Summary
Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie entwirren
Abstract
Die weit verbreitete, obligat intrazelluläre, einzelligen Parasiten Toxoplasma gondii verursacht opportunistische Erkrankung bei immungeschwächten Patienten und verursacht Missbildungen bei kongenitaler Infektion. 1: Die lytischen Replikationszyklus wird durch drei Phasen gekennzeichnet. aktive Invasion eines kernhaltigen Wirtszelle; 2. Replikation in der Wirtszelle; 3. aktive Austritt aus der Wirtszelle. Der Mechanismus des Austritts wird zunehmend als eine einzigartige, stark regulierten Prozess, der immer noch schlecht ist auf molekularer Ebene zu verstehen, zu schätzen. Die zugrunde liegenden Ausgangs-Signalwege sind durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf verschiedene Aspekte der Wege 1-5 gekennzeichnet. Als solches, mehrere unabhängige Auslöser Austritts identifiziert worden, die alle auf die Freisetzung von intrazellulärem Ca 2 + konvergieren, ein Signal, das ebenfalls kritisch ist für die Host-Invasion 6-8. Diese Einsicht teilte ein Kandidatengen-Ansatz, der auf die identi geführtFIZIERUNG der Pflanze wie Kalzium abhängige Proteinkinase (CDPK) in Egress 9 beteiligt. Darüber hinaus haben mehrere neuere Durchbrüche im Verständnis Egress gemacht worden mit (chemischen) genetische Ansätze 12.10. Um die Fülle an Informationen pharmakologische mit der zunehmenden Verfügbarkeit von genetischen Toxoplasma kombinieren wir vor kurzem ein Bildschirm erlaubt die Anreicherung für Parasiten Mutanten mit einem Defekt in der Wirtszelle Egress 13. Obwohl chemische Mutagenese mit N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) wird seit Jahrzehnten in der Studie von Toxoplasma Biologie 11,14,15 verwendet worden, erst vor kurzem hat genetische Kartierung von Mutationen zugrunde liegen, die Phänotypen zur Routine geworden 16 -18. Ferner kann durch Erzeugen temperaturempfindlichen Mutanten können essentielle Verfahren präpariert und die zugrunde liegenden Genen direkt identifiziert. Diese Mutanten verhalten, als Wild-Typ unter der permissiven Temperatur (35 ° C), aber nicht zu proliferate bei der restriktiven Temperatur (40 ° C) als Ergebnis der Mutation in Frage. Hier zeigen eine neue phänotypische Screening-Verfahren, um Mutanten mit einem temperaturempfindlichen Austritts-Phänotyp 13 zu isolieren. Die Herausforderung für die Ausgangs-Bildschirmen ist es, aus Nicht-egressed Parasiten, die durch schnelle Re-Invasion und die allgemeine Klebrigkeit der Parasiten zu Wirtszellen kompliziert ist egressed trennen. Ein vorher festgelegten Ausstieg Bildschirm wurde auf einer Reihe von umständlichen Biotinylierung Schritte zur Trennung von extrazellulären Parasiten 11 intrazellulären basiert. Auch diese Methode nicht erzeugen bedingte Mutanten was zu schwachen Phänotypen. Das hier beschriebene Verfahren überwindet die starke Bindung von Parasiten austritt, indem ein Glykan Konkurrenten, Dextransulfat (DS), die Parasiten verhindert das Anhaften von dem Host-Zelle 19. Darüber hinaus sind extrazelluläre Parasiten speziell durch Pyrrolidin (PDTC), die intrazelluläre Parasiten verlässt getötet20 unverletzt. Deshalb mit einem neuen phänotypischen Bildschirm, um gezielt zu isolieren Parasit Mutanten mit Defekten in induzierter Egress, kann die Kraft der Genetik nun voll eingesetzt werden, um die molekularen Mechanismen der Wirtszelle Egress entwirren.
Protocol
Überblick
Protokolle sind vorgesehen, um zunächst den Dosierung des Mutagen was zu einer 70% igen Abtötung der Parasiten (Protokoll 1). Im nächsten Verfahren wird bereitgestellt, um die induzierten Mutanten Austritt aus einer mutagenisierten Parasit Pool (Protokoll 2, Abbildung 2) zu bereichern. Dies wird durch ein Protokoll, um die Inzidenz von Austritts-Mutanten, die in dem angereicherten Pool zu testen, oder um den Austritt Phänotyp in den einzelnen Mutanten (Protokoll 3) validieren gefolgt. Schließlich wird ein Protokoll vorgesehen, um einzelne Klone aus Parasiten angereichert Populationen zu erzeugen durch limitierende Verdünnung (Protokoll 4).
1. Titration von Mutagen
Seien Sie besonders vorsichtig, wie zB doppelte Handschuhe, beim Umgang mit hoch mutagene Verbindungen und Flüssigkeiten. Sammeln flüssiger Abfälle getrennt für die ordnungsgemäße Entsorgung.
- Inokulieren T25 Zellkulturflaschen konfluent mit humaner Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen mit 1 ml frisch lysiert Tachyzoiten und wachsen 18-25 h bei 37 °; C unter 5% CO 2 in Ed1 Medium (D-MEM mit 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, 0,2 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 0,25 mg / ml Amphotericin B ergänzt ). Siehe Roos et al. für das allgemeine Wachstum und Medien der HFF-Zellen und Parasiten 21.
- Ersetzen-Medium mit 10 ml 0,1% fötalem Rinderserum Medium (verdünnte Ed1 1:10 in D-MEM) und verlassen in angefeuchteter 37 ° C Inkubator unter 5% CO 2 (genannt "37 ° C Inkubator" Von hier an) für 10 min .
- Fügen Sie 0, 12,5, 25, 50 oder 100 ul ENU (1 M Stammlösung in DMSO) oder EMS (1 M Stammlösung in DMSO) pro Flasche (Mutagen Arbeitsverdünnungen wird sein 1,25, 2,5, 5 und 10 mM). In DMSO zu 100 ul für jede Flasche. Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C-Inkubator.
- Waschen dreimal für 10 Sekunden bei Raumtemperatur durch Spülen der Monoschicht mit 10 ml kaltem PBS (bei 4 ° C vorgekühlt).
- 5 ml PBS, kratzen die lose Monolayer mit einer Gummi-Polizist (SCR-Zelleaper), passieren die Zellen durch eine geschabt 26,5 g Nadel physisch zu entfernen, den Parasiten aus den Fibroblasten (Clip von der Welle außerhalb der Nadel mit schweren Schere Setzen Sie die Nadel) und Filter mit 3,0 um Polycarbonat-Filter. Mehrere Nadelpassagen wird die Effizienz der Freigabe Parasiten aus der Wirtszelle.
- Zählen Sie die Parasit-Konzentration unter Verwendung eines Hämocytometers. Lassen Sie sich die Parasiten für 5 min in der hemocytomer regeln, bevor das Zählen.
- Verdünnen Parasiten zu 10.000 Parasiten pro 3 ml in Ed1 (10 ml für 33.333 Parasiten benötigt werden).
- Beimpfen einer Mulde in einer 6-Well-Platte mit 3 ml der verdünnten Parasiten (mit 10.000 Parasiten). Serienmäßig verdünnen die Parasiten 10-fach über 3 Brunnen in einer 6-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen mit 2,7 ml Ed1 durch die Übertragung von 300 ul aus dem ersten gut. Lassen Platten ungestört in der 37 ° C Inkubator für 7 Tage.
- Saugen Sie Medium, beheben 15 min mit 3 ml / Well 100% Ethanol, Fleckmit 3 ml / well Kristallviolett-Lösung (12,5 g Kristallviolett in 125 ml Ethanol mit 500 ml 1% Ammoniumoxalat gemischt) für 15 min, mit 3 ml spülen / Vertiefung PBS (1 Minute) und an der Luft trocknen. Alle bei Raumtemperatur.
- Count-Plaques und wählen Konzentration von Mutagen benötigt, um das Überleben von 30% der Parasiten ausgesetzt (70% Töten Dosierung: siehe Abbildung 1) zu erreichen. Eine Dosierung von 70% Abtötung wurde historisch verwendet 14 und induziert weniger als 100 Punktmutationen pro Genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript eingereicht).
2. Anreicherung von Austritts-Mutanten (2)
- Führen Mutagenese, wie oben mit einem Mutagen Dosierung induziert 70% Tötung beschrieben. Aufwachsen, die mutagenisierten Population für eine Passage in einem neuen Kolben von Wirtszellen.
- Infect eine T25, HFF konfluenten Zellkulturflasche mit 120.000 frisch lysiert Parasiten aus einer mutagenisierten Population in 10 ml Ed1. Inkubieren Sie für 2 Stunden in einem 35 ° C Inkubator unter 5% CO2 und befeuchtet (von hier an als "35 ° C Inkubator").
- Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 Medium mit 25 mg / ml Dextransulfat (DS) 13 ergänzt. Inkubieren Sie für 26 Stunden in einem 40 ° C Inkubator unter 5% CO 2 und befeuchtet (von hier an als "40 ° C Inkubator").
- Bereiten funktionierende Lösung des Ausgangs-Enhancer. Verdünnen Sie die Ausgangs-Induktor der Wahl am Arbeitsplatz-Konzentration in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml HBSSc mit 25 mg / ml DS ergänzt. Pre-warm die Verdünnungen für 30 min in einem 37 ° C im Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Arbeit Konzentrationen.
- Saugen Sie das Medium aus den Parasiten infizierte Flaschen und fügen vorgewärmten Egress Induktor Lösung. Inkubieren in der 37 ° C-Inkubator für die Zeiten in Tabelle 1 angegeben.
- Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 mit 25 mg / ml DS und 50 uM Pyrrolidindithiocarbamat ergänzt (PDTC: add 5 ul 100 mM PDTC Lager in PBS) 13. Inkubieren 5 Stunden in einem 35 ° C Inkubator.
- Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden einmal mit 10 ml PBS (Raumtemperatur) und fügen Sie dann 10 ml Ed1 Medium. Setzen Flaschen zurück in die 35 ° C Inkubator bis Parasiten zerstören die Monoschicht: Schüttelkolben täglich. Diese Erholung dauert ca. 7 Tage.
3. Validierung der Mutante durch Austritts-Assays
Nach der Durchführung der Bereicherung Bildschirm und das Erwachsenwerden der angereicherten Population für eine Passage in HFF-Zellen müssen die Phänotypen von einem Austritt Assay 11,13 bestätigt werden. Dieser Test sollte auch verwendet, um einzelne Klone nach dem Protokoll Nr. 4 zu bestätigen.
- Inokulieren 20.000 Parasiten pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen auf Deckgläsern (1 ml Medium pro Vertiefung Ed1) gezüchtet. Inkubieren 8 Stunden in einem 35 ° C Inkubator übertragen Sie dann in eine 40 ° C Inkubator für 24 Stunden.
- Waschen mit 1 ml / Vertiefung PBS (10 Sekunden bei Raumtemperatur). 1 ml Ausgangs-Induktoren (DMSO eine einzige negative Kontrolle), vorgewärmt und verdünnt in HBSSc und inkubieren Sie für die Zeiten, in Tabelle 1 beschrieben.
- Saugen Sie mittel-und fixieren mit 1 ml / Well 100% Methanol für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Wenn Eltern Parasiten Expression eines autofluoreszierendes Protein für die Mutagenese verwendet wurden, fahren Sie mit Schritt 13 fort # 3.5. Wenn nicht-fluoreszierendes Protein exprimierende Parasiten als Elternteil Linie verwendet wurden, färben die feste Deckgläser mit Diff-Quick für 1 min bei Raumtemperatur 11 beflecken.
- Waschen 5 min mit 1 ml / Vertiefung PBS in der 24-Well-Platte bei Raumtemperatur.
- Für fluoreszierende Protein exprimierende Parasiten: schnell spülen Sie das Deckglas in ddH 2 O (Eintauchen) und montieren Sie auf Objektträger unter gelmount um das Fluoreszenzsignal zu schützen. Für Diff-Quick gefärbten Parasiten, waschen 10 Sekunden in 100% Ethanol und lassen Luft trocknen, bevor die Montage auf Folie.
- Unter Verwendung eines (Fluoreszenz) mit einem Mikroskop40-60x objektive zählen der Anteil der Vakuolen egressed gegen den Vakuolen, die intrazelluläre blieb (siehe Abbildung 4).
4. Klonen Austritts-Mutanten durch limitierende Verdünnung
Nach der Validierung der Phänotyp des angereicherten Egress Mutantenpopulation Verwendung des Protokolls Nr. 3, muss der polyklonalen Population zu geklont, um einzelne Parasiten Klone zu erhalten.
- Anzahl Parasitenpopulation in einem Hämozytometer und verdünnt auf eine Konzentration von 500 Parasiten pro ml in Ed1 Medium.
- In einem 384-Well-Platte mit einem konfluenten Monolayer von HFF-Zellen, ersetzen Sie das Medium mit 40 ul / Vertiefung Ed1 Medium unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette. Wie in 5 gezeigt, können vier polyklonale Populationen pro Platte wie folgt kloniert werden: Pipette 40 ul / Vertiefung der verdünnten Mutante 1 in Vertiefungen C3-C12, Mutante 2 in Vertiefungen C13-C22, Mutante 3 in Vertiefungen H3-H12 und mutante 4 in Brunnen H13-H22 (Endvolumen in Brunnen ist jetzt 80 ul). Mit einer Multi-Kanal-Pipette, pipet das Solution auf und ab 5 mal, dann Transfer 40 ul auf die Zeile unter der Startreihe (aus Zeile C nach D oder Zeile H bis I). Fahren Sie diese 2-fach serielle Verdünnungen durch Reihe G (Mutanten 1 und 2) oder Zeile N (Mutanten 3 und 4). Entsorgen Sie die zusätzlichen 40 pl aus der letzten Reihe. Inkubieren in einem 35 ° C Inkubator für 7-10 Tage, ohne die Platte.
- Überprüfen Sie die Brunnen auf einem inversen Mikroskop mit einem 10-20x-Objektiv für das Vorhandensein von einzelnen Plaques sichtbar als "Löcher" in der Monoschicht.
- Pick 4 Vertiefungen pro Mutante mit einem einzelnen Plaque und übertragen die Parasiten in eine Zellkulturflasche mit konfluenten HFF-Zellen und gefüllt mit Ed1 Medium. Wachsen die Parasiten in einem 35 ° C Inkubator, schütteln die Flaschen täglich um die extrazellulären Parasiten zerstreuen. Dies dauert in der Regel 7 Tage.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Mutagene ENU und EMS sind nicht stabil, wenn sie über lange Zeiträume gelagert. Daher Testen des mutagenen Machtdie Bestände ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Typische Titrationsergebnisse und Tötung Kurven sowohl für ENU und EMS sind in Abbildung 1 dargestellt. Es wird jedoch empfohlen, Plaque-Assays für jede Mutagenese-Experiment zu vergewissern, dass die geeignete Dosis verwendet wurde durchführen. Um die Vielfalt in der mutagenisierten Parasit Bevölkerung zu erhalten, ist es wichtig, mit dem Austritts-Mutante Bildschirm so schnell wie möglich vorzugehen. Typischerweise wird eine Passage der Parasiten in einen neuen Kolben durchgeführt, damit die überlebenden Parasiten, bevor er nach vorne mit dem Bildschirm wiederherzustellen. Es sollte bedacht werden, dass dies gelingt, werden in der Division der Mutanten führen. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass mehrere klonale Mutanten nach Abschluss des gesamten Verfahrens isoliert genau das gleiche Erbgut enthalten sein. Um zu vermeiden, Isolieren der gleichen Mutante mehrfach empfohlen, nur eine einzige Austritts-Mutante pro Mutagenese zu isolieren ist, sofern sich die Phänotypen (zB differentielle Austritts-Induktor Empfindlichkeiten) sindsehr verschieden voneinander. Auf der anderen Seite, nicht alle Bildschirm führt zur Isolierung von Mutanten mit dem gewünschten Phänotyp. Vor allem die Ca 2 +-Ionophor A23187 resistenten Phänotyp ist selten und erfordert mehrere Bildschirme und Mutagenese-Experimente, um eine einzelne Austritt mutierten zu isolieren. Deshalb ist es empfehlenswert, um 10.05 Mutagenese und Bildschirm Experimenten parallel durchführen.
Die Anreicherung Leistung des Bildschirms wurde durch Mischen einer bekannten Austritts-Mutante mit Wildtyp-Parasiten in unterschiedlichen Verhältnissen getestet. Diese Mischungen wurden auf dem Bildschirm unterworfen, und die Häufigkeit des mutanten Phänotyps in der angereicherten Population wurde bewertet. Durch die Verwendung von Wildtyp-Parasiten auszudrücken zytoplasmatische RFP und eine mutierte Linie, die zytoplasmatische YFP die Inzidenzen konnte schnell mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3) 13 eingerichtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Mutantenphänotypen routinemäßig zu 80% Reinheit werden durch die mit 1 beginnt Egress mutierten Parasiten pro 10.000 Wildtyp-p angereichertarasites 13. Wenn jedoch die Austritts-Mutante: Wildtyp-Parasiten Start Verhältnis 1:100.000 Parasiten, ist die isolierte Population nur 1-2% (1:100) Austritts-Mutanten. Deshalb ist die Bereicherung Macht des Bildschirms befindet sich das 1000-fache. Da der Bildschirm beginnt mit Impfung von 120.000 Parasiten, von denen typischerweise 70% lebensfähig sind wir in der Regel führen zwei Runden der Anreicherung. Die isolierten Parasiten werden zwischen den Runden Bereicherung gewachsen. Dieses Verfahren führt zu einer 100%-Mutante Bevölkerung auch beim Anfahren mit 1:1.000.000 Egress Mutante: Wildtyp-Parasiten.
Der Austritt Assay zu validieren und zu charakterisieren, die Phänotypen erfordert eine Vielzahl von Wirtszelle Infektion, die Differenzierung der einzelnen Vakuolen erlaubt. Dies ist besonders kritisch bei der Analyse der Bedingungen mit einem hohen Anteil von Austritts wie die einzelnen Parasiten finden sich überall. Wie in 4 gezeigt, wenn egressed Populationen nicht gut getrennt sind, ist es einfach, den Anteil zu unterschätzendes Ausgangs durch Zählen zwei egressed Vakuolen als eine Vakuole. Seit Egress und Invasion verbundenen Prozesse sind, und einige temperaturempfindliche Phänotypen zeigen einen milden Phänotyp bei der niedrigeren Temperatur, werden nicht alle Mutanten haben ähnliche Invasion Wirkungsgrade. Solche Mutanten ist daher an das Mehrfache Dosen inokuliert werden, um eine ausreichend hohe Dichte Vakuole für eine genaue Bewertung der Austritts-Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus haben einige Austritts-Induktoren nicht effizient stimulieren Austritt von Vakuolen, die vier oder weniger Parasiten. Als solches ist es wichtig, dass Vakuolen acht Parasiten oder mehr enthalten beim Starten des Austritts-Assay. In unserem Labor haben wir Mutanten-Bildschirm mit einer bestimmten Ausgangs-Enhancer gegen andere Ausgangs-Enhancer isoliert. Durch die Profilierung ihrer Kreuzreaktivität können die Mutanten in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Schließlich werden nicht alle Egress Mutanten sein temperaturempfindlich. Insbesondere Mutanten mit Induktoren Egress Auslösung Schritte vor der Veröffentlichung von intracellula isoliertr Ca 2 + sind anfällig für nicht-temperaturempfindliche Phänotypen. Dies liegt an den Bahnen, die parallel zu führen austreten, bevor das Signal konvergiert auf die Freisetzung von intrazellulären Ca 2 + kann.
Abbildung 1. Chemischen Mutagen Dosistitration. A. Plaque-Assays in einer 6-Well-Platte unter Verwendung verschiedener Konzentrationen und EMS verschiedene Anzahlen von Parasiten pro sowie angegeben durchgeführt. Die weißen Flecken sind Parasiten Plaques in der HFF Monoschicht gebildet. B, C. Die Überlebenskurven von Parasiten bei Bestrahlung mit verschiedenen Dosierungen von EMS (B) und ENU (C). Das Überleben wurde durch Plaque-Assays beurteilt. Eine Dosierung induziert 70% Töten ist für Mutagenese-Experimente ausgewählt. Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten + / - Standardabweichung dargestellt.
Abbildung 3. Typische Anreicherung von Austritts-Phänotypen. Anreicherung Ergebnisse eines Austritts-Mutante in Wildtyp-Parasiten in verschiedenen Verhältnissen (x-Achse) versetzt. Der Anteil der Austritts-Phänotypen in der Bevölkerung bis nach dem Bildschirm aufgewachsen auf der y-Achse aufgetragen und wurde durch Durchflusszytometrie (Austritts-Mutante Parasiten exprimiert cytoplasmatischen YFP beurteilt, ausgedrückt Wildtyp-Parasiten cytoplasmic RFP). Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind durch rote, blaue und grüne Datenpunkte dargestellt. Angenommen von Eidell et al. 13.
Abbildung 4. Typische Ergebnisse eines Austritts-Assay. A. Pfeile kennzeichnen vier verschiedenen intakt enthaltenden Vakuolen 4-8 Parasiten. B. Pfeile kennzeichnen vier Gruppen von verstreuten Parasiten widerspiegeln vier unabhängige egressed Vakuolen. Egress wurde durch A23187 (B) oder DMSO als negative Kontrolle (A) induziert. Parasiten exprimieren zytoplasmatische YFP 22.
Abbildung 5. Verdünnungsstufe zur klonalen Linien Parasiten. Vier polyklonale Populationen (rot, blau, gelb, grün) seriell in einem einzigen 384-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen verdünnt. Row C und I erhalten 10 Parasiten pro Vertiefung undsind 2-fach verdünnter (40 + 40 ul ul) bis H und N Reihen, jeweils. Der Grauton zeigt die sinkende Zahl der Parasiten pro Vertiefung. In der Regel werden einzelne Klone in Reihen DF und JL gefunden.
| Verbindung | Lager | Arbeitskonzentration | ul für T25 (10 ml) erforderlich | Inkubationszeit (min) |
| DTT | 1 M in DMSO | 5 mM | 50 | 15 |
| Ethanol | 190 Proof | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | 2 mM in DMSO | 1 uM | 5 | 5 |
| Nigericin * | 2 mM in DMSO | 10 uM | 50 | 30 |
* Nigericin nicht in der Anreicherung verwendet werdenment-Bildschirm, wie die Parasiten nicht überleben Nigericin Stimulation; nur Nigericin bei der Validierung von Egress Mutanten.
Tabelle 1. Egress-Induktoren in Verfahren verwendet werden. Verdünnen Sie in 10 ml HBBSc mit 25 mg / ml DS für den Bildschirm, oder gar keine DS-Mutante für die Validierung (Ausgangs-Assay). Alle Verbindungen von Sigma-Aldrich.
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Discussion
Die beschriebene Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Toxoplasma Mutanten mit einer Austritts-Defekt zu isolieren. Wir haben erfolgreich Mutanten auf verschiedenen Stufen des Austritts Bahn, von denen einige eine doppelte Invasion Phänotyp 13 haben isoliert. Mögliche Auswirkungen auf die Invasion kann mit Hilfe der sogenannten Rot-Grün-Assay, die aus Nicht-Parasiten eingedrungen durch Differential-Antikörper-Färbung differenziert 23,24 überfallen werden. Für beide Invasion und Austritts-Assays könnte es bequem, eine autofluoreszierende Protein-Marker in das Zytoplasma der Parasiten 13,22 auszudrücken. Wenn jedoch die Parasiten wobei mutagenisiert bereits ein fluoreszierendes Protein exprimieren das mit zusätzliche phänotypische Charakterisierung durch Immunfluoreszenz später stören könnten. Es ist immer möglich, einen fluoreszierenden Marker an ein mutiertes hinzuzufügen nach der Isolierung. Wie beschrieben, ist eine einfache, nicht-fluoreszierenden Alternative Diff-Quick-Färbung für den Austritt.
t "> Historisch gesehen, das Mutagen ENU hat gegen Toxoplasma Genetik 14 angewandt worden. Allerdings ENU bevorzugt Ziele in 25 Basenpaaren, die wir in Toxoplasma validiert (Farrell, Marth, Gubbels et al., eingereichte Manuskript). Da die Frequenz des A / T kleiner in der Aminosäure-kodierenden Sequenz als nicht-kodierenden Sequenz, wird die Mehrheit der Mutationen durch ENU induziert nicht-kodierenden Sequenz sein. jedoch EMS hat typischerweise eine Präferenz für GC-Basenpaare, dh kodierenden Sequenzen. Die überwiegende Mehrheit der temperaturempfindlichen Mutationen entstehen in wechselnden Codon-Mutationen, die ein Grund zum EMS über ENU bedienen ist.Obwohl eine Vielzahl von Austritts-Induktoren dass unterschiedliche Aspekte des Signalweges in Tabelle 1 beschrieben, gibt es andere pharmakologische Wirkstoffe bekannt, auf Verfahren zur Austritts-umgesetzt, so. So hat sich gezeigt, dass Koffein microneme Sekretion in den extrazellulären Parasiten zu induzieren, welche sowohl für das erforderlicheAusstieg und Invasion 7,26,27. Doch Koffein kann nicht zum Austritt aus infizierten Wirtszellen auslösen werden, wahrscheinlich, weil Koffein nicht effizient diffundieren durch die Wirtszelle gegen die Parasiten mit Wohnsitz in einem vakuolären Kompartiment. In ähnlicher Weise ist ein Austritts-Trigger die Akkumulation von Abscisinsäure, aber es ist unmöglich zum Screening auf Mutationen in diesem Weg, da Abscisinsäure nicht in der Host-Zelle 28 zu diffundieren. Und wie in Tabelle 1 gezeigt, ist die K +-Ionophor Nigericin eine effiziente Austritts-Induktor 5, jedoch Parasiten nicht überleben Nigericin Stimulation. Daher ist diese Verbindung nicht geeignet für den Bildschirm. In einer alternativen, ausführlichere Screening-Verfahren für Ionophor Mutanten wurde berichtet, dass viele Mutanten mit einer Verzögerung im Ionophor induzierte Austritts verlängerte Exposition gegenüber extrazellulären Ionophor 11 überleben. Es wurden jedoch keine Austritts-resistente Mutanten zu induzierten Austritts-Ionophor in dieser Maske getrennt, sodass die Phänotypenschwächer. Es ist derzeit unklar, ob die Mutanten mit einer Resistenz gegen längere Exposition gegenüber anderen Ausgangs-Induktoren erhalten werden können.
Da scheint es mehrere parallele Wege, die zum Austritt führen kann, stellt sich die Frage auf den man sich die wichtigsten in einer (experimentellen) Infektion sein. Es scheint, dass das Immunsystem Angriffe auf die infizierte Zelle sind die wichtigsten Auslöser von Austritts-29. Es ist möglich, wie Trigger in der Mutante Bildschirm verwendet wird. Zum Beispiel, dass CD8 + T-Zellen sowohl durch eine Austritts-Fas-vermittelte und Perforin-vermittelten Weg 30 zu stimulieren. Daher kann durch Verwendung eines FasL exprimieren humane T-Zellen als Wirtszelle in der Austritts-Bild können Austritts durch Inkubation mit einem Anti-Fas-Antikörper ausgelöst werden, um Mutanten in diesem Weg zu bereichern.
Um genetisch Kartierung der Mutationen zugrunde liegenden Austritt Phänotypen, sind zwei verschiedene Ansätze in Toxoplasma. Im Gegensatz zu genetischen Modellorganismen, die alleElic Segregation durch Kreuzung ist keine Option, da die sexuelle Entwicklung des Parasiten nur im Darm der Katze ausgelöst werden. Abgesehen von der Unmöglichkeit und schlechte Effizienz dieses Prozesses, Parasiten-Stämme im Labor gezüchtet werden sehr schnell die Fähigkeit verlieren, Katzen infizieren. Um dieses Problem zu umgehen, eine effiziente Wildtyp-Cosmid-Bibliothek Komplementierungsansatz entwickelt worden, die ergänzt 90% der Zellteilung Mutanten 18. Darüber hinaus haben wir vor kurzem komplette Genom etabliert Resequenzierung Protokolle, um alle Mutationen im Genom induziert identifizieren (Farrell, Marth, Gubbels et al., Eingereichte Manuskript). Normalerweise identifizieren wir 20 bis 70 Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch induzierten Mutanten. Zwischen diesen beiden Ansätzen ist es uns gelungen, die ursächliche Mutation in allen chemisch induzierten Mutanten charakterisiert bis heute identifizieren.
Insgesamt bietet der beschriebene Bildschirm ein vielseitiges Werkzeug, das uns genetische Dissektion der erlauben wirddie Austritts-Wege. Wir erwarten, dass diese werden mehrere Komponenten des Signalwegs bekannt, dass es basierend auf pharmakologischen Daten zu identifizieren, für die jedoch keine guten Kandidaten Gene könnten in der Toxoplasma Genom identifiziert werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N und National Institutes of Health Research Grant AI081220 finanziert. BIC wird von einem Tempelritter Eye Foundation Forschungsstipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
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References
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