Summary
קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של כמה
Abstract
נפוצה, מחייבים תאיים, protozoan הטפיל Toxoplasma gondii גורם למחלות אופורטוניסטית ב חיסונית שנפרצו חולים וגורם למומים מולדים עם זיהום מולד. מחזור שכפול ממס מתאפיינת בשלושה שלבים: 1. הפלישה פעיל של תא פונדקאי גרעיני: 2. שכפול בתוך התא המארח, 3. יציאה פעילה מן התא המארח. מנגנון של יציאה היא יותר ויותר להיות מוערך כתהליך, ייחודי פיקוח הדוק, אשר עדיין ממעטים להבין ברמה המולקולרית. מסלולי איתות יציאה בבסיס אופיינו באמצעות סוכני פרמקולוגיים הפועלים על היבטים שונים של מסלולים 1-5. לפיכך, גורמים עצמאיים שונים של יציאה זוהו שכל להתכנס על שחרורו של Ca 2 + תאיים, סימן שהוא גם קריטי עבור הפלישה התא המארח 6-8. תובנה זו הודיע הגן המועמד הגישה שהוביל identiאחת מהבעיות הנגזרות מהחלוקה של הצמח כמו סידן קינאז החלבון תלויה (CDPK) מעורב יציאה 9. בנוסף, פריצות הדרך האחרונות מספר יציאה הבנה נעשו באמצעות (כימי) גישות גנטיות 10-12. לשלב שפע של מידע תרופתי עם נגישות גנטי גדל והולך של Toxoplasma לנו לאחרונה הוקמה מסך המאפשר העשרה מוטציות טפיל עם פגם יציאה התא המארח 13. למרות mutagenesis כימי באמצעות N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) או אתיל methanesulfonate (EMS) שימש במשך עשרות שנים בחקר הביולוגיה Toxoplasma 11,14,15, רק לאחרונה יש מיפוי גנטי של מוטציות שבבסיס פנוטיפים הופכים לשגרה 16 -18. יתר על כן, על ידי יצירת מוטציות רגישות טמפרטורה, תהליכים חיוניים ניתן גזור ואת הגנים הבסיסיים מזוהה באופן ישיר. מוטציות אלה מתנהגים כמו wild-type תחת טמפרטורה מתירנית (35 ° C), אבל לא מצליחים עמ 'roliferate בטמפרטורת כובל (40 ° C) כתוצאה של מוטציה הנדון. כאן אנו להמחיש שיטה חדשה ההקרנה פנוטיפי לבודד מוטנטים עם פנוטיפ הטמפרטורה רגיש יציאה 13. האתגר עבור מסכי היציאה היא להפריד egressed מן הלא egressed טפילים, אשר מורכבת על ידי מהיר מחדש הפלישה הדביקות הכללי של טפילים לתאי המארח. מסך יציאה הוקמה בעבר היה מבוסס על סדרה של צעדים מסורבלת biotinylation להפריד בין תאיים טפילים תאיים 11. שיטה זו גם לא ליצור מוטנטים מותנים וכתוצאה מכך פנוטיפים חלשים. השיטה המתוארת כאן מתגבר מצורף חזקה של egressing טפילים על ידי הכללת מתחרה glycan, סולפט dextran (DS), המונע טפילים יידבקו אל התא המארח 19. יתר על כן, טפילים תאיים נהרגים במיוחד את ידי pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), מה שמשאיר טפילים תאייםללא פגע 20. לכן, עם מסך פנוטיפי חדש במיוחד לבודד מוטנטים טפיל עם פגמים יציאה יזומה, כוחה של הגנטיקה כעת ניתן לפרוס באופן מלא לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התא המארח יציאה.
Protocol
סקירה כללית
הפרוטוקולים ניתנים 1 להגדיר את המינון של mutagen שמוביל להרג 70% הטפילים (פרוטוקול 1). ההליך הבא ניתן להעשיר את מוטנטים היציאה המושרה מתוך מאגר הטפיל mutagenized (פרוטוקול 2, איור 2). זה מלווה בפרוטוקול לבדוק את השכיחות של מוטציות היציאה בבריכה מועשר, או כדי לאמת את הפנוטיפ יציאה ב מוטציות בודדות (פרוטוקול 3). לבסוף, פרוטוקול ניתן ליצור שיבוטים טפיל בודדים מאוכלוסיות מועשר על ידי הגבלת דילול (פרוטוקול 4).
1. טיטרציה של mutagen
היזהר מיוחד, כגון כפפות כפולות, כאשר עובדים עם חומרים ונוזלים מוטגניות ביותר. איסוף פסולת נוזלית בנפרד לסילוק נאות.
- לחסן T25 בתרבית רקמה צלוחיות confluent עם אדם פיברובלסטים העורלה (HFF) תאים עם 1 מ"ל של tachyzoites lysed טרי ולגדול 18-25 שעות ב 37 °; C מתחת 5% CO 2 במדיום Ed1 (D-MEM השלימו עם סרום חום מומת 1% שור עוברית, 0.2 מ"מ L-גלוטמין, 50 U / ml פניצילין, 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B ). ראה רוס ואחרים. לצמיחה התקשורת הכללית של תאים HFF וטפילים 21.
- החלף בינוני עם 10 מ"ל בינוני עוברית 0.1% בסרום שור (לדלל Ed1 1:10 ב D-MEM) ולהשאיר humidified ב 37 מעלות צלזיוס מתחת חממה CO 5% 2 (המכונה "37 מעלות צלזיוס חממה" מכאן והלאה) עבור 10 דקות .
- הוסף 0, 12.5, 25, 50 או 100 ENU μl (1 במלאי M ב DMSO) או EMS (1 במלאי M ב DMSO) לכל בקבוק (דילולים mutagen עבודה יהיה 1.25, 2.5, 5, 10 מ"מ, בהתאמה). הוסף DMSO ל μl 100 עבור כל בקבוק. דגירה של 4 שעות ב 37 ° C חממה.
- לשטוף שלוש פעמים למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר על ידי שטיפת monolayer עם 10 מ"ל קר PBS (לפני מקורר על 4 מעלות צלזיוס).
- הוסף 5 מ"ל PBS, לגרד את monolayer רופף עם שוטר גומי (תא SCRaper), להעביר את התאים באמצעות מחט השרוטות G 26.5 להסיר פיזית את הטפיל מן fibroblasts (קליפ את הפיר מחוץ מחט במספריים הכבדות שלא לחשוף את המחט), ועל מסנן עם 3.0 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון. קטעים מחט רבות יגביר את היעילות של שחרור טפילים מן התא המארח.
- ספור את ריכוז הטפיל באמצעות hemocytometer. בואו הטפילים להסתפק ב 5 דקות hemocytomer לפני הספירה.
- לדלל טפילים 10,000 טפילים לכל מ"ל 3 ב Ed1 (עבור 10 מ"ל 33,333 טפילים יש צורך).
- מחסן 1 גם בצלחת היטב עם 6 מ"ל 3 של טפילים מדולל (הכולל 10,000 טפילים). סדרתי לדלל את הטפילים של פי 10 על 3 בארות confluent 6-גם צלחת עם תאים HFF המכילים 2.7 מ"ל Ed1 ידי העברת 300 μl מתוך 1 גם כן. השאירו צלחות ללא הפרעה 37 ° C החממה למשך 7 ימים.
- Aspirate בינוני, לתקן 15 דקות עם 3 מ"ל / גם אתנול 100%, כתםעם 3 מ"ל / גם פתרון סגול קריסטל (12.5 גרם קריסטל סגול באתנול 125 מ"ל מעורבב עם 500 מ"ל אמוניום אוקסלט 1%) במשך 15 דקות, לשטוף עם 3 מ"ל / גם PBS (1 דקה) ואוויר יבש. כל בטמפרטורת החדר.
- ספירת לוחות ובחר ריכוז mutagen הדרושה להשגת ההישרדות של 30% של טפילים שנחשפו (70% להרוג מינון: ראה תרשים 1). המינון של הרג 70% נעשה שימוש מבחינה היסטורית 14 ו המושרה פחות מ -100 מוטציות נקודתיות בכל הגנום (פארל, מארת', Gubbels et al., הגיש כתב היד).
2. העשרה של מוטציות היציאה (איור 2)
- בצע mutagenesis כמתואר לעיל באמצעות המינון mutagen גרימת הרג 70%. לגדול האוכלוסייה mutagenized למעבר 1 בבקבוק חדש של תאים המארח.
- להדביק T25, HFF בקבוק confluent בתרבית רקמה עם 120,000 טפילים lysed טרי מן האוכלוסייה mutagenized ב 10 מ"ל Ed1. דגירה של 2 שעות 35 מעלות צלזיוס מתחת חממה CO 5%2 ו humidified (מ hereon בשם "35 מעלות צלזיוס חממה").
- Aspirate בינוני ולשטוף 10 שניות עם 10 מ"ל קר PBS ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל Ed1 בינוני בתוספת 25 מ"ג / מ"ל סולפט dextran (DS) 13. דגירה של 26 שעות ב 40 מעלות צלזיוס מתחת החממה 5% CO 2 ו humidified (מ hereon בשם "40 מעלות צלזיוס חממה").
- הכן פתרון העבודה של משפרי היציאה. לדלל את inducer יציאה של בחירה בריכוז עובד צינור פלקון 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל HBSSc השלימו עם DS 25 מ"ג / מ"ל. מראש את דילולים חמים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס waterbath. ראה לוח 1 על ריכוזי עובדים.
- Aspirate בינוני מן הטפיל נגועים צלוחיות ולהוסיף מחומם מראש inducer פתרון יציאה. דגירה של 37 ° C חממה על פי המצוין בלוח 1.
- Aspirate בינוני ולשטוף 10 שניות עם 10 מ"ל קר PBS ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל Ed1 השלימו עם 25 מ"ג / מ"ל ו - DS 50 מיקרומטר pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC: המודעהד 5 μl של צילומים של 100 מ"מ PDTC ב PBS) 13. דגירה 5 שעות ב 35 ° C חממה.
- Aspirate בינוני ולשטוף 10 שניות פעם אחת עם 10 מ"ל PBS (בטמפרטורת החדר) ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל Ed1 בינוני. לשים צלוחיות בחזרה 35 ° C חממה עד טפילים להרוס monolayer: צלוחיות לוחצים מדי יום. שחזור זה לוקח בערך 7 ימים.
3. אימות של פנוטיפים מוטנטים על ידי מבחני היציאה
לאחר ביצוע המסך העשרה התבגרות האוכלוסייה העשירה למעבר 1 בתאים HFF, פנוטיפים את צריכה להיות מאושרת על ידי assay יציאה 11,13. Assay זה אמור לשמש גם כדי לאמת את שיבוטים בודדים לאחר פרוטוקול 4.
- לחסן 20,000 טפילים לכל גם לתוך צלחת של 24 גם המכיל תאים HFF confluent גדל על coverslips (1 מ"ל Ed1 בינוני לכל טוב). דגירה 8 שעות ב 35 ° C חממה, שיועברו לאחר מכן 40 ° C בחממה במשך 24 שעות.
- לשטוף עם PBS 1 מ"ל / טוב (10 שניות בטמפרטורת החדר). הוסף 1 מ"ל inducers היציאה (כולל DMSO רק שליטה שלילי), לפני שהתחמם מדולל HBSSc ו דגירה לזמנים המתוארים בטבלה 1.
- Aspirate בינוני לתקן עם מ"ל 1 / גם מתנול 100% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- אם טפילים הוריות המבטאים חלבון autofluorescent שימשו mutagenesis, עבור לשלב 13 # 3.5. אם לא ניאון טפילים חלבון המבטאים שימשו בתור הורה, את כתם coverslips קבוע עם גרסאות, מהירה כתם 1 דקות בטמפרטורת החדר 11.
- לשטוף 5 דקות עם PBS 1 מ"ל / גם בצלחת 24 גם בטמפרטורת החדר.
- עבור טפילים חלבון פלואורסצנטי המבטאים: מהר לשטוף coverslip ב DDH 2 O (טבילה) ו הר בשקופיות תחת gelmount להגן על האות פלואורסצנטי. על הבדל מהירה טפילים מוכתמים, לשטוף 10 שניות באתנול 100% ולתת אוויר יבש לפני הרכבה בשקופית.
- באמצעות מיקרוסקופ (הקרינה) עם40-60x המטרה לספור את אחוז vacuoles egressed מול vacuoles שנשארו תאיים (ראה איור 4).
4. לשבט מוטציות היציאה על ידי הגבלת דילול
לאחר אימות של הפנוטיפ של האוכלוסייה מועשר יציאה מוטציה באמצעות פרוטוקול 3, האוכלוסייה polyclonal צריך לשכפל להשיג שיבוטים טפיל יחיד.
- ספירת האוכלוסייה הטפיל hemocytometer ו לדלל את ריכוז של 500 מ"ל לכל טפילים במדיום Ed1.
- בצלחת 384, המכיל גם monolayer confluent של תאים HFF, להחליף בינוני בינוני עם 40 μl / היטב Ed1 באמצעות pipet הרב ערוצית. כפי שמוצג באיור 5, ארבע אוכלוסיות polyclonal ניתן לשכפל לכל צלחת כדלקמן: pipet 40 μl / גם של מוטציה בדילול מלא 1 לתוך בארות C3-C12, מוטציה 2 לתוך בארות C13-C22, מוטציה 3 לתוך בארות H3-H12, ו מוטציה 4 אל בארות H13-H22 (נפח סוף בבארות כיום 80 μl). שימוש רב ערוצי, pipet pipet סולution למעלה ולמטה 5 פעמים, ולאחר מכן להעביר 40 μl לשורה מתחת לשורת ההתחלה (מ C ל D או שורה שורה H ל I). המשך אלה 2-לקפל דילולים סדרתיים דרך שורת G (מוטציות 1 ו -2) או שורה N (מוטנטים 3 ו -4). מחק μl תוספת 40 מהשורה האחרונה. דגירה של 35 ° C חממה 7-10 ימים מבלי להפריע את הצלחת.
- בדוק את הבארות על מיקרוסקופ הפוכה במטרה 10-20x נוכחות של פלאק בודדים, נראה כ 'חורים' בשכבה.
- פיק 4 בארות לכל מוטציה עם שלט אחד ולהעביר את הטפילים אל confluent תרבות בקבוק רקמה עם תאים HFF ומלא בינוני Ed1. לגדל את הטפילים בתוך 35 ° C חממה; לזעזע את צלוחיות היומי לפזר את הטפילים תאיים. בדרך כלל התהליך נמשך 7 ימים.
5. נציג תוצאות
ENU מוטאגנים ו EMS אינם יציבים כאשר הם מאוחסנים על פני תקופות זמן ארוכות. לכן, בדיקת כוח מוטגניות שלהמניות הוא קריטי כדי להשיג תוצאות לשחזור. תוצאות טיטרציה טיפוסי הקטל עקומות עבור שניהם ENU ו EMS מוצגות באיור 1. עם זאת, מומלץ לבצע מבחני פלאק לניסוי כל mutagenesis לוודא את המינון המתאים היה בשימוש. כדי לשמור על הגיוון באוכלוסייה טפיל mutagenized, חשוב להמשיך עם מסך מוטציה יציאה מהר ככל האפשר. בדרך כלל, 1 מעבר של טפילים לתוך הבקבוק החדש מתבצע על מנת לאפשר את הטפילים ששרדו להתאושש לפני הולך קדימה עם המסך. יש לזכור כי פעולה זו תגרום חלוקת מוטנטים את. לכן לא ניתן לשלול כי מוטציות משובטים רבים מבודדים לאחר סיום ההליך כולו מכילים בדיוק גנוטיפ זהה. כדי למנוע בידוד פעמים באותו מספר מוטנטים זה מומלץ לבודד רק מוטציה אחת לכל יציאה mutagenesis, אלא אם כן פנוטיפים שלהם (למשל היציאה דיפרנציאלי רגישויות inducer) הםשונים מאוד זה מזה. מצד שני, לא כל התוצאות המסך בידוד מוטנטים עם פנוטיפ הרצוי. בפרט 2 + Ca-ionophore A23187 פנוטיפ עמיד נדיר ודורש ניסויים mutagenesis מספר ומסכי לבודד מוטציה יציאה אחת. לכן מומלץ לבצע 5-10 mutagenesis וניסויים מסך במקביל.
כוח העשרה של המסך נבדק על ידי ערבוב מוטציה יציאה ידוע עם wild-type טפילים על יחסים שונים. תערובות אלה היו נתונים המסך לבין שכיחות הפנוטיפ של מוטציה באוכלוסייה מועשר הוערך. באמצעות wild-type טפילים המבטאים RFP cytoplasmic וקו מוטציה לבטא YFP cytoplasmic מקרים יכולים במהירות שתקבע cytometry הזרימה (איור 3) 13. התוצאות מראות כי פנוטיפים מוטנטים יכול להיות מועשר באופן שגרתי לטוהר 80% החל על ידי טפיל 1 יציאה מוטציה לכל p wild-type 10000arasites 13. עם זאת, כאשר מוטציה יציאה: wild-type תחילת יחס הטפיל הוא 1:100,000 הטפילים, אוכלוסיית מבודד רק 1-2% (1:100) מוטנטים היציאה. לכן הכוח העשרה של המסך הוא של פי 1000. מאז המסך מתחיל עם חיסון של 120,000 טפילים, אשר בדרך כלל 70% הן בנות קיימא, אנו בדרך כלל לבצע שני סבבים של העשרה. הטפילים בודדים הם גדלו בין סיבובים העשרה. הליך זה מביא אוכלוסייה מוטציה 100% גם כאשר החל 1:1,000,000 היציאה מוטציה: wild-type טפילים.
Assay יציאה לאמת ולאפיין את פנוטיפים מחייבת ריבוי של זיהום התא המארח המאפשר בידול של vacuoles בודדים. זה קריטי במיוחד כאשר מנתחים מצבים עם אחוזים גבוהים של יציאה כמו טפילים בודדים פזורים סביב. כפי שניתן לראות בתרשים 4, אם אוכלוסיות egressed לא מופרדים היטב קל לזלזל אחוזשל יציאה ידי ספירת שני vacuoles egressed כמו vacuole 1. מאז יציאה ופלישה הם תהליכים הקשורים, וכמה הטמפרטורה רגישים פנוטיפים להציג פנוטיפ קלה בטמפ 'נמוכה יותר, לא תהיה כל מוטציות יעילות הפלישה דומים. מוטציות כאלה כן יש מחוסן בכמה מינונים גבוהים יותר לקפל להשיג צפיפות גבוהה vacuole מספיק הערכה מדויקת של הפנוטיפ יציאה שלהם. יתר על כן, כמה inducers היציאה לא יעילה לעורר יציאה של vacuoles המכילים ארבעה טפילים או פחות. לפיכך, חשוב כי vacuoles להכיל שמונה טפילים או יותר, כאשר החל assay יציאה. במעבדה שלנו אנו מוטציות מסך בודד עם יציאה מסוימת משפר נגד משפרי היציאה אחרים. על ידי פרופיל שלהם חוצה תגובתיות מוטנטים יכולים להיות מקובצים בכיתות שונות. לבסוף, לא כל מוטציות היציאה תהיה הטמפרטורה רגיש. בשנת מוטציות מסוימות מבודדים עם inducers היציאה מפעילה צעדים לפני שחרורו של intracellular Ca 2 + מועדים שאינם טמפרטורה פנוטיפים רגישים. זאת בשל מסלולים מקבילים שיכולים להוביל היציאה והכניסה לפני האות מתכנסת על שחרורו של Ca 2 + תאיים.
באיור 1. Mutagen טיטרציה כימית במינון. מבחני א הרובד הופיעה צלחת 6-גם באמצעות ריכוזים שונים EMS ו מספרים שונים של טפילים בכל טוב כפי שצויין. כתמים לבנים הם הפלאק טפיל שנוצרו בשכבה HFF. ב ', ג עקומות ההישרדות של טפילים בעת החשיפה במינונים שונים של EMS (ב') ENU (C). הישרדות הוערך על ידי מבחני פלאק. המינון גרימת הרג 70% נבחר לניסויים mutagenesis. ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים + / - סטיית התקן מוצגים.
איור 3. העשרה אופיינית של פנוטיפים מוטנטים היציאה. תוצאות העשרת מוטציה יציאה מעורב לתוך wild-type טפילים על יחסים שונים (ציר x). אחוז פנוטיפים מוטנטים היציאה באוכלוסייה גדל אחרי המסך הוא זמם על ציר ה-Y ו הוערך על ידי cytometry זרימה (טפילים מוטציה היציאה הביע YFP cytoplasmic, wild-type טפילים הביע סייtoplasmic RFP). תוצאות של שלושה ניסויים בלתי תלויים מיוצגים על ידי נקודות נתונים אדום, כחול וירוק. שאומצה מ Eidell et al. 13.
באיור 4. תוצאות אופייניות של assay יציאה. כמה חצים. לציון ארבע vacuoles שלמים שונים המכילים טפילים 4-8. ב. החצים מסמנים ארבע קבוצות של טפילים מפוזרים המשקפות ארבע vacuoles egressed עצמאיים. היציאה היה המושרה על ידי A23187 (ב) או DMSO כביקורת שלילית (). טפילים להביע YFP cytoplasmic 22.
איור 5. דילול סדרתי עבור קווי טפיל משובט. ארבע אוכלוסיות polyclonal (אדום, כחול, צהוב, ירוק) הם בדילול סדרתי confluent ב 384 גם אחד צלחת עם תאים HFF. בשורה C ואני מקבל 10 טפילים לכל טובהם פי 2 בדילול מלא (40 + μl 40 μl) עד שורות H ו-N, בהתאמה. גוון של אפור מציין את מספר קטן והולך של טפילים בכל טוב. בדרך כלל, שיבוטים בודדים נמצאים בשורות DF ו JL.
| תרכובת | מניות | עבודה ריכוז | μl הדרוש T25 (10 מ"ל) | זמן הדגירה (דקות) |
| DTT | 1 M ב DMSO | 5 מ"מ | 50 | 15 |
| אתנול | 190 הוכחת | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | 2 מ"מ DMSO | 1 מיקרומטר | 5 | 5 |
| nigericin * | 2 מ"מ DMSO | 10 מיקרומטר | 50 | 30 |
* Nigericin לא ניתן להשתמש להעשרתמסך ment כמו הטפילים אינם שורדים גירוי nigericin, רק משתמשים nigericin באימות של מוטציות היציאה.
1. לוח יציאה inducers המשמשים נהלים. למהול ב 10 מ"ל HBBSc המכיל 25 מ"ג / מ"ל DS של המסך, או לא DS עבור אימות מוטציה (assay יציאה). כל תרכובות של Sigma-Aldrich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול תיאר מספק שיטה יעילה לבודד מוטנטים Toxoplasma עם מום יציאה. אנחנו מבודדים בהצלחה מוטציות לאורך השלבים השונים של מסלול יציאה, שחלקם יש פנוטיפ הפלישה כפול 13. השפעה על הפלישה ניתן לקבוע באמצעות מה שמכונה אדום ירוק assay, אשר מבדיל בין פלש ללא פלש טפילים ידי מכתים ההפרש נוגדנים 23,24. עבור שני מבחני הפלישה יציאה זה יכול להיות נוח להביע את הסמן חלבון autofluorescent בציטופלסמה של טפילים 13,22. עם זאת, אם להיות טפילים mutagenized כבר לבטא חלבון פלואורסצנטי זה יכול להפריע אפיון פנוטיפי נוסף על ידי immunofluorescence בהמשך. תמיד אפשר להוסיף סמן ניאון כדי מוטציה לאחר בידודה. כפי שתואר, פשוט, ללא ניאון חלופית היא גרסאות, מהירה מכתים על יציאה.
t "> מבחינה היסטורית, ENU mutagen הוחל על גנטיקה Toxoplasma 14. עם זאת, ENU מעדיפים מטרות AT 25 זוגות בסיסים, אשר אנו תוקף Toxoplasma (פארל, מארת', Gubbels et al. הגיש כתב היד). מאז בתדירות של / T הוא נמוך רצף החומצות האמיניות קידוד מאשר רצף אי קידוד, רוב המוטציות המושרה על ידי ENU יהיה ברצף, ללא קידוד. עם זאת, EMS בדרך כלל יש העדפה זוגות בסיסים-GC, כלומר קידוד רצפים. הרוב המכריע של הטמפרטורה רגישים המוטציות שמקורן ב קודון משתנים מוטציות, וזו הסיבה להשתמש EMS על ENU.למרות מגוון inducers היציאה מפעילה היבטים שונים של מסלול איתות מתוארים בטבלה 1, יש סוכני פרמקולוגיים אחרים הידועים לפעול על ההליכים הנדרשים יציאה. כך, למשל, קפאין הוכח לגרום הפרשת microneme ב תאיים טפילים, אשר נדרש עבור שניהםיציאה ופלישה 7,26,27. עם זאת, קפאין לא ניתן להשתמש בהם כדי לעורר יציאה מן התאים הנגועים המארחות, סביר להניח כי קפאין אינו מפוזר באופן יעיל דרך התא המארח כלפי טפילים הנמצאים בתא vacuolar. באופן דומה, 1 יציאה ההדק היא הצטברות של חומצה abscisic, אך לא ניתן למסך על מוטציות במסלול זה מאז חומצה abscisic לא לפזר את התא המארח 28. ו כפי שצויין בטבלה 1, + K-ionophore nigericin הוא inducer יציאה יעיל 5, לעומת זאת, טפילים אינם שורדים גירוי nigericin. לכן המתחם הזה הוא גם לא מתאים המסך. בהליך, חלופה מיון משוכלל יותר מוטציות ionophore נמסר כי מוטציות רבות עם עיכוב יציאה יזומה ionophore לשרוד חשיפה ממושכת תאי ionophore 11. עם זאת, מוטציות לא היציאה עמידים ionophore יציאה יזומה בודדו במסך זה, מה שהופך את פנוטיפיםחלש יותר. זה כרגע לא ברור אם מוטנטים עם התנגדות חשיפה ממושכת inducers היציאה אחרים ניתן להשיג.
מאז נראה כי מסלולים מקבילים שיכולות להוביל יציאה, עולה השאלה לגבי איזה מהם יהיה רלוונטי ביותר לזיהום (ניסיוני). נראה כי התקפות של המערכת החיסונית כנגד תאים הנגועים על ההדק העיקרי של יציאה 29. ניתן להשתמש גורמים כאלה במסך מוטציה. למשל, CD8 T-תאים יכול לעורר יציאה דרך הן בתיווך-פאס ואת מסלול perforin בתיווך 30. לכן, באמצעות FasL ביטוי אנושי מתאי T כמו התא המארח במסך יציאה, יציאה יכול להיות מופעלות על ידי הדגרה עם נוגדן נגד פאס להעשיר עבור מוטציות במסלול זה.
כדי למפות את המוטציות גנטית שבבסיס פנוטיפים היציאה, שתי גישות שונות זמינים Toxoplasma. שלא כמו אורגניזמים מודל גנטי, כלהפרדה על ידי elic המעבר הוא לא אופציה מאז המחזור המיני של הטפיל יכול רק להיות מופעלות במעיים של החתול. מלבד מעשיות ויעילות הירודה של תהליך זה, זני הטפיל הגדלים במעבדה מהר מאוד מאבדים את היכולת להדביק חתולים. כדי לעקוף בעיה זו יעילה wild-type הגישה cosmid השלמה ספריית פותחה, אשר השלים 90% של חלוקת תאים מוטנטים 18. כמו כן, הקמנו לאחרונה הגנום המלא resequencing פרוטוקולים לזהות את כל מוטציות בגנום הנגרמת (פארל, מארת', Gubbels et al. הגיש כתב היד). בדרך כלל אנו מזהים 20-70 פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד של מוטנטים שנוצר באופן כימי. בין שתי הגישות האלה הצלחנו לזהות את המוטציה סיבתי בכל מוטנטים שנוצר באופן כימי, שאפיינו עד כה.
יחדיו, תיאר את המסך מספק כלי צדדי שיאפשר לנתיחה הגנטי של קדימהאת היציאה המסלולים. אנו מצפים יהיה לזהות מרכיבים שונים של מסלול איתות ידוע להתקיים על בסיס נתונים תרופתי, אבל עבורו אין גנים מועמדים טובים אפשר היה לזהות בגנום Toxoplasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי איגוד הלב האמריקני המדען פיתוח גרנט 0635480N ואת המכונים הלאומיים לבריאות מענק מחקר AI081220. BIC נתמך על ידי קרן עין האבירים הטמפלרים מענק מחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
|||
|
|||
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
