Summary
Forward genetik är en kraftfull metod att riva upp molekylär nivå hur
Abstract
Den utbredda, obligat intracellulär, protozoparasit Toxoplasma gondii orsakar opportunistisk sjukdom hos immunkomprometterade patienter och orsakar fosterskador vid kongenital infektion. Den lytiska replikationscykeln kännetecknas av tre steg: 1. aktivt invasion av en kärnförsedda värdcell, 2. replikation inuti värdcellen, 3. aktiv utstigning ur värdcellen. Mekanismen för avstigning i allt högre grad uppskattad som en unik, starkt reglerad process, som fortfarande är dåligt förstådd på molekylär nivå. De signalvägar bakom utträde har präglats genom användning av farmakologiska substanser som påverkar olika aspekter av de vägar 1-5. Som sådan har flera oberoende utlöser utträde identifierats vilka alla konvergerar på frisättningen av intracellulära Ca 2 +, en signal som är också kritisk för värdcellen invasion 6-8. Denna insikt informerat en strategi kandidat gen som ledde till identiklassificering av växter som kalcium beroende proteinkinas (CDPK) som deltar i avstigning 9. Dessutom har flera nya genombrott i förståelsen utträde gjorts med (kemisk) genetiska metoder 10-12. Att kombinera den rikedom av farmakologiska information med den ökande genetiska tillgängligheten av Toxoplasma vi nyligen inrättat en skärm som tillåter anrikning för parasitens mutanter med en defekt i värdcell utträde 13. Även kemisk mutagenes med användning av N-etyl-N-nitrosokarbamid (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) har använts under årtionden för studier av Toxoplasma biologi 11,14,15, först nyligen har genetisk kartläggning av mutationer som ligger bakom de fenotyper blivit rutin 16 -18. Vidare, genom att generera temperaturkänsliga mutanter, kan väsentliga processer dissekerades och de underliggande gener direkt identifieras. Dessa mutanter uppträder som vild-typ enligt den tillåtna temperaturen (35 ° C), men misslyckas med att proliferate vid den restriktiva temperaturen (40 ° C) som en följd av mutationen i fråga. Här illustrerar vi en ny fenotypisk screening metod för att isolera mutanter med en temperaturkänslig utträde fenotyp 13. Utmaningen för utträde skärmar är att separera egressed från icke-egressed parasiter, vilket kompliceras av snabb åter-invasion och allmänt klibbighet av parasiterna till värdcellerna. En tidigare etablerade avstigning skärmen bygger på en besvärlig serie biotinyleringsbeting åtgärder för att separera intracellulär från extracellulära parasiter 11. Denna metod inte heller genererar villkorliga mutanter resulterar i svaga fenotyper. Den metod som beskrivs här övervinner starka engagemang för utträder parasiter genom att inkludera en glykan konkurrent dextransulfat (DS), som förhindrar parasiter fastnar värdcellen 19. Dessutom är extracellulära parasiter specifikt avdödades genom pyrrolidin-ditiokarbamat (PDTC), vilket lämnar intracellulära parasiteroskadda 20. Därför, med en ny fenotypisk skärm för att specifikt isolera parasiter mutanter med defekter i inducerad utträde, kan kraften i genetik nu fullt ut för att reda ut de molekylära mekanismerna bakom utträde värdcell.
Protocol
Översikt
Protokoll är anordnade för att först definiera den dosering av den mutagena leder till en 70% avdödning av parasiterna (protokoll 1). Nästa förfarande för att berika inducerade avstigning mutanter från en muterad parasit pool (protokoll 2, figur 2). Detta följs av ett protokoll för att testa förekomsten av avstigning mutanter i den anrikade poolen, eller för att validera utgångsprocessen fenotypen i individuella mutanter (protokoll 3). Slutligen, är ett protokoll för att generera enstaka parasiter kloner från berikade populationer genom begränsad utspädning (protokoll 4).
1. Titrering av mutagen
Använd särskild försiktighet, såsom dubbla handskar, när du arbetar med mycket mutagena ämnen och vätskor. Samla flytande avfall separat för korrekt avfallshantering.
- Ympa T25-vävnadsodlingskolvar konfluenta med humana (HFF) förhudsfibroblast-celler med 1 ml färskt lyserade tachyzoiter och växa 18-25 h vid 37 °; C under 5% CO2 i ED1 medium (D-MEM kompletterat med 1% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 0,2 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin, 50 | ig / ml streptomycin och 0,25 | ig / ml Amfotericin B ). Se Roos et al. för allmän tillväxt och media i HFF-celler och parasiter 21.
- Ersätta mediet med 10 ml 0,1% fetalt bovint serum-medium (utspädd 1:10 ED1 i D-MEM) och lämnar i fuktad 37 ° C inkubator under 5% CO2 (som kallas "37 ° C inkubator" från och med nu) under 10 min .
- Tillsätt 0, 12,5, 25, 50, eller 100 | il ENU (1 M förrådslösning i DMSO) eller EMS (1 M förrådslösning i DMSO) per kolv (mutagen arbetar utspädningar kommer att vara 1,25, 2,5, 5 och 10 mM, respektive). Tillsätt DMSO till 100 | il för varje kolv. Inkubera under 4 h i en 37 ° C inkubator.
- Tvätta tre gånger i 10 sekunder vid rumstemperatur genom att skölja monolagret med 10 ml kall PBS (för-kyld vid 4 ° C).
- Tillsätt 5 ml PBS, skrapa monolagret löst med en gummiskrapa (cell scrAper), passerar de skrapade cellerna genom en 26,5 G nål för att fysiskt avlägsna parasiten från fibroblaster (clip från axeln utanför nålen med tunga sax för att inte exponera nålen), och filter med 3,0 pm polykarbonat-filter. Flera nål passager kommer att öka effektiviteten att frigöra parasiter från värdcellen.
- Räkna parasiten koncentration med användning av en hemocytometer. Låt parasiterna sedimentera under 5 minuter i hemocytomer före räkning.
- Späd parasiter till 10.000 parasiter per 3 ml i ED1 (för 10 ml 33,333 parasiter behövs).
- Ympa en brunn i en 6-brunnsplatta med 3 ml av de spädda parasiter (innehållande 10.000 parasiter). Seriellt späda parasiterna 10-faldigt under 3 brunnar i en 6-brunnsplatta sammanflytande med HFF-celler innehållande 2,7 ml ED1 genom att överföra 300 pl av den första brunnen. Låt plattorna opåverkade i 37 ° C inkubator under 7 dagar.
- Aspirera mediet, fixera 15 min med 3 ml / brunn 100% etanol, fläckarmed 3 ml / brunn kristallviolett lösning (12,5 g kristallviolett i 125 ml etanol blandades med 500 ml 1% ammoniumoxalat) under 15 min, sköljdes med 3 ml / brunn PBS (1 minut) och lufttorka. Alla vid rumstemperatur.
- Räkna plack och väljer koncentration av mutagener som behövs för att uppnå överlevnad av 30% av de exponerade parasiter (70% dödande dos: se figur 1). En dos på 70% dödande har använts historiskt 14 och inducerade mindre än 100 punktmutationer per genomet (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript lämnade).
2. Anrikning av avstigning mutanter (figur 2)
- Utför mutagenes som beskrivits ovan med hjälp av en mutagen dosering framkalla 70% dödande. Väx upp den muterade populationen för en passage i en ny kolv med värdceller.
- Infektera en T25, HFF konfluenta kolv vävnadsodling med 120.000 nyligen lyserade parasiter från en muterad population i 10 ml ED1. Inkubera under 2 timmar i en 35 ° C inkubator under 5% CO2 och befuktad (från och med nu kallad "35 ° C inkubator").
- Aspirera medium och skölj 10 sekunder med 10 ml kall PBS och tillsätt sedan 10 ml ED1 medium kompletterat med 25 mg / ml dextransulfat (DS) 13. Inkubera under 26 h i en 40 ° C inkubator under 5% CO2 och befuktad (från och med nu kallad "40 ° C inkubator").
- Bered Working lösning av avstigning förstärkare. Späd utträdandet inducerare av val vid arbetselektroden koncentration i en 15 ml Falcon-rör innehållande 10 ml HBSSc kompletterat med 25 mg / ml DS. Förvärma utspädningar i 30 min i en 37 ° C vattenbad. Se tabell 1 för arbetande koncentrationer.
- Aspirera medium från parasiten-infekterade kolvar och tillsätt förvärmd lösningen avstigning inducerare. Inkubera i 37 ° C inkubator under de tider som anges i tabell 1.
- Aspirera medium och skölj 10 sekunder med 10 ml kall PBS och tillsätt sedan 10 ml ED1 kompletterat med 25 mg / ml DS och 50 M pyrrolidin ditiokarbamat (PDTC: add 5 ^ il av 100 mM PDTC lager i PBS) 13. Inkubera i 5 timmar i en 35 ° C inkubator.
- Aspirera medium och skölj 10 sekunder en gång med 10 ml PBS (rumstemperatur) och tillsätt sedan 10 ml ED1 medium. Sätt kolvar tillbaka till 35 ° C inkubator tills parasiter förstör monoskiktet: skakkolvar dagligen. Denna återhämtning tar ca 7 dagar.
3. Validering av muterade fenotyper med avstigning analyser
Efter att ha utfört anrikning skärmen och växer upp den anrikade befolkningen för en passage i HFF-celler, de fenotyper måste bekräftas av ett utträde analys 11,13. Denna analys bör också användas för att validera enstaka kloner efter protokoll 4.
- Ympa 20.000 parasiter per brunn i en 24-brunnsplatta innehållande konfluenta HFF-celler odlade på täckglas (1 ml ED1 medium per brunn). Inkubera 8 timmar i ett 35 ° C inkubator sedan överföra till en 40 ° C inkubator i 24 timmar.
- Tvätta med 1 ml / brunn PBS (10 sekunder vid rumstemperatur). Tillsätt 1 ml avstigning inducerare (inkluderar en DMSO enbart negativ kontroll), pre uppvärmda och späds ut med HBSSc och inkubera i de tider som beskrivs i tabell 1.
- Aspirera medium och fixa med 1 ml / brunn 100% metanol under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Om förälder parasiter som uttrycker en autofluorescerande protein användes för mutagenes, fortsätt till steg # 3,5 13. Om icke-fluorescerande protein uttryckande parasiter användes som föräldralinjen, fläcka de fasta täckglasen med Diff-Quick färgning under 1 min vid rumstemperatur 11.
- Tvätta 5 min med 1 ml / brunn PBS i 24-brunnars platta vid rumstemperatur.
- För fluorescerande protein som uttrycker parasiter: snabbt skölja täckglaset i ddHaO 2 O (doppning) och montera på bilder under gelmount att skydda fluorescenssignalen. För Diff-Quick färgade parasiter, tvätta 10 sekunder i 100% etanol och låt lufttorka innan montering på bild.
- Användning av en (fluorescens) mikroskop med en40-60x objektiv räkna den procentuella andelen av vakuoler egressed kontra de vakuoler som stannade intracellulär (se figur 4).
4. Klona avstigning mutanter genom begränsande utspädning
Efter validering av fenotypen av den anrikade avstigning mutanten befolkningen som använder protokoll 3 måste polyklonala befolkningen att klonas för att erhålla enstaka parasit kloner.
- Räkna parasit befolkningen i en hemocytometer och späd till en koncentration av 500 parasiter per ml i ED1 medium.
- I en 384-brunnsplatta innehållande ett sammanflytande monoskikt av HFF-celler, ersätta mediet med 40 | il / brunn av ED1 medium med användning av en flerkanalig pipett. Såsom visas i figur 5, kan fyra polyklonala populationer klonas per platta på följande sätt: pipett 40 | il / brunn av utspädd mutant 1 i brunnar C3-C12, mutant 2 i brunnar C13-C22, mutant 3 i brunnar H3-H12, och mutant 4 i brunnar H13-H22 (slutvolym i brunnarna är nu 80 | il). Med hjälp av en flerkanalig pipett pipett solmepannor upp och ner 5 gånger, sedan överföra 40 pl till raden under start raden (från rad C till D eller raden H till I). Fortsätta dessa 2-faldiga seriespädningar genom raden G (mutanterna 1 och 2) eller rad N (mutanter 3 och 4). Kasta den extra 40 ^ från den sista raden. Inkubera i en 35 ° C inkubator under 7-10 dagar utan att störa plattan.
- Kontrollera brunnarna på ett inverterat mikroskop med en 10-20x objektiv på närvaro av enskilda plack, syns som "hål 'i monolagret.
- Plocka 4 brunnar per mutant med en enda plack och överföra de parasiter i en vävnadskulturkolv sammanflytande med HFF-celler och fyllas med ED1 medium. Odla parasiter i ett 35 ° C inkubator, skaka flaskorna dagligen för att skingra extracellulära parasiter. Detta tar normalt 7 dagar.
5. Representativa resultat
Den mutagena ENU och EMS är inte stabila när de lagras under långa tidsperioder. Därför testar mutagena maktbestånden är avgörande för att uppnå reproducerbara resultat. Typiska Titreringsresultaten och dödar kurvor för såväl ENU och EMS visas i figur 1. Det är dock rekommenderas att plack analyser för varje mutagenes experiment för att försäkra sig om att lämplig dos användes. För att bibehålla mångfalden i mutageniserade parasiten befolkningen, är det viktigt att fortsätta med avstigning mutant skärmen så fort som möjligt. Vanligtvis är en passage av parasiterna till en ny kolv utförs för att låta överlevande parasiterna återhämta innan man går vidare med skärmen. Man bör hålla i minnet att göra detta kommer att resultera i sektion av mutanterna. Det kan därför inte uteslutas att flera klonala mutanter isolerade efter avslutad hela proceduren innehåller exakt samma genotyp. För att undvika att isolera samma muterade flera gånger rekommenderas det att isolera en enda avstigning mutant per mutagenes, såvida inte deras fenotyper (t.ex. differential avstigning inducerare känslighet) ärskiljer sig mycket från varandra. Å andra sidan, inte alla skärmbilder resulterar i isolering av mutanter med den önskade fenotypen. Särskilt Ca2 +-jonofor A23187 resistenta fenotypen är sällsynt och kräver flera mutagenesexperiment och skärmar för att isolera en enda utgång mutanten. Därför rekommenderas att 5-10 mutagenes och experiment skärmen parallellt.
Anrikningen effekt på skärmen testades genom att blanda en känd utträde mutant med vildtyp parasiter i olika förhållanden. Dessa blandningar underkastades skärmen och förekomsten av den mutanta fenotypen i den anrikade populationen bestämdes. Genom att använda vildtyp parasiter som uttrycker cytoplasmiskt RFP och en mutant som uttrycker cytoplasmisk YFP incidensen snabbt kunde fastställas med flödescytometri (Figur 3) 13. Resultaten visar att muterade fenotyper rutinmässigt kan anrikat till 80% renhet genom att börja med 1 avstigning mutant parasiten per 10.000 vildtyp parasites 13. När emellertid utgångsprocessen mutanten: vildtyp parasit startutväxlingsförhållandet är 1:100.000 parasiter är isolerad population endast 1-2% (1:100) avstigning mutanter. Därför anrikning makt skärmen är 1.000-faldig. Eftersom skärmen börjar med ympning av 120.000 parasiter, av vilka normalt 70% är livskraftiga, utför vi vanligtvis två rundor av anrikning. De isolerade parasiter vuxit upp mellan anrikning omgångarna. Detta förfarande leder till en 100%-mutant populationen även vid start med 1:1,000,000 avstigning mutanta: vildtyp parasiter.
Utgångsprocessen analys för att bekräfta och karakterisera de fenotyper krävs en multiplicitet av värdcell infektion som tillåter differentiering av enskilda vakuoler. Detta är särskilt viktigt vid analys förhållanden med höga procentsatser av avstigning som de enskilda parasiter är spridda runt. Såsom visas i figur 4, om egressed populationer ej är väl separerade det är lätt att underskatta procentuellaav egress genom räkning två egressed vakuoler som en vakuol. Eftersom avstigning och invasion är processer, och vissa temperaturkänsliga fenotyper uppvisar en mild fenotyp vid den lägre temperaturen, kommer inte alla mutanter har liknande invasion effektivitet. Dessa mutanter måste därför ympas på flera gånger högre doser för att uppnå en tillräckligt hög vacuole densitet för en korrekt bedömning av deras utträde fenotyp. Dessutom har vissa avstigning inducerare inte effektivt att stimulera utflödet av vakuoler som innehåller fyra parasiter eller mindre. Som sådan, är det viktigt att vakuoler innehåller åtta parasiter eller mer vid start av egress-analysen. I vårt labb har vi skärmen mutanter isolerade med en viss avstigning förstärkare mot andra avstigning förstärkare. Genom att profilera sina korsreaktivitet mutanterna kan indelas i olika klasser. Slutligen kommer inte alla avstigning mutanter vara temperaturkänsliga. I synnerhet mutanter som isolerats med avstigning inducerare utlöser steg innan frisläppandet av intracellular Ca 2 + är benägna att inte temperaturkänsliga fenotyper. Detta beror på de parallella vägar vilka kan leda till utträda innan signalen konvergerar på frisättningen av intracellulära Ca 2 +.
Figur 1. Kemisk mutagen dostitrering. A. Placktester utföras i en 6-brunnsplatta med användning av olika EMS koncentrationer och olika antal parasiter per brunn såsom anges. De vita prickarna är parasiter plack som bildas i HFF-monoskiktet. B, C. Överlevnadskurvor av parasiter vid exponering för olika doseringar av EMS (B) och ENU (C). Överlevnad bedömdes genom plackanalyser. En dos framkalla 70% dödande väljs för mutagenes experiment. Medelvärden av tre oberoende experiment + / - standardavvikelse visas.
Figur 3. Typisk anrikning av avstigning mutanta fenotyper. Anrikning resultaten av en utträdande mutant blandas in vildtyp parasiter, i olika förhållanden (x-axel). Den procentuella andelen avstigning mutanta fenotyper i populationen odlas upp efter att skärmen är avsatt på y-axeln och bedömdes genom flödescytometri (avstigning mutanta parasiter uttryckt cytoplasmatiska YFP, uttryckt vildtyp parasiter cytoplasmic RFP). Resultaten av tre oberoende experiment är representerade av röda, blå och gröna datapunkter. Adopterad från Eidell et al. 13.
Figur 4. Typiska resultat från en utgång analys. A. Pilar markerar fyra olika intakta vakuoler innehåller 4-8 parasiter. B. Pilar markerar fyra grupper av spridda parasiter återspeglar fyra oberoende egressed vakuoler. Egress inducerades genom A23187 (B) eller DMSO som en negativ kontroll (A). Parasiter uttrycka cytoplasmisk YFP 22.
Figur 5. Serial utspädning för klonala parasit linjer. Fyra polyklonala populationer (röd, blå, gul, grön) är seriespädes i en enda 384-brunnar sammanhängande med HFF-celler. Rad C och jag får 10 parasiter per brunn ochär 2-faldigt utspädd (40 | il + 40 | il) till dess rader H och N, respektive. Skuggan av grått anger minskande antalet parasiter per brunn. Normalt är enkla kloner finns i rader DF och JL.
| Förening | Lager | Arbetskoncentration | il behövs för T25 (10 ml) | Inkubationstid (min) |
| DTT | 1 M i DMSO | 5 mM | 50 | 15 |
| etanol | 190 Proof | 5% | 500 | 30 |
| A23187 | 2 mM i DMSO | 1 pM | 5 | 5 |
| nigericin * | 2 mM i DMSO | 10 pM | 50 | 30 |
* Nigericin kan inte användas i anrikaning skärmen som parasiterna överlever inte nigericin stimulering, endast använda nigericin i valideringen av avstigning mutanter.
Tabell 1. Avstigning inducerare används i försöken. Späd i 10 ml HBBSc innehållande 25 mg / ml DS för skärmen, eller inga DS för mutant validering (utträde analys). Alla föreningar från Sigma-Aldrich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna protokollet tillhandahåller en effektiv metod för att isolera Toxoplasma mutanter med en utgång defekt. Vi har med framgång isolerat mutanter längs olika stegen av egress-vägen, av vilka några har en dubbel invasion fenotyp 13. Potentiella effekter på invasion kan bestämmas med hjälp av så kallade röd-gröna analys, som skiljer invaderade från icke-invaderat parasiter av differentiell antikroppsfärgning 23,24. För båda invasion och avstigning analyser kan det vara lämpligt att uttrycka en autofluorescerande proteiner markör i cytoplasman av parasiterna 13,22. Om emellertid de parasiter som muteras redan uttrycker en fluorescerande protein detta kan interferera med ytterligare Fenotypisk karakterisering av immunofluorescens senare. Det är alltid möjligt att lägga till en fluorescerande markör för att en mutant efter isolering. Såsom beskrivits, är en enkel, icke-fluorescerande alternativ Diff-Quick-färgning för utträde.
t "> Historiskt har mutagena ENU använts på Toxoplasma genetik 14. Men ENU företrädesvis mål på baspar 25, som vi validerade i Toxoplasma (Farrell, Marth, Gubbels et al., lämnade manus). Eftersom frekvensen av A / T är lägre i aminosyrakodande sekvensen än icke-kodande sekvens, kommer majoriteten av mutationer induceras av ENU vara i icke-kodande sekvens. emellertid EMS typiskt har en preferens för GC-baspar, dvs kodande sekvenser. Det stora flertalet av temperaturkänsliga mutationer har sitt ursprung i kodon-föränderliga mutationer, vilket är en anledning att använda EMS över ENU.Även om en mångfald inducerare utgångsgränssnitt utlösande olika aspekter av signaleringsvägen är beskrivna i tabell 1, finns det andra farmakologiska medel kända för att verka på processer som krävs för utträde. Till exempel har koffein visats inducera microneme sekretion i extracellulära parasiter, som krävs för bådeavstigning och invasion 7,26,27. Däremot kan koffein inte användas för att trigga utträde från infekterade värdceller, sannolikt eftersom koffein inte effektivt diffunderar genom värdcellen mot parasiterna som bor i en vakuolär fack. På liknande sätt är en utträdande avtryckare ackumuleringen av abskisinsyra, men det är omöjligt att screena för mutanter i denna reaktionsväg sedan abskisinsyra inte diffundera in i värdcellen 28. Och såsom anges i tabell 1, är K +-jonofor nigericin en effektiv utströmning inducerare 5 emellertid inte parasiter inte överleva nigericin stimulering. Därför är denna förening är inte heller lämplig för skärmen. I en alternativ, mer utarbetad screening förfarande för jonofor mutanter rapporterades det att många mutanter med en fördröjning i jonofor inducerad avstigning överleva långvarig extracellulära exponering för jonofor 11. Men inga avstigning mutanter som är resistenta mot jonoforen inducerad avstigning isolerade i denna skärm, vilket gör fenotypersvagare. Det är för närvarande oklart om mutanter med resistens mot långvarig exponering för andra avstigning inducerare kan erhållas.
Eftersom det verkar finnas flera parallella vägar som kan leda till utträde, uppstår frågan om vilken man skulle vara den mest relevanta i en (experimentell) infektion. Det verkar som om immunförsvaret attackerar på den infekterade cellen är den huvudsakliga orsaken till utträde 29. Det är möjligt att använda sådana utlösare i mutanten skärmen. Till exempel kan CD8 T-celler stimulerar avstigning från både en Fas-förmedlad och en perforin-medierad reaktionsväg 30. Därför, genom att använda en FasL uttryckande humana T-celler som en värdcell i utgångsprocessen skärmen kan utträde utlösas genom inkubering med ett anti-Fas-antikropp för att anrika för mutanter i denna reaktionsväg.
Genetiskt kartlägga de mutationer som ligger till grund för avstigning fenotyper, två olika tillvägagångssätt finns i Toxoplasma. Till skillnad från genetiska modellorganismer, allaelic segregation genom korsning är inte ett alternativ eftersom den sexuella cykeln av parasiten endast kan utlösas i tarmen på katten. Bortsett från ogenomförlig och dålig effektivitet i denna process, parasit stammar odlas i laboratoriet mycket snabbt förlora förmågan att infektera katter. För att kringgå detta problem en effektiv vildtyp kosmidbibliotek komplettering metod har utvecklats, vilket kompletterade 90% av mutanter cell division 18. Dessutom har vi nyligen etablerade fullständiga genomet återsekvenseringsenheten protokoll för att identifiera alla mutationer som induceras i genomet (Farrell, Marth, Gubbels et al. Lämnade manuskript). Normalt identifierar vi 20-70 enstaka nukleotidpolymorfismer i kemiskt inducerade mutanter. Mellan dessa två tillvägagångssätt har vi kunnat identifiera den orsakande mutationen i alla kemiskt inducerade mutanter kännetecknas hittills.
Sammantaget ger den beskrivna skärmen ett mångsidigt verktyg som gör det möjligt framåt genetiska dissektion avUtgångsarean vägar. Vi förväntar oss kommer att identifiera flera komponenter i den signalväg kända för att existera baserat på farmakologiska data, men för vilka inga bra gener kan identifieras i Toxoplasma genomet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av American Heart Association Scientist utveckling Grant 0635480N och National Institutes of Health forskningsanslag AI081220. BIC stöds av en Tempelherreorden Eye Foundation forskningsanslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ENU | Sigma-Aldrich | N3385 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | 1 M Stock in DMSO, store at -20 °C |
| Dextran Sulfate | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | 100 mM Stock in PBS |
| Diff Quick | EMD Chemicals | 65044-93 | |
| Filter holder | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 μm polycarbonate filter | Whatman Schleicher Schuell | 110612 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| CO2 incubators | Various manufacturers | Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C | |
| Fluorescence microscope | Various manufacturers | Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective | |
HBSSc (according to Black et al.11): |
|||
|
|||
References
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
- Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
- Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
- Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
- Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
- Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
- Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
- Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
- Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
- Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
- Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
- Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
- Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
- Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
- Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
- White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
- Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
- Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
- Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
- Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
- Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
- Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
- Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
- Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
- Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
- Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
- Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
- Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
- Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).
