Summary
앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한 방법입니다
Abstract
널리, 고맙게 여기게 세포내, protozoan 기생충 Toxoplasma gondii는 immuno-감염된 환자에서 기회 질환의 원인과 선천성 감염시 태아에 악영향을 끼친다. 1 : lytic 복제주기가 3 단계이 특징입니다. nucleated 숙주 세포의 활성 침공 2. 숙주 세포 안에서 복제 3. 숙주 세포에서 활성 탈출구. 탈출구의 메커니즘은 점점 여전히 저조한 분자 수준에서 이해하는 독특한, 높은 규제 프로세스로 평가되고있다. 탈출구의 기본 신호 전달 경로는 경로 1-5의 다양한 측면에서 행동 pharmacological 대리인의 사용을 통해 특성화되었습니다. 따라서 탈출구 여러 독립적인 트리거는 모든 세포 내 칼슘 2의 릴리스에 수렴하는 확인되었습니다 +, 또한 숙주 세포 침입 6-8에 중요 신호. 이러한 통찰력은 identi로 이끌었 후보 유전자 접근 방법을 알려탈출구 9 관련된 칼슘 의존 단백질 키나제 (CDPK)과 같은 식물의 fication. 또한, 이해 탈출구 여러 최근의 획기은 (화학) 유전 접근법에게 10-12를 사용되었습니다. Toxoplasma의 증가 유전자 접근으로 pharmacological 정보의 재산을 결합하기 위해 우리는 최근에 호스트 세포 밖으로 나가기 13 결함있는 기생충 뮤턴트 농축을 허용 화면을 설립했습니다. N-에틸-N-nitrosourea (ENU) 또는 에틸 methanesulfonate (EMS)를 사용하여 화학적 돌연변이 유발이 Toxoplasma 생물학 11,14,15의 연구에서 수십 년간 사용되고 있지만, 최근에 밑에 변이 유전자 매핑을 가지고 phenotypes는 일상 16가 -18. 또한, 온도에 민감한 돌연변을 생성하여 필수적인 프로세스를 해부 수 있으며 기본 유전자 직접 확인. 이러한 돌연변이가 허용 온도 (35 ° C) 이하 야생 형 답게 행동하지만, p로 실패문제의 돌연변이의 결과로 제한 온도 (40 ° C)에서 roliferate. 여기에서 우리는 온도에 민감한 탈출구의 표현형 13 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 심사 방법을 설명합니다. 탈출구 화면에 대한 도전은 다시 침략 및 호스트 세포에 기생충 일반 끈적 거림 빨리 복잡하지 않은 egressed 기생충에서 egressed 분리하는 것입니다. 이전에 설립 탈출구 화면이 세포외 기생충 11 일부터 세포 분리 biotinylation 단계의 성가신 시리즈를 기반으로했다. 이 방법은 또한 약한 phenotypes 결과 조건부 돌연변이 생성되지 않았습니다. 여기서 설명한 방법은 숙주 세포 19 고집에서 기생충을 방지 glycan 경쟁, dextran 황산 (DS)를 포함하여 기생충을 egressing의 강한 첨부 파일을 극복. 또한, 세포외 기생충은 특히 세포내 기생충을 떠나는 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)에 의해 죽였으니있다20 무사히. 따라서 구체적으로 유도 탈출구 결함과 기생충 돌연변이를 분리하기 위해 새로운 phenotypic 화면, 유전학의 전원은 이제 완벽하게 숙주 세포의 출현의 기초 분자 메커니즘을 해명하도록 배포할 수 있습니다.
Protocol
개요
프로토콜이 먼저 기생충의 70 %의 살인 (프로토콜 1)로 이어지는 mutagen의 복용량을 정의하기 위해 제공됩니다. 다음 절차는 mutagenized 기생충 수영장 (프로토콜 2, 그림 2)에서 유도 탈출구의 돌연변을 풍부하게하기 위해 제공됩니다. 이것은 농축 수영장에 탈출구 돌연변이의 발생률을 테스트하기 위해, 또는 개별 돌연변이의 출현 표현형 (프로토콜 3) 검증 프로토콜 뒤에있다. 마지막으로, 프로토콜은 희석 (프로토콜 4) 제한하여 풍부한 인구에서 하나의 기생충의 클론을 생성하기 위해 제공됩니다.
1. mutagen의 적정
높은 mutagenic 화합물과 액체와 함께 작업할 때 이러한 이중 장갑과 같은 특별한주의, 사용하십시오. 적절한 처리를 위해 별도로 액체 폐기물을 수집합니다.
- 갓 lysed tachyzoites 1 ML과 인간 포피의 fibroblast (HFF) 세포와 합류 T25 조직 문화 flasks의 예방 37에 18-25 시간을 재배 °; C % 5 이하 Ed1 매체 (D-MEM 1퍼센트 열 inactivated 태아 소 혈청 0.2 밀리미터 L-글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신 및 0.25 μg / ML Amphotericin B와 보완의 CO 2 ). 로스 외를 참조하십시오. HFF 세포 및 기생충 21의 일반적인 성장과 미디어.
- 10 분 10 ML 0.1 % 태아 소 혈청 배지 (D-MEM에서 물로 씻어낸 Ed1 1시 10분) 및 (여기에서 "37 ° C 배양기 '라고도 함)에 5 % CO 2 하에서 humidified 37 ° C 배양기에서 떠나지으로 중간 교체 .
- (mutagen 작업 dilutions는 5 2.5 1.25이되고, 각각 10 밀리미터,됩니다) 플라스크에 따라 0, 12.5, 25, 50, 또는 100 μl ENU (DMSO 1 M 주식) 또는 EMS를 (DMSO 1 M 주식) 추가합니다. 각 플라스크 100 μl에 DMSO를 추가합니다. 37 ° C 배양기 4 시간 동안 알을 품다.
- 10 ML 차가운 PBS (4 ° C에서 미리 냉각)로 단일층를 rinsing하여 실온에서 10 초 동안 세 번 씻는다.
- 5 ML PBS를 추가, 고무 경찰관 (세포 SCR을 느슨하게 단일층을 다쳤어요aper), 물리적으로 섬유아 세포 (바늘을 노출하지 않도록 무거운 의무 가위와 바늘이 외부 샤프트를 고정)에서 기생충을 제거 26.5 G 바늘로 긁어 세포를 통과하고, 필터 3.0 μm의 폴리 카보 네이트 필터. 여러 개의 바늘 구절은 숙주 세포에서 기생충을 발표의 효율성을 높일 것입니다.
- hemocytometer를 사용하여 기생충 농도를 세어보세요. 기생충이 계산되기 전에 hemocytomer에서 5 분 동안 기다려야 해.
- Ed1 3 ML 10,000 기생충 (10 ML 33,333 기생충이 필요한 경우) 기생충을 희석.
- 희석 기생충 (10,000 기생충을 포함) 3 ML과 6 잘 접시에 잘 하나를 예방. 순차적으로 잘 첫번째 300 μl를 전송하여 2.7 ML Ed1을 포함 HFF 세포와 6 잘 플레이트 합류 3 우물 이상 10 배 기생충을 희석. 7 일간 37 ° C 배양기에서 그대로 접시를 남겨주세요.
- 미디어를 대기음, 얼룩, 15 3 ML있는 분 / 잘 100 % 에탄올을 수정3 ML로 / 잘 크리스탈 바이올렛 솔루션 (500 ML 1 % 암모늄 oxalate에 반죽한 125 ML 에탄올의 12.5 g 크리스탈 바이올렛) 15 분, 3 ML과 헹굼 / 잘 PBS (1 분)과 공기 건조. 상온에서 모든.
- plaques 백작과 mutagen의 농도가 노출된 기생충 (70 %는 복용량을 죽이는 : 그림 1 참조)의 30 %의 생존을 달성하는 데 필요한 선택합니다. 70 %의 살인의 복용량은 역사적으로 14를 사용하고 게놈 당 미만 100 점 돌연변이 (파렐, Marth, Gubbels 외., 원고 제출) 유도된되었습니다.
2. 탈출구의 돌연변이 농축 (그림 2)
- 70 %의 살인을 유도 mutagen 투약을 사용하여 위에서 설명한대로 돌연변이 유발을 수행합니다. 호스트 세포의 새로운 플라스크에서 한 구절을위한 mutagenized 인구 철.
- 10 ML Ed1의 mutagenized 인구에서 120,000 갓 lysed 기생충과 T25, HFF 합류 조직 배양 플라스크를 감염. 5 % CO 아래 35 ° C 배양기에서 12 시간 동안 품어2 humidified ( "35 ° C 배양기"라고 hereon에서).
- 미디어를 대기음 25 밀리그램 / ML dextran 황산 (DS) 13과 보충 10 ML Ed1 매체를 추가 후 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스합니다. 5% CO 2와 humidified ( "40 ° C 배양기"라고 hereon에서)에서 40 ° C 배양기에서 26 시간 알을 품다.
- 탈출구 강화의 작업 솔루션을 준비합니다. 25 MG / ML DS로 보충 10 ML HBSSc을 포함한 15 ML 팔콘 튜브의 작동 농도에서 선택의 탈출구 유도를 희석. 37 ° C waterbath 30 분 사전 따뜻한 dilutions. 근무 농도에 대한 표 1을 참조하십시오.
- 기생충에 감염된 flasks에서 매체를 대기음 미리 예열 탈출구의 유도 솔루션을 추가합니다. 표 1에 표시된 시간 동안 37 ° C 배양기에서 품어.
- 미디어를 대기음 10 ML 차가운 PBS로 10 초 린스 후 (PDTC 25 밀리그램 / ML DS와 50 μm의 pyrrolidine dithiocarbamate과 보완 10 ML Ed1을 추가 광고PBS 100 MM PDTC 주식의 D 5 μl) 13. 35 ° C 배양기에서 5 시간 알을 품다.
- 미디어를 대기음 10 ML PBS (실온)에 한 번 10 초 씻어 다음 10 ML Ed1 매체를 추가하십시오. 매일 흔들 flasks : 기생충은 단일층를 파괴 때까지 35 ° C 배양기로 다시 flasks 놔. 이것은 복구 7 일 주위 소요됩니다.
3. 탈출구를 assays에 의한 돌연변이 phenotypes의 유효성 검사
농축 화면을 수행하고 HFF 세포에서 한 구절에 대한 풍부한 인구를 성장 후 phenotypes는 탈출구 분석 11,13에 의해 확정해야합니다. 이 분석은 또한 규정 4 이후 단일 클론의 유효성을 검사하는 데 사용해야합니다.
- coverslips (물론 당 1 ML Ed1 중간)에 성장 합류 HFF 세포를 포함하는 24 잘 플레이트로 잘 인당 20,000 기생충의 예방. 24 시간 동안 40 ° C 배양기로 전송 후 35 ° C 배양기에서 8 시간을 품어.
- 한 ML / 잘 PBS (1 씻으상온, 0 초). 한 ML의 탈출구를 inducers (단지 부정적인 제어 DMSO를 포함), 사전 예열 및 HBSSc에 희석하고 표 1에 설명되어있는 시간에 대한 부화를 추가합니다.
- 미디어를 대기음 1 ML / 상온에서 15 분뿐만 100 % 메탄올로 고정시킨다.
- autofluorescent 단백질을 표현하는 부모 기생충이 돌연변이 유발에 사용한다면, # 3.5 13 단계로 진행합니다. 비 형광 단백질을 표현하는 기생충은 상위 라인으로 사용된다면, 비교 - 빠른 상온 11시 1 분 동안 얼룩과 고정 coverslips을 얼룩.
- 상온에서 24 잘 판에 1 ML / 잘 PBS로 5 분 씻으십시오.
- 형광 단백질을 표현하는 기생충의 경우 : 신속 ddH 2 O (수영)에서 coverslip을 씻어 형광 신호를 보호하기 위해 gelmount 밑에 슬라이드에 탑재합니다. 비교 - 빠른 묻은 기생충의 경우, 100 % 에탄올에 10 초 씻어 및 슬라이드에 장착하기 전에 공기가 건조 해.
- 으로 (형광) 현미경 사용40-60x 목적은 vacuoles의 비율 (그림 4 참조) 세포내 체재 vacuoles 적어 넣은 egressed 계산됩니다.
4. 희석을 제한함으로써 탈출구의 돌연변이 복제
프로토콜 3을 사용 농축 탈출구 돌연변이 인구의 표현형 검증 후, polyclonal 인구가 하나의 기생충의 클론을 얻기 위해 복제해야합니다.
- hemocytometer에서 기생충 인구 백작과 Ed1 매체 ML 당 500 기생충의 농도로 희석.
- HFF 세포의 합류 단일층를 포함 384 자 판에서는 멀티 채널 pipet을 사용하여 40 μl / 잘 Ed1의 매체와 매체를 교체하십시오. 다른 이름으로 그림 5와 같이, 네 polyclonal 인구는 다음과 같이 접시 당 복제하실 수 있습니다 pipet 40 μl / 잘 우물 C3-C12, 우물에 돌연변이 C13-C22, 우물 H3-H12에 돌연변이 3, 돌연변이로 희석 돌연변 1 우물 H13-H22로 4 (우물의 최종 부피는 이제 80 μl입니다.) 코는 멀티 채널 pipet, pipet을 사용하여ution 위아래로 5 번 다음, 시작 행의 아래에 행 (행 C에서 D 또는 행 높이까지 전까지) 40 μl를 전송합니다. 행 G (뮤턴트 1, 2) 또는 행 N (돌연변이 3과 4)를 통해이 두 배 시리얼 dilutions을 계속합니다. 마지막 행에서 추가로 40 μl를 폐기하십시오. 번호판을 방해하지 않고 7-10일 동안 35 ° C 배양기에서 품어.
- 단일층에 '구멍'으로 보이는 한 plaques의 존재를위한 10-20x 목표로 거꾸로 현미경에 우물을 확인합니다.
- 하나의 상패와 돌연변이 최대 4 개의 우물을 선택하고 HFF 세포와 조직 배양 플라스크의 합류로 기생충을 전송하고 Ed1 매체로 가득. 35 ° C 배양기에서 기생충 철, 세포외 기생충을 분산하기 위해서 매일 flasks를 흔들. 이것은 일반적으로 칠일 소요됩니다.
5. 대표 결과
오랜 기간 동안 저장할 때 mutagens ENU와 EMS는 안정되지 않습니다. 따라서,의 mutagenic 능력을 테스트주식 재현성 결과를 얻기위한 필수적인 조건입니다. 일반적인 적정 결과 및 ENU 및 EMS 모두 곡선을 죽이고는 그림 1에 표시됩니다. 그러나, 그것은 적절한 복용량이 사용되었음을 확인할 수있는 모든 돌연변이 유발 실험을위한 플라크의 assays를 수행하는 것이 좋습니다. mutagenized 기생충 인구의 다양성을 유지하기 위해서는 가능한 빨리 탈출구 돌연변이 화면을 진행하는 것이 중요합니다. 일반적으로 새로운 플라스크에 기생충 중 하나 통로가 살아남은 기생충은 화면과 함께 진행하기 전에 복구할 수 있도록 수행됩니다. 그것은 이렇게하면 돌연변이 분열을 초래할 것을 염두에 보관해야합니다. 따라서 그것은 모든 절차를 완료한 후 격리 여러 clonal 뮤턴트 정확히 같은 유전자형을 포함하는 제외 수 없습니다. 그들의 phenotypes (예 차동 탈출구의 유도 인자의 민감한 부분)가 아니라면, 그것은 돌연변이 유발마다 하나의 탈출구의 돌연변를 분리하는 것이 좋습니다 동일한 돌연변이 여러 번 분리 방지하려면서로 매우 다른. 반면에, 원하는 표현형와 돌연변이 격리되지 않은 모든 화면에서 결과를 표시합니다. 특히 칼슘 2 +-ionophore A23187 내성 표현형는 희귀하고 하나의 탈출구를 돌연변이 격리를 위해 여러 돌연변이 유발 실험과 스크린을 필요로합니다. 따라서 그것은 병렬로 5-10 돌연변이 유발 및 스크린 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
화면의 농축 능력이 다른 비율의 야생 타입의 기생충으로 알려진 탈출구의 돌연변를 혼합하여 테스트되었다. 이러한 믹스는 화면으로 받게되었으며 농축 인구의 돌연변이 표현형의 발병률이 평가되었다. 세포질 YFP을 표현 야생 형 세포질 RFP을 표현 기생충과 돌연변이 라인을 사용하면 그런 일이 빠르게 13 유동세포계측법 (그림 3)에서 작성할 수 있습니다. 결과는 돌연변이 phenotypes가 일상적 10,000 야생 - 타입 P 당 1 탈출구 돌연변이 기생충으로 시작하여 80 % 순도로 풍부 수있다는 것을 보여줄arasites 13. 그러나, 언제 탈출구 돌연변 : 야생 형 기생충 시작 비율이 1:100,000 기생충이며, 고립된 인구 (1:100) 탈출구의 돌연변이에만 1~2%입니다. 따라서 화면의 농축 능력은 1000 배입니다. 화면은 일반적으로 70 %가 가능한되어있는 120,000 기생충의 접종으로 시작하기 때문에, 우리는 일반적으로 농축의 두 라운드를 수행합니다. 격리된 기생충은 농축 라운드 사이에 성장하고 있습니다. 야생 형 기생충 : 1:1,000,000 탈출구 돌연변이로 시작하는 경우에도이 절차는 100 % 돌연변 인구로 안내합니다.
phenotypes를 확인하고 특성화하기위한 탈출구 분석은 개별 vacuoles의 차별을 허용 숙주 세포 감염의 다수가 필요합니다. 개별 기생충이 주변에 흩어져으로 탈출구의 높은 비율과 조건을 분석하는 경우에 특히 중요합니다. 그림 4에 나타난 바와 같이 egressed 집단이 잘 분리되지 않은 경우,이 비율을 과소 평가하기 쉽다한 공포 두명 egressed vacuoles를 세어 탈출구니다. 탈출구 및 침입 관련 프로세스이며, 어떤 온도에 민감한 phenotypes는 낮은 온도에서 가벼운 표현형를 표시하기 때문에, 모든 뮤턴트 비슷한 침략의 효율성을해야합니다. 이러한 돌연변 따라서 그들의 탈출구의 표현형의 정확한 평가를 위해 충분히 높지 공포 밀도를 얻기 위해 몇 배 높은 복용량에 주사해야합니다. 또한, 일부 탈출구를 inducers 효율적으로 네 기생충 이하를 포함하는 vacuoles의 탈출구를 자극하지 않습니다. 따라서 그것은 탈출구 분석을 시작할 때 vacuoles 여덟 기생충 이상을 포함하는 것이 중요합니다. 저희 연구실에서는 화면 뮤턴트 다른 탈출구 강화에 대해 특정 탈출구 확장기와 격리. 그들의 교차 반응을 프로 파일링하여 돌연변이 다른 클래스로 그룹화 할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 탈출구의 돌연변이 온도에 민감한 될 것입니다. 탈출구를 inducers가 intracellula의 출시 이전 단계를 실행과 고립 특정 돌연변이에R 칼슘 2 + 이외의 온도에 민감한 phenotypes하는 경향이 있습니다. 이것은 신호가 세포내 칼슘 2 +의 출시에 converges 전에 빠져나갈을 일으킬 수 병렬 경로 때문입니다.
1 그림. 화학 mutagen 투약 적정. A. 플라크의 assays 다양한 EMS의 농도와 더불어 지적 당 기생충의 다양한 숫자를 사용하여 6 판에서 잘 수행했습니다. 하얀 반점은 HFF의 단일층에 형성된 기생 plaques입니다. B, EMS (B)와 ENU (C)의 다양한 복용량에 노출시 기생충 C.의 생존 곡선. 서바이벌은 플라크의 assays에 의해 평가되었다. 70 %의 살인을 유도 복용량은 돌연변이 유발 실험을 위해 선택됩니다. 세 독립적인 실험의 평균은 + / - 표준 편차가 표시됩니다.
그림 3. 탈출구 돌연변 phenotypes의 전형적인 농축. 다양한 비율 (X 축)에 야생 형 기생충에 혼합 탈출구의 돌연변이의 농축 결과. 화면 후 어른이 인구의 탈출구 돌연변 phenotypes의 비율은 y 축은에 꾸몄다되고 유동세포계측법 (탈출구 돌연변이 기생충은 세포질 YFP을 표명하여 평가되었다 야생 형 기생충은 싸이를 표현) RFP toplasmic. 세 독립적인 실험 결과는 빨강, 파랑, 녹색의 데이터 요소로 표시됩니다. Eidell 외에서 채택했다. 13.
4 그림. 탈출구 분석의 일반적인 결과입니다. . 화살표 4-8 기생충을 포함하는 네 가지 그대로 vacuoles을 표시합니다. B는. 화살표 네 개의 독립적인 egressed vacuoles을 반영 흩어진 기생충 네 가지 그룹을 표시합니다. 탈출구는 부정적인 컨트롤 ()로 A23187 (B) 또는 DMSO에 의해 유도되었다. 기생충은 세포질 YFP 22 표현.
그림 5. clonal 기생충 라인. 포 polyclonal 인구 (빨강, 파랑, 노랑, 녹색)을위한 시리얼 희석은 순차적으로 HFF 세포와 단일 384 잘 플레이트 합류로 희석한다. 행 C와 나는 당 잘 열 기생충을 받고가 각각 행 H와 N,까지 (40 μl + 40 μl) 희석 2 배. 회색의 그늘 잘마다 기생충의 감소 수를 나타냅니다. 일반적으로 단일 클론은 행 DF와 JL에서 발견된다.
| 화합물 | 재고 | 근무 농도 | T25 (10 ml) 쇼핑에 필요한 μl | 배양 시간 (분) |
| DTT | DMSO의 1 M | 5 MM | 50 | 15 |
| 에탄올 | 190 입증 | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | DMSO 2 MM | 1 μm의 | 5 | 5 |
| nigericin에 * | DMSO 2 MM | 10 μm의 | 50 | 30 |
* nigericin가 풍부하게 사용하실 수 없습니다기생충 같은, 표준 화면 nigericin의 자극을 생존하지 않는다만이 탈출구 뮤턴트의 검증에 nigericin을 사용합니다.
절차에서 사용되는 표 1. 탈출구를 inducers. 10 ML HBBSc 25 밀리그램 / ML 화면 DS, 또는 돌연변이 유효성 검사 (탈출구 분석)에 대한 노 DS를 포함하는으로 희석. 시그마 - 올드 리치의 모든 화합물.
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Discussion
설명한 프로토콜은 탈출구 결함으로 Toxoplasma 돌연변이를 분리하는 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 성공적으로 이중 침략의 표현형 13 일부 중 탈출구 경로의 여러 단계에 따라 돌연변이를 분리했습니다. 침략에 대한 잠재적인 효과는 차동 항체 염색법 23,24으로 비 침략 기생충으로부터 침공 차별화 소위 빨강 녹색 검정을 사용하여 결정하실 수 있습니다. 침략과 탈출구 assays 모두에 대해 그것은 기생충 13,22의 세포질에 autofluorescent 단백질 마커를 표현하는 것이 편리 될 수 있습니다. 기생충이 mutagenized하는 경우에는 이미이 나중에 immunofluorescence하여 추가 phenotypic 특성을 방해할 수있는 형광 단백질을 표현. 그것은 격리 후 돌연변이로 형광 마커를 추가하는 것이 언제나 가능합니다. 설명한 바와 같이, 단순하지 않은 형광 대안은 탈출구에 대한 비교 - 퀵 염색법이다.
t는 "> 역사적으로 mutagen ENU가 Toxoplasma 유전학 14에 적용되었습니다. 그러나, ENU는 우선적으로 우리가 Toxoplasma에서 검증된 기본 쌍 25 시에 대상 (파렐, Marth, Gubbels 외., 원고 제출).의 주파수부터 / T 비 코딩 순서보다 아미노산 코딩 순서대로 낮은이며, ENU에 의해 유도된 돌연변이의 대부분은 비 코딩 순서대로 될 것입니다. 단, EMS 일반적으로 즉, 시퀀스를 코딩, GC의 기본 쌍을 선호하고 있습니다.의 대부분 온도에 민감한 변이는 ENU를 통해 EMS를 사용하는 이유입니다 코돈 변화 돌연변이에서 유래.신호 전달 경로의 다양한 측면을 트리거링 탈출구를 inducers 다양한는 표 1에 설명되어 있지만, 탈출구에 필요한 프로세스에 따라 행동하는 것으로 알려진 다른 pharmacological 에이전트가 없습니다. 예를 들어, 카페인이 모두 필요하는 세포외 기생충에 microneme 분비를 유도하기 위해 표시되었습니다탈출구와 침략 7,26,27. 그러나 카페인은 아마도, 감염된 숙주 세포에서 탈출구를 실행하는 데 사용할 수 없습니다 때문에 카페인 vacuolar 구획에 거주하는 기생충 대한 숙주 세포를 통해 효율적으로 확산하지 않습니다. 마찬가지로 하나의 탈출구 트리거가 아브시 신산의 축적이지만, 아브시 신산가 숙주 세포 28로 무마하지 않기 때문에 그것이 통로의 뮤턴트 화면으로 불가능합니다. 그리고 표 1에 표시된, K +-ionophore nigericin는 효율적인 탈출구의 유도 5 단, 기생충은 nigericin 자극을 살아남을 수 없다는 거지. 그러므로이 화합물은 또한 스크린에 적합하지 않습니다. ionophore의 돌연변이에 대한 대안, 더 정교 심사 절차에서는 그것은 ionophore 유도 탈출구가 지연될 많은 뮤턴트 ionophore 11 ~ 장기 세포외 노출 살아남을 수 있다고보고되었다. 그러나 유도 탈출구를 ionophore에 강한 아무런 탈출구의 돌연변이 phenotypes 만들기,이 화면에서 고립되지 않았습니다약해. 그것은 다른 탈출구를 inducers에 장기간 노출에 대한 저항과 뮤턴트를 얻을 수 있는지 여부를 현재 불분명합니다.
탈출구로 이어질 수있는 몇 병렬 경로가있을 나타나 있기 때문에, 질문 하나 (실험) 감염에 가장 관련성이 높은 묻지만에로 발생합니다. 그것은 그 감염된 세포에 대한 면역 체계의 공격이 출현 29 주 트리거가 나타납니다. 그것은 돌연변이 화면에 같은 트리거를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CD8 T-세포가 FAS-중재와 perforin-매개 통로 30 두 통해 탈출구를 자극 수 있습니다. 따라서 탈출구 화면에서 숙주 세포로서 T-세포가 인간을 표현 FasL를 사용하여 밖으로 나가다가이 경로에있는 돌연변이에 대해 풍부하게하기 위해 안티 FAS 항체와 인큐베이션을 계기로 할 수 있습니다.
유전자 출현의 phenotypes 기초가 변이를 매핑하려면 두 가지 다른 접근 방식이 Toxoplasma에서 사용할 수 있습니다. 유전자 모델 생물과는 달리, 모든건널목에 의한 elic 분리는 기생충의 성적 사이클에만 고양이 뱃속을 트리 거할 수 있기 때문에 옵션이 아닙니다. 이외 비현실성하고이 과정의 가난한 효율성에서, 실험실에서 재배 기생의 변종은 매우 신속하게 고양이를 감염시킬 수있는 능력을 잃게됩니다. 이 문제를 우회하기 위해 효율적인 야생 형 cosmid 도서관 complementation 방식은 세포 분열의 돌연변이 18 90 %를 보완하는 개발되었습니다. 또한, 최근 게놈에서 유도된 모든 변이를 식별하기위한 프로토콜을 resequencing 전체 게놈을 설립 (파렐, Marth, Gubbels 외., 원고 제출). 일반적으로 우리는 화학적으로 유도된 돌연변이의 20-70 단일 염기 polymorphisms를 확인합니다. 이 두 접근 방식 사이에 우리는 날짜로 특성화 모든 화학적으로 유도된 돌연변이의 원인이되는 돌연변이를 확인할 수 있었다.
함께 촬영, 설명 화면의 앞으로 유전자 절개를 수있는 다양한 도구를 제공합니다탈출구 경로. 우리는 이것이 pharmacological 데이터를 기반으로 존재하는 것으로 알려진 신호 전달 경로의 여러 구성 요소를 식별 것으로 기대했지만하는 더 좋은 후보 유전자는 Toxoplasma 게놈에서 식별되지 않을 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 과학자 발달 그랜트 0635480N 및 건강 연구 보조금 AI081220 국립 연구소에 의해 재정 지원되었다. BIC은 성당 기사단이 눈 재단 연구 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
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References
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