكالسيوم ^{2 +-ionophore} A23187 النمط الظاهري المقاوم هو نادر ويتطلب تجارب الطفرات المتعددة والشاشات لعزل متحولة خروج واحد. ولذلك فمن المستحسن لتنفيذ الطفرات 5-10 والتجارب الشاشة في نفس الوقت.

تم اختبار قوة التخصيب من الشاشة عن طريق خلط متحولة الخروج معروف مع من النوع البري طفيليات في نسب مختلفة. وتعرض هذه المخاليط على الشاشة، وجرى تقييم وقوع المسخ في النمط الظاهري للسكان المخصب. ويمكن باستخدام البرية من نوع الطفيليات معربا عن RFP حشوية وخط متحولة معربا عن YFP حشوية بسرعة حوادث ينشئه التدفق الخلوي (الشكل 3) ^13. وتظهر النتائج التي يمكن أن الظواهر متحولة المخصب بشكل روتيني لنقاء 80٪ من خلال البدء مع الطفيلي الخروج 1 متحولة في ص البرية من نوع 10000arasites ^13. ومع ذلك، عند الخروج متحولة: من النوع البري نسبة بداية الطفيلي 1:100،000 الطفيليات، والسكان معزولة ليست سوى 1-2٪ المسوخ الخروج (1:100). ولذلك فإن قوة التخصيب من الشاشة هو 1000 أضعاف. منذ الشاشة يبدأ تلقيح 120000 الطفيليات، والتي عادة 70٪ قابلة للبقاء، ونحن عادة ما يقوم جولتين من تخصيب اليورانيوم. وتزرع الطفيليات المعزولة ما بين الجولتين تخصيب اليورانيوم. هذا الإجراء يؤدي إلى سكان متحولة 100٪ حتى عندما تبدأ 1:1،000،000 الخروج متحولة: طفيليات من النوع البري.

وفحص الخروج للتحقق من صحة وتميز الظواهر يتطلب تعدد عدوى الخلية المضيفة التي تسمح التفريق بين فجوات الفردية. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا عند تحليل الأوضاع مع نسبة عالية من الخروج كما تنتشر الطفيليات فرد حولها. كما هو مبين في الشكل (4)، إذا لم يتم فصل السكان egressed جيدا فمن السهل أن نقلل من نسبة مئويةمن الخروج عن طريق العد 2 فجوات egressed فجوة واحدة. منذ الخروج والغزو والعمليات ذات الصلة، وبعض الظواهر درجة الحرارة حساسة للعرض النمط الظاهري معتدل في درجة حرارة أقل، لن يكون جميع المسوخ الكفاءة غزو مماثل. ولذلك يجب أن يلقح هذه المسوخ في جرعات عدة أضعاف أعلى للحصول على كثافة عالية فجوة كافية لإجراء تقييم دقيق للخروج من النمط الظاهري. وعلاوة على ذلك، بعض المحرضات الخروج لا تحفز بكفاءة الخروج من الفجوات التي تحتوي على أربعة طفيليات أو أقل. على هذا النحو، من المهم أن تحتوي على فجوات 8 طفيليات أو أكثر عند بدء فحص الخروج. في مختبرنا نحن المسوخ شاشة معزولة مع محسن الخروج ولا سيما ضد القدرة على الخروج أخرى. ويمكن بواسطة التنميط بهم عبر التفاعل يتم تجميع المسوخ في فئات مختلفة. وأخيرا، لن يكون الخروج عن المسوخ حساسة للحرارة. في المسوخ خاصة معزولة مع المحرضات الخروج مما اثار خطوات قبل إطلاق سراح intracellulaص كا ^{2 +} عرضة لعدم درجة الحرارة الظواهر الحساسة. هذا ويرجع ذلك إلى مسارات موازية يمكن أن يؤدي إلى الخروج قبل الإشارة تتقارب على اطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +.}

الشكل 1. معايرة الجرعة الكيميائية المغير. المقايسات البلاك A. التي أجريت في لوحة 6 جيدا باستخدام تركيزات مختلفة EMS وأرقام مختلفة من الطفيليات لكل بئر على النحو المشار إليه. والبقع البيضاء هي لويحات طفيلي أحادي الطبقة التي تشكلت في HFF باء، جيم منحنيات البقاء على قيد الحياة من الطفيليات عند التعرض لجرعات مختلفة من نظم الإدارة البيئية (B) وENU (C). وجرى تقييم البقاء على قيد الحياة بواسطة فحوصات لوحة. يتم اختيار ألف جرعة حمل قتل 70٪ للتجارب الطفرات. المتوسطات من ثلاث تجارب مستقلة + / - وتظهر الانحراف المعياري.

الشكل 2
وآخرون. ^13.

الشكل (3)
الشكل 3. نموذجي تخصيب الظواهر متحولة الخروج. نتائج التخصيب لمتحولة الخروج مختلطة في البرية من نوع الطفيليات على نسب مختلفة (المحور x). وأعرب البرية من نوع الطفيليات يتم رسم نسبة مئوية من الظواهر متحولة الخروج في عدد السكان كبروا بعد الشاشة على المحور ص والمقررة من قبل التدفق الخلوي (طفيليات متحولة الخروج عن YFP حشوية، قبرصيtoplasmic RFP). وتمثل نتائج ثلاث تجارب مستقلة من نقاط البيانات الأحمر والأزرق والأخضر. اعتمدت من Eidell وآخرون. ^13.

الشكل 4. نتائج نموذجية لفحص الخروج. والسهام. بمناسبة مرور أربعة فجوات سليمة مختلفة تحتوي على طفيليات 4-8. B. سهام بمناسبة أربع مجموعات متناثرة من الطفيليات التي تعكس 4 فجوات egressed مستقل. وكان المستحث الخروج من A23187 (B) أو DMSO كعنصر تحكم سلبي (A). طفيليات التعبير عن YFP حشوية ^22.

الشكل 5. يتم تخفيفه بشكل متسلسل تخفيف مسلسل لخطوط طفيلي نسيلي. أربعة السكان بولكلونل (أحمر، أزرق، أصفر، أخضر) في لوحة واحدة متموجة 384 بشكل جيد مع خلايا HFF. C صف، وأنا على 10 في الطفيليات بشكل جيد وهي 2 أضعاف المخفف (40 + 40 ميكروليتر ميكرولتر) حتى H الصفوف وN، على التوالي. ظلال رمادية يشير إلى تناقص عدد الطفيليات لكل بئر. عادة، يتم العثور على استنساخ واحدة في الصفوف ومدافع JL.

مركب	الأوراق المالية	تركيز العمل	ميكرولتر اللازمة لT25 (10 مل)	فترة حضانة (دقيقة)
DTT	1 م في DMSO	5 ملم	50	15
الإيثانول	والدليل على 190	5٪	500	30
A23187	2 مم في DMSO	1 ميكرومتر	5	5
nigericin *	2 مم في DMSO	10 ميكرومتر	50	30

* لا يمكن nigericin يمكن استخدامها في تخصيبمنة الشاشة كما الطفيليات لا البقاء على قيد الحياة nigericin التحفيز، واستخدام فقط nigericin في التحقق من المسوخ الخروج.

المحرضات جدول الخروج 1. تستخدم في الإجراءات. تمييع في تحتوي على 10 مل HBBSc 25 ملغ / مل DS للشاشة، أو لا DS من أجل التحقق من المسخ (فحص الخروج). جميع المركبات من سيغما الدريخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول وصف يوفر وسيلة فعالة لعزل المسوخ التوكسوبلازما مع عيب الخروج. لقد نجحنا في عزل المسوخ على طول خطوات مختلفة لمسار الخروج، وبعضها لديها النمط الظاهري غزو المزدوج ^13. ويمكن تحديد الآثار المحتملة على الغزو باستخدام ما يسمى الأحمر والأخضر الفحص، التي تميز غزا من غير غزو الطفيليات التي تلطيخ الضد الفرق ^23،24. لفحوصات الغزو والخروج على حد سواء يمكن أن تكون ملائمة للتعبير عن علامة بروتين autofluorescent في السيتوبلازم للطفيليات ^13،22. ومع ذلك، إذا يتم mutagenized الطفيليات بالفعل التعبير عن بروتين فلوري هذا يمكن أن تتداخل مع التوصيف المظهري إضافية المناعي في وقت لاحق. من الممكن دائما لإضافة علامة فلوري إلى متحولة بعد عزلتها. كما هو موضح، بسيطة، غير فلوري البديل هو الفرق السريع تلطيخ للخروج.

(المقدمة مخطوطة فاريل، مارث، Gubbels وآخرون،) تي "> من الناحية التاريخية، تم تطبيق ENU المغير على علم الوراثة التوكسوبلازما ^14. ومع ذلك، ENU يستهدف بشكل تفضيلي AT أزواج قاعدة ^25، التي نحن في التحقق من صحة التوكسوبلازما. ومنذ تردد / T هو أقل من ذلك في تسلسل الأحماض الأمينية الترميز من تسلسل غير الترميز، وستكون الغالبية العظمى من الطفرات التي تحدثها ENU يكون في تسلسل غير الترميز. ومع ذلك، EMS عادة ما لديها تفضيل لأزواج قاعدة GC، والترميز أي تسلسل. والغالبية العظمى من درجة الحرارة حساسة الطفرات تنشأ في الطفرات-كودون المتغيرة، وهو سبب لاستخدام نظم الإدارة البيئية على ENU.

على الرغم من أن توصف مجموعة متنوعة من المحرضات الخروج مما اثار جوانب مختلفة من مسار الإشارات في الجدول رقم 1، وهناك عوامل صيدلانية أخرى معروفة للعمل على العمليات المطلوبة من أجل الخروج. على سبيل المثال، فقد تبين من الكافيين للحث على إفراز microneme في طفيليات خارج الخلية، وهو مطلوب لكلاالخروج والغزو ^7،26،27. ومع ذلك، لا يمكن أن الكافيين يمكن استخدامها لتحريك الخروج من الخلايا المضيفة المصابة، على الأرجح بسبب الكافيين لا منتشر بشكل فعال من خلال الخلية المضيفة تجاه الطفيليات يقيمون في مقصورة فجوي. وبالمثل، واحدة الزناد الخروج هو تراكم حمض الأبسيسيك، ولكن من المستحيل للكشف عن طفرات في هذا المسار منذ حمض الأبسيسيك لا تنتشر في الخلية المضيفة ^28. وكما هو مبين في الجدول رقم 1، و+-K ionophore nigericin هو محفز الخروج كفاءة ^5، ومع ذلك، طفيليات لا يعيش التحفيز nigericin. ولذلك هذا المركب هي أيضا ليست مناسبة للشاشة. في بديل، إجراء فحص أكثر تفصيلا عن المسوخ ionophore أفيد أن العديد من المسوخ مع تأخير في الخروج الناجم عن التعرض ionophore البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة خارج الخلية إلى ionophore ^11. ومع ذلك، تم عزل أي طفرات مقاومة للخروج ionophore الناجم عن الخروج في هذه الشاشة، مما يجعل من الظواهرأضعف. وهو في الوقت الحالي غير واضح ما إذا كان يمكن الحصول على المسوخ مع المقاومة إلى التعرض لفترات طويلة على الخروج محرضات أخرى.

منذ يبدو أن هناك مسارات متوازية عدة يمكن أن يؤدي إلى الخروج، فإن السؤال الذي يطرح نفسه هو إلى أي واحد سيكون الأكثر أهمية في وجود عدوى (التجريبية). يبدو أن يهاجم الجهاز المناعي على الخلية المصابة هي المشغل الرئيسي لخروج ^29. فمن الممكن استخدام هذه المشغلات في الشاشة متحولة. على سبيل المثال، يمكن أن CD8 خلايا تي من خلال تحفيز الخروج على حد سواء بوساطة من فاس وطريقا perforin بوساطة ^30. ولذلك، باستخدام فصل المقال معربا عن الإنسان خلايا تي باعتبارها الخلية المضيفة في شاشة الخروج، يمكن أن تسبب الخروج من حضانة مع جسم مضاد فاس المضادة للتخصيب عن طفرات في هذا المسار.

لرسم خريطة وراثية للالطفرات الكامنة وراء الظواهر الخروج، نهجين مختلفين تتوفر في التوكسوبلازما. وعلى عكس الكائنات نموذج الجيني، كلالفصل elic بواسطة المعبر ليس خيارا منذ لا يمكن إلا أن دورة الجنسي للطفيل يمكن تشغيلها في القناة الهضمية من القط. وبصرف النظر عن كون المسألة غير عملية، وضعف كفاءة هذه العملية، سلالات طفيلي نمت في المختبر بسرعة كبيرة تفقد القدرة على إصابة القطط. لتجاوز هذه المشكلة وقد وضعت فعال من النوع البري تكامل مكتبة cosmid النهج، الذي يكمل 90٪ من المسوخ انقسام الخلية ^18. (المقدمة مخطوطة فاريل، مارث، Gubbels وآخرون،) بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا مؤخرا الجينوم الكامل resequencing البروتوكولات لتحديد جميع الطفرات المستحثة في الجينوم. وعادة ما نحدد 20-70 النوكليوتيدات المفردة في المسوخ التي يسببها كيميائيا. بين هذين النهجين تمكنا من تحديد الطفرات المسببة في كل المسوخ التي يسببها كيميائيا تميزت حتى الآن.

أخذت معا، على الشاشة ووصف يوفر أداة مرنة من شأنها أن تسمح تشريح الوراثية إلى الأمام منوالخروج المسارات. نحن نتوقع هذا سيحدد العديد من مكونات المسار يشير تعرف أنها موجودة بناء على بيانات الدوائية، ولكن الذي لم يتسن تحديد أي الجينات مرشح جيد في الجينوم التوكسوبلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل علماء الرابطة الأمريكية 0635480N القلب منح التنمية والمعاهد الوطنية للصحة منحة بحثية AI081220. وتدعم الهيئة من قبل العين فرسان منحة مؤسسة أبحاث.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO₂ incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO₂, at 35, 37 and 40 °C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective
HBSSc (according to Black et al.¹¹):
98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588) 100 μl 1M MgCl₂ (100 mM end) 100 μl 1M CaCl₂ (100 mM end) 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) 84 mg NaHCO₃ (10 mM end)