Summary
आगे आनुवंशिकी कैसे आणविक स्तर जानने के लिए एक शक्तिशाली विधि है
Protocol
अवलोकन
प्रोटोकॉल के लिए पहले परजीवी के एक 70% की हत्या (1 प्रोटोकॉल) के लिए अग्रणी उत्परिवर्तजन की खुराक को परिभाषित करने के लिए प्रदान की जाती हैं. अगले प्रक्रिया एक mutagenized परजीवी पूल (2 प्रोटोकॉल, चित्रा 2) से प्रेरित निकास म्यूटेंट को समृद्ध करने के लिए प्रदान की जाती है. यह एक समृद्ध पूल में बाहर निकलना म्यूटेंट की घटनाओं का परीक्षण करने के लिए, या व्यक्ति म्यूटेंट में बाहर निकलना phenotype (3 प्रोटोकॉल) को मान्य प्रोटोकॉल के द्वारा पीछा किया जाता है. अंत में, एक प्रोटोकॉल समृद्ध आबादी से मन्दन (4 प्रोटोकॉल) सीमित द्वारा एक परजीवी क्लोन उत्पन्न करने के लिए प्रदान की जाती है.
1. उत्परिवर्तजन के अनुमापन
डबल दस्ताने के रूप में विशेष सावधानी, का उपयोग जब अत्यधिक mutagenic यौगिकों और तरल पदार्थ के साथ काम. तरल अपशिष्ट उचित निपटान के लिए अलग से ले लीजिए.
- T25 ऊतक संस्कृति मानव हौसले lysed tachyzoites के 1 मिलीग्राम के साथ चमड़ी fibroblast कोशिकाओं (HFF) के साथ मिला हुआ बोतल टीका लगाना और 37 में 18-25 घंटा बढ़ने °, सी 5 के तहत% मध्यम Ed1 (डी सदस्य 1% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.2 मिमी एल glutamine, 50 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, में स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 / μg मिलीलीटर, और 0.25 μg / मिलीलीटर Amphotericin है बी के साथ पूरक में सीओ 2 ). Roos एट अल देखें. सामान्य HFF कोशिकाओं और 21 परजीवी के विकास और मीडिया के लिए.
- 10 मिलीलीटर 0.1% भ्रूण गोजातीय सीरम (जलमिश्रित Ed1 डी सदस्य 1:10) और 10 मिनट के लिए मध्यम 5% सीओ 2 के तहत humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़ (यहाँ से "37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर" कहा जाता है) के साथ मध्यम बदलें .
- कुप्पी प्रति 0, 12.5, 25, 50, या 100 μl ENU (DMSO में 1 स्टॉक एम) या ईएमएस (DMSO में 1 स्टॉक एम) जोड़ें (उत्परिवर्तजन काम dilutions के 1.25, 2.5 जाएगा, 5, और 10 मिमी, क्रमशः). प्रत्येक कुप्पी के लिए 100 μl DMSO जोड़ें. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं.
- कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस (डिग्री सेल्सियस 4 पर पूर्व - ठंडा) के साथ monolayer rinsing के द्वारा तीन बार धो लें.
- 5 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें करने के लिए, एक रबर पुलिसकर्मी (सेल scr के साथ ढीला monolayer परिमार्जन) कोल, एक 26.5 जी सुई के माध्यम से scraped है कोशिकाओं को पारित करने के लिए शारीरिक रूप से fibroblasts (भारी शुल्क कैंची के साथ सुई बाहर शाफ्ट क्लिप के लिए सुई का खुलासा नहीं) से परजीवी को हटाने, और 3.0 माइक्रोन polycarbonate के फिल्टर के साथ फिल्टर. एकाधिक सुई मार्ग मेजबान कोशिका से परजीवी को रिहा करने की दक्षता में वृद्धि होगी.
- परजीवी एक hemocytometer का उपयोग एकाग्रता गिनती. परजीवियों गिनती से पहले hemocytomer में 5 मिनट के लिए व्यवस्थित.
- Ed1 में 10,000 3 मिलीग्राम प्रति परजीवी (के लिए 10 मिलीलीटर 33,333 परजीवी की जरूरत है) के लिए परजीवी पतला.
- एक अच्छी तरह से पतला परजीवी (10,000 परजीवी युक्त) के 3 मिलीग्राम के साथ एक अच्छी तरह से थाली 6 में टीका लगाना. Serially परजीवी एक 6 HFF μl 300 अच्छी तरह से पहले से बाहर स्थानांतरित करके 2.7 Ed1 मिलीलीटर युक्त कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से थाली सहधारा में 3 कुओं से अधिक 10 गुना पतला है. 7 दिनों के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में undisturbed प्लेट छोड़ो.
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन), 3 मिलीग्राम के साथ 15 मिनट / अच्छी तरह से 100% इथेनॉल ठीक करने के लिए, दाग/ 3 मिलीग्राम के साथ ही क्रिस्टल बैंगनी समाधान (125 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर 1% अमोनियम oxalate के साथ मिश्रित इथेनॉल में 12.5 छ क्रिस्टल बैंगनी) 15 मिनट के लिए, 3 मिलीग्राम के साथ / अच्छी तरह कुल्ला पीबीएस (1 मिनट) और शुष्क हवा. कमरे के तापमान पर सभी.
- सजीले टुकड़े गिनती और चयन उत्परिवर्तजन की एकाग्रता उजागर परजीवी (70% खुराक हत्या: चित्रा 1 देखें) के 30% के अस्तित्व को प्राप्त करने की जरूरत है. 70% की हत्या की एक खुराक 14 ऐतिहासिक इस्तेमाल किया गया है और कम से कम 100 जीनोम प्रति बिंदु उत्परिवर्तन (Farrell, Marth, Gubbels एट अल., पांडुलिपि प्रस्तुत) प्रेरित किया.
2. निकास म्यूटेंट के संवर्धन (चित्रा 2)
- Mutagenesis के प्रदर्शन करना उत्परिवर्तजन 70% की हत्या उत्प्रेरण खुराक का उपयोग करके उपरोक्त वर्णित के रूप में. Mutagenized जनसंख्या मेजबान कोशिकाओं की एक नई कुप्पी में एक मार्ग के लिए आगे बढ़ें.
- 120.000 हौसले से 10 Ed1 मिलीलीटर में lysed एक mutagenized आबादी से परजीवी के साथ T25, HFF सहधारा टिशू कल्चर कुप्पी संक्रमित. 5% सीओ के तहत एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए सेते हैं2 और humidified (hereon से "35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर" कहा जाता है).
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ 10 सेकंड कुल्ला और फिर 10 मिलीलीटर Ed1 25 मिलीग्राम / मिलीग्राम dextran सल्फेट 13 (डी एस) के साथ पूरक मध्यम जोड़ें. 5% सीओ 2 और humidified (hereon से "° 40 सी इनक्यूबेटर" कहा जाता है) के तहत एक 40 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 26 घंटे के लिए सेते हैं.
- निकास enhancers के समाधान तैयार. एक 15 मिलीलीटर फाल्कन 10 मिलीलीटर HBSSc 25 मिलीग्राम / एमएल डी एस के साथ पूरक युक्त ट्यूब में काम कर रहे एकाग्रता में चुनाव के निकास inducer के पतला. पूर्व गर्म dilutions के एक 37 डिग्री सेल्सियस waterbath में 30 मिनट के लिए. काम सांद्रता के लिए देखें तालिका 1.
- परजीवी संक्रमित बोतल से मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और पूर्व गर्म निकास inducer के समाधान जोड़ें. तालिका 1 में दर्शाए गए समय के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में सेते हैं.
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ 10 सेकंड कुल्ला और फिर 10 Ed1 मिलीग्राम 25 मिलीग्राम / एमएल डी एस और 50 माइक्रोन pyrrolidine Dithiocarbamate साथ पूरक जोड़ने (PDTC: विज्ञापनपीबीएस में 100 मिमी PDTC स्टॉक 5 μl) 13. एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 घंटे सेते हैं.
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 10 सेकंड 10 मिलीलीटर पीबीएस (कमरे के तापमान) के साथ एक बार कुल्ला और फिर 10 मिलीलीटर Ed1 मध्यम जोड़ें. हिला बोतल दैनिक: बोतल वापस 35 ° सी इनक्यूबेटर में जब तक परजीवी monolayer नष्ट कर रखो. यह वसूली 7 दिनों के चारों ओर ले जाता है.
3. उत्परिवर्ती phenotypes का निकास assays के द्वारा मान्यकरण
संवर्धन स्क्रीन प्रदर्शन और HFF कोशिकाओं में एक मार्ग के लिए समृद्ध आबादी बढ़ रही के बाद, phenotypes निकास 11,13 परख द्वारा पुष्टि की जरूरत है. यह परख भी 4 प्रोटोकॉल के बाद एक क्लोन मान्य किया जाना चाहिए.
- 24 अच्छी तरह से मिला हुआ HFF (1 अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर Ed1 मध्यम) coverslips पर विकसित कोशिकाओं से युक्त थाली में अच्छी तरह से प्रति 20,000 परजीवी टीका लगाना. एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 8 बजे सेते हैं तो 24 घंटे के लिए एक 40 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित.
- 1 / एमएल अच्छी तरह से पीबीएस (1 के साथ धो डालेंकमरे के तापमान पर 0 सेकंड). 1 मिलीग्राम (DMSO के केवल नकारात्मक नियंत्रण शामिल है) बाहर निकलना inducers, पूर्व गर्म और HBSSc में पतला और तालिका 1 में वर्णित समय के लिए सेते हैं जोड़ें.
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और 1 मिलीग्राम / कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अच्छी तरह से 100% मेथनॉल के साथ तय.
- यदि माता पिता एक autofluorescent प्रोटीन व्यक्त परजीवी mutagenesis के लिए इस्तेमाल किया गया, # 13 3.5 कदम आगे बढ़ना. यदि गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त परजीवी पेरेंट पंक्ति के रूप में इस्तेमाल किया गया है, फर्क त्वरित कमरे के तापमान पर 11 1 मिनट के लिए दाग के साथ निश्चित coverslips दाग.
- 1 / एमएल अच्छी तरह से पीबीएस के साथ कमरे के तापमान पर 24 अच्छी तरह से थाली में 5 मिनट धो लें.
- फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त परजीवी के लिए: जल्दी से DDH 2 हे (ग़रक़ी) में coverslip कुल्ला और gelmount के तहत स्लाइड पर माउंट करने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत की रक्षा. फर्क त्वरित दाग परजीवी के लिए, 100% इथेनॉल में 10 सेकंड धोने और स्लाइड पर बढ़ते से पहले हवा शुष्क करते हैं.
- एक के साथ एक खुर्दबीन (प्रतिदीप्ति)गिनती 40-60x उद्देश्य vacuoles का प्रतिशत बनाम egressed vacuoles कि intracellular रुके (देखें चित्रा 4).
4. कमजोर पड़ने सीमित निकास म्यूटेंट क्लोन
समृद्ध निकास उत्परिवर्ती 3 प्रोटोकॉल का उपयोग कर जनसंख्या के phenotype के सत्यापन के बाद, पॉलीक्लोनल आबादी के लिए एकल परजीवी क्लोन को प्राप्त करने के क्लोन किये जाने की जरूरत है.
- परजीवी जनसंख्या hemocytometer में गिनती और मध्यम Ed1 में 500 मिलीग्राम प्रति परजीवी के एक एकाग्रता के लिए पतला.
- एक साथ 384 से अच्छी तरह से HFF कोशिकाओं के साथ - साथ बहने वाला monolayer युक्त थाली में, 40 μl / अच्छी तरह से Ed1 pipet मल्टी चैनल का उपयोग कर के माध्यम से मध्यम की जगह. Pipet 40 μl / C3-C12 कुओं, कुओं में 2 उत्परिवर्ती C13-C22, H3-H12 के कुओं में 3 उत्परिवर्ती, और उत्परिवर्ती में अच्छी तरह पतला उत्परिवर्ती की 1 के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है, चार पॉलीक्लोनल आबादी प्लेट प्रति क्लोन किया जा सकता है: H13 - H22 कुओं में 4 (कुओं में अंत मात्रा अब 80 μl है). Pipet बहु चैनल pipet, का उपयोग करना पution और 5 बार नीचे तो शुरू पंक्ति नीचे पंक्ति (पंक्ति सी डी या पंक्ति एच मैं करने के लिए) के लिए 40 μl हस्तांतरण. पंक्ति जी (1 म्यूटेंट और 2) या पंक्ति N (म्यूटेंट 3 और 4) के माध्यम से इन 2 गुना धारावाहिक dilutions के लिए आगे बढ़ें. अंतिम पंक्ति से अतिरिक्त 40 μl त्यागें. 7-10 दिनों के लिए एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली परेशान बिना सेते हैं.
- एकल सजीले टुकड़े की उपस्थिति के लिए एक 10-20x उद्देश्य monolayer में 'छेद' के रूप में दिखाई के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर कुओं की जाँच करें.
- एक पट्टिका के साथ उत्परिवर्ती प्रति 4 कुओं उठाओ और HFF कोशिकाओं के साथ एक टिशू कल्चर फ्लास्क सहधारा में परजीवी हस्तांतरण और Ed1 मध्यम से भरा है. परजीवी आगे बढ़ें एक 35 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में, बाह्य परजीवी फैलाने दैनिक बोतल हिला. यह आमतौर पर 7 दिन लगते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
से उत्परिवर्तजन ENU और ईएमएस स्थिर जब समय की लंबी अवधि में संग्रहीत नहीं कर रहे हैं. इसलिए, की mutagenic शक्ति परीक्षणशेयरों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. ठेठ अनुमापन परिणाम और दोनों ENU और ईएमएस के लिए घटता हत्या चित्र 1 में दिखाया जाता है. हालांकि, यह पता लगाने के लिए कि उचित खुराक इस्तेमाल किया गया था हर mutagenesis के प्रयोग के लिए पट्टिका assays के प्रदर्शन की सिफारिश की है. को mutagenized परजीवी जनसंख्या में विविधता बनाए रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के निकास उत्परिवर्ती स्क्रीन के साथ के रूप में संभव के रूप में तेजी से आगे बढ़ना. आमतौर पर, एक नई कुप्पी में एक परजीवी के पारित होने के लिए जीवित परजीवी स्क्रीन के साथ आगे जाने से पहले ठीक करने के लिए किया जाता है. यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि ऐसा करने म्यूटेंट के विभाजन में परिणाम देगा. इसलिए यह है कि पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के बाद कई प्रतिरूप अलग म्यूटेंट वास्तव में एक ही जीनोटाइप होते बाहर नहीं किया जा सकता है. अलग वही उत्परिवर्ती कई बार यह mutagenesis के प्रति केवल एक ही निकास उत्परिवर्ती को अलग करने की सिफारिश की है, जब तक उनके phenotypes (जैसे अंतर निकास inducer संवेदनशीलता) से बचनेएक दूसरे से बहुत अलग है. दूसरी ओर, वांछित phenotype के साथ म्यूटेंट के अलगाव में स्क्रीन नहीं हर परिणाम है. विशेष रूप से Ca 2 + ionophore A23187 प्रतिरोधी फेनोटाइप दुर्लभ है और कई mutagenesis के प्रयोगों और स्क्रीन की आवश्यकता के लिए एक एकल निकास उत्परिवर्ती अलग. इसलिए यह समानांतर में 5-10 mutagenesis के और स्क्रीन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है.
स्क्रीन के संवर्धन की शक्ति अलग अनुपात में जंगली प्रकार के परजीवी के साथ एक ज्ञात बाहर निकलना उत्परिवर्ती मिश्रण द्वारा परीक्षण किया गया था. इन घोला जा सकता है स्क्रीन के अधीन थे और समृद्ध आबादी में उत्परिवर्ती phenotype की घटनाओं का आकलन किया गया था. जंगली प्रकार cytoplasmic आरएफपी व्यक्त परजीवी और एक उत्परिवर्ती लाइन का उपयोग cytoplasmic YFP व्यक्त करके घटनाओं को जल्दी से प्रवाह (चित्रा 3) 13 cytometry द्वारा स्थापित किया जा सकता है. परिणाम बताते हैं कि उत्परिवर्ती phenotypes नियमित १०००० पी जंगली प्रकार प्रति 1 निकास उत्परिवर्ती परजीवी के साथ शुरू द्वारा किया जा सकता है 80% शुद्धता को समृद्ध13 arasites. हालांकि, जब बाहर निकलना उत्परिवर्ती: जंगली प्रकार के परजीवी शुरू अनुपात 1:100,000 परजीवी है, अलग जनसंख्या केवल 1-2% है (1:100) निकास म्यूटेंट. इसलिए स्क्रीन के संवर्धन शक्ति 1000 गुना है. चूंकि स्क्रीन 120.000 परजीवी, जो आम तौर पर 70% व्यवहार्य हैं की टीका के साथ शुरू होता है, हम आम तौर पर संवर्धन के दो राउंड प्रदर्शन. अलग परजीवी के संवर्धन के दौर के बीच हो रहे हैं. यह प्रक्रिया एक 100% उत्परिवर्ती आबादी की ओर जाता है तब भी जब 1:1,000,000 निकास उत्परिवर्ती के साथ शुरू: जंगली प्रकार के परजीवी.
निकास के लिए मान्य है और phenotypes विशेषताएँ परख मेजबान सेल संक्रमण है कि व्यक्ति vacuoles के भेदभाव की अनुमति देता है की बहुलता की आवश्यकता है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब निकास के उच्च प्रतिशत के साथ स्थितियों का विश्लेषण व्यक्ति परजीवी के रूप में चारों ओर बिखरे हुए हैं. के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, अगर egressed आबादी अच्छी तरह से अलग नहीं कर रहे हैं यह आसान है प्रतिशत बहुत मूल्यवान समझनाएक कोटर के रूप में दो egressed vacuoles गिनती से बाहर निकलना. के बाद से बाहर निकलना और आक्रमण की प्रक्रिया से संबंधित हैं, और कुछ के प्रति संवेदनशील तापमान phenotypes कम तापमान पर एक हल्के फेनोटाइप प्रदर्शन, नहीं सभी म्यूटेंट समान आक्रमण क्षमता होगा. इस तरह के म्यूटेंट इसलिए कई गुना उच्च dosages में टीका किया जाना चाहिए करने के लिए अपने निकास phenotype की एक सटीक आकलन के लिए एक उच्च पर्याप्त रिक्तिका घनत्व प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, कुछ बाहर निकलना inducers कुशलता से कम चार या परजीवी युक्त vacuoles की निकास उत्तेजित नहीं करते. जैसे, यह महत्वपूर्ण है कि vacuoles आठ या उससे अधिक परजीवी होते जब निकास परख शुरू. हमारी प्रयोगशाला में हम स्क्रीन म्यूटेंट अन्य निकास enhancers के खिलाफ एक विशेष निकास बढ़ाने के साथ अलग. उनके पार से जेट की रूपरेखा के द्वारा म्यूटेंट अलग अलग वर्गों में बांटा जा सकता है. अन्त में, सभी बाहर निकलना नहीं म्यूटेंट तापमान के प्रति संवेदनशील हो जाएगा. विशेष निकास inducers intracellula की रिलीज से पहले कदम ट्रिगर के साथ अलग म्यूटेंटr 2 Ca + गैर तापमान संवेदनशील phenotypes के लिए प्रवण हैं. यह समानांतर मार्ग है कि निकास से पहले संकेत intracellular + 2 सीए की रिहाई पर converges नेतृत्व कर सकते हैं के कारण है.
आकृति 1. रासायनिक उत्परिवर्तजन खुराक टाइट्रेट करना. ए फलक assays एक 6 अच्छी तरह से विभिन्न सांद्रता ईएमएस और अच्छी तरह के रूप में संकेत प्रति परजीवी के विभिन्न संख्या का उपयोग कर प्लेट में प्रदर्शन किया. सफेद धब्बे परजीवी HFF monolayer में गठित सजीले टुकड़े हैं. बी, सी. ईएमएस (बी) और ENU (सी) के विभिन्न dosages के लिए जोखिम पर परजीवी की जीवन रक्षा घटता. जीवन रक्षा पट्टिका assays के द्वारा मूल्यांकन किया गया था. 70% की हत्या उत्प्रेरण खुराक mutagenesis प्रयोगों के लिए चुना है. तीन स्वतंत्र प्रयोगों की औसत + / - मानक विचलन दिखाए जाते हैं.
चित्रा 3. निकास उत्परिवर्ती phenotypes की ठेठ संवर्धन एक निकास विभिन्न अनुपात (x-अक्ष) पर जंगली प्रकार के परजीवी में मिश्रित उत्परिवर्ती के संवर्धन परिणाम. स्क्रीन के बाद हो आबादी में बाहर निकलना उत्परिवर्ती phenotypes का प्रतिशत y-अक्ष पर प्लॉट किए जाते है और प्रवाह cytometry (निकास उत्परिवर्ती परजीवी cytoplasmic YFP द्वारा मूल्यांकन किया गया था, जंगली प्रकार के परजीवी cy व्यक्तआरएफपी toplasmic). तीन स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम लाल, नीले और हरे रंग के डेटा बिंदुओं के द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Eidell एट अल से अपनाया 13.
चित्रा 4. एक निकास परख के ठेठ परिणाम है. एक तीर चार अलग अलग बरकरार 4-8 परजीवी युक्त vacuoles निशान बी. तीर बिखरे हुए चार स्वतंत्र vacuoles egressed के को दर्शाती है परजीवी की चार समूहों के निशान. निकास A23187 (बी) या DMSO के द्वारा एक नकारात्मक नियंत्रण (ए) के रूप में प्रेरित किया गया था. परजीवियों cytoplasmic 22 YFP व्यक्त करते हैं.
चित्रा 5. Clonal परजीवी लाइनों चार पॉलीक्लोनल आबादी (लाल, नीला, पीला, हरा) के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने serially HFF कोशिकाओं के साथ एक एकल 384 अच्छी तरह से थाली सहधारा में पतला कर रहे हैं. पंक्ति सी और मैं 10 परजीवी के प्रति अच्छी तरह से प्राप्त करते हैं औरपतला पंक्तियों एच और एन, क्रमशः जब तक 2 गुना (40 + μl 40 μl). ग्रे की छाया में अच्छी तरह से प्रति परजीवी की कम संख्या को इंगित करता है. आमतौर पर, एकल क्लोन पंक्तियों लोमो और जीएल में पाए जाते हैं.
| यौगिक | स्टॉक | कार्य एकाग्रता | μl T25 (10 मिलीग्राम) के लिए की जरूरत | ऊष्मायन समय (मिनट) |
| डीटीटी | 1 DMSO के एम | 5 मिमी | 50 | 15 |
| इथेनॉल | 190 सबूत | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | DMSO में 2 मिमी | एक माइक्रोन | 5 | 5 |
| nigericin * | DMSO में 2 मिमी | 10 माइक्रोन | 50 | 30 |
* Nigericin समृद्ध में नहीं किया जा सकता हैपरजीवी के रूप में जाहिर स्क्रीन nigericin उत्तेजना जीवित नहीं है, केवल निकास म्यूटेंट की मान्यता में nigericin का उपयोग करें.
तालिका 1. निकास प्रक्रिया में इस्तेमाल inducers. 10 मिलीलीटर HBBSc है स्क्रीन के लिए 25 मिलीग्राम / एमएल डी एस, या उत्परिवर्ती मान्यता (निकास परख) के लिए कोई डी एस युक्त में पतला. सिग्मा Aldrich से सभी यौगिकों.
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Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल एक कुशल एक निकास दोष के साथ Toxoplasma म्यूटेंट अलग करने की विधि प्रदान करता है. हम सफलतापूर्वक निकास मार्ग, जिनमें से कुछ एक दोहरी आक्रमण 13 फेनोटाइप के विभिन्न चरणों के साथ म्यूटेंट अलग. आक्रमण पर संभावित प्रभाव के तथाकथित लाल हरे रंग की परख है, जो गैर आक्रमण परजीवी से अंतर प्रतिरक्षी 23,24 धुंधला द्वारा हमला अंतर का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है. दोनों आक्रमण और निकास assays के लिए 13,22 परजीवी के cytoplasm में एक autofluorescent प्रोटीन मार्कर व्यक्त करने के लिए सुविधाजनक हो सकता है. हालांकि, अगर परजीवी mutagenized किया जा रहा है पहले से ही एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन इस immunofluorescence द्वारा अतिरिक्त प्ररूपी बाद में लक्षण वर्णन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है व्यक्त. यह हमेशा संभव है इसके अलगाव के बाद एक उत्परिवर्ती के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर जोड़ने. एक सरल, गैर फ्लोरोसेंट विकल्प के रूप में वर्णित है, फर्क - त्वरित निकास के लिए धुंधला हो जाना है.
टी "ऐतिहासिक> उत्परिवर्तजन ENU Toxoplasma 14 आनुवंशिकी के लिए आवेदन किया है. लेकिन, ENU preferentially बेस के 25 जोड़े, जो हम Toxoplasma में मान्य एटी लक्ष्य (Farrell, Marth, Gubbels एट अल., पांडुलिपि प्रस्तुत). एक की आवृत्ति के बाद से टी / गैर कोडन अनुक्रम से अमीनो एसिड कोडन अनुक्रम में कम है, गैर कोडन अनुक्रम में परिवर्तन के बहुमत ENU द्वारा प्रेरित हो सकता है हालांकि, ईएमएस आमतौर पर जीसी बेस जोड़े के लिए एक प्राथमिकता है, यानी दृश्यों कोडन होगा. के विशाल बहुमत तापमान के प्रति संवेदनशील परिवर्तन codon बदल परिवर्तन है, जो ENU अधिक ईएमएस का उपयोग करने के लिए एक कारण है में आरंभ.हालांकि निकास संकेतन मार्ग के विभिन्न पहलुओं को ट्रिगर inducers की एक किस्म तालिका 1 में वर्णित हैं, वहाँ अन्य औषधीय एजेंटों के निकास के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं पर कार्रवाई करने के लिए जाना जाता है. उदाहरण के लिए, कैफीन के लिए बाह्य परजीवी में microneme स्राव प्रेरित है, जो दोनों के लिए आवश्यक है दिखाया गया हैनिकास और 7,26,27 आक्रमण. हालांकि, कैफीन संक्रमित मेजबान कोशिकाओं से निकास ट्रिगर नहीं किया जा प्रयोग किया जाता है, कर सकते हैं संभावना है क्योंकि कैफीन कुशलता से करता है एक vacuolar डिब्बे में रहने वाले परजीवी की ओर मेजबान सेल के माध्यम से नहीं फैलाना. इसी तरह, एक निकास ट्रिगर abscisic एसिड का संचय है, लेकिन यह इस मार्ग में म्यूटेंट के लिए स्क्रीन करने के लिए असंभव है बाद से abscisic एसिड मेजबान 28 सेल में नहीं फैलाना करता है. और + K-ionophore nigericin, के रूप में तालिका 1 में संकेत दिया है, तथापि, एक कुशल निकास 5 inducer के परजीवी nigericin उत्तेजना नहीं जीवित है. इसलिए इस यौगिक भी स्क्रीन के लिए उपयुक्त नहीं है. यह एक विकल्प है, और अधिक व्यापक ionophore म्यूटेंट के लिए स्क्रीनिंग प्रक्रिया में सूचना मिली थी कि ionophore प्रेरित निकास में देरी के साथ कई म्यूटेंट 11 ionophore के लिए लंबे समय तक बाह्य जोखिम से बच. हालांकि, कोई निकास के लिए प्रेरित निकास ionophore प्रतिरोधी म्यूटेंट इस स्क्रीन में अलग थे, बनाने phenotypesकमजोर. यह वर्तमान में स्पष्ट नहीं है कि अन्य निकास inducers के लिए लंबे समय तक निवेश करने के लिए प्रतिरोध के साथ म्यूटेंट प्राप्त किया जा सकता है.
के बाद से वहाँ कई समानांतर मार्ग है कि निकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रतीत होता है, सवाल है जो एक एक संक्रमण (प्रायोगिक) में सबसे प्रासंगिक होगा के रूप में उठता है. ऐसा लगता है कि संक्रमित कोशिका पर प्रतिरक्षा प्रणाली हमलों में 29 निकास का मुख्य ट्रिगर. यह उत्परिवर्ती स्क्रीन में इस तरह चलाता उपयोग करने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, CD8 टी कोशिकाओं दोनों एक फैस मध्यस्थता और एक perforin की मध्यस्थता 30 मार्ग के माध्यम से निकास को प्रोत्साहित कर सकते हैं. इसलिए, निकास स्क्रीन में मेजबान कोशिका के रूप में टी कोशिकाओं मानव व्यक्त FasL का उपयोग करके बाहर निकलना एक फैस - विरोधी एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन द्वारा शुरू किया जा सकता है इस मार्ग में म्यूटेंट के लिए समृद्ध है.
आनुवंशिक रूप से बाहर निकलना phenotypes अंतर्निहित परिवर्तन नक्शा, दो अलग अलग दृष्टिकोण Toxoplasma में उपलब्ध हैं. सभी आनुवंशिक मॉडल जीवों के विपरीत,पार से elic अलगाव परजीवी की यौन चक्र के बाद से ही बिल्ली के पेट में शुरू किया जा सकता है एक विकल्प नहीं है. अव्यवहारिकता और इस प्रक्रिया के गरीब दक्षता के अलावा, परजीवी प्रयोगशाला में विकसित उपभेदों बहुत जल्दी बिल्लियों को संक्रमित करने की क्षमता खो देते हैं. इस समस्या को बायपास एक कुशल प्रकार के जंगली cosmid पुस्तकालय complementation दृष्टिकोण विकसित किया गया है, जो कोशिका विभाजन 18 म्यूटेंट के 90% से पूरित है. इसके अलावा, हम हाल ही में स्थापित पूरा जीनोम जीनोम में प्रेरित म्यूटेशन की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल resequencing (Farrell, Marth, Gubbels एट अल., पांडुलिपि प्रस्तुत). आमतौर पर हम 20-70 रासायनिक प्रेरित म्यूटेंट में एकल nucleotide बहुरूपताओं की पहचान. इन दो दृष्टिकोणों के बीच हम सभी रासायनिक प्रेरित तिथि करने के लिए विशेषता म्यूटेंट में प्रेरणा का उत्परिवर्तन की पहचान करने में सक्षम किया गया है.
साथ में ले ली, स्क्रीन वर्णित एक बहुमुखी उपकरण है कि आगे आनुवंशिक विच्छेदन की अनुमति देगा प्रदान करता हैनिकास रास्ते. हमें उम्मीद है कि इस संकेत औषधीय डेटा के आधार पर करने के लिए मौजूद जाना मार्ग के कई घटकों की पहचान करेगा, लेकिन जिसके लिए कोई अच्छा उम्मीदवार जीन Toxoplasma जीनोम में पहचाना जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के वैज्ञानिक विकास अनुदान 0635480N और स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान AI081220 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया. बीआईसी एक शूरवीरों टमप्लर नेत्र फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
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References
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