En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

Summary

Forward genetikk er en kraftig metode for å avdekke molekylære nivå av hvordan

Abstract

Den utbredte, obligate intracellulære, protozo parasitten Toxoplasma gondii forårsaker opportunistisk sykdom i immuno-kompromitterte pasienter og forårsaker fødselsdefekter ved medfødt infeksjon. Den lytisk replikasjon syklusen er preget av tre stadier: 1. aktiv invasjon av en kjerneholdige vertscelle; to. replikering inne i vertscellen, 3. aktiv egress fra vertscellen. Mekanismen for egress blir i økende grad verdsatt som en unik, svært regulert prosess, som fortsatt er dårlig forstått på molekylært nivå. De signalveier underliggende egress har vært preget gjennom bruk av farmakologiske preparater som virker på ulike aspekter av banene ^1-5. Som sådan har flere uavhengige utløsere av egress blitt identifisert som alle konvergerer på utgivelsen av intracellulær Ca ^{2 +,} et signal som også er kritisk for vertscelle invasjon ^6-8. Denne innsikten informert en kandidat gen tilnærming som førte til identifiseringen av anlegget som kalsium avhengig protein kinase (CDPK) involvert i egress ^9. I tillegg har flere nylige gjennombrudd i forståelsen egress blitt gjort ved hjelp av (kjemisk) genetiske tilnærminger ^10-12. Å kombinere vell av farmakologiske informasjon med økende genetisk tilgjengeligheten av Toxoplasma vi nylig etablert en skjerm tillater berikelse for parasitten mutanter med en defekt i vertscelle egress ^13. Selv om kjemisk mutagenese bruke N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etyl methanesulfonate (EMS) har vært brukt i flere tiår i studiet av Toxoplasma biologi ^11,14,15, bare nylig har genetisk kartlegging av mutasjoner som ligger bak fenotyper bli rutine ^{16 -18.} Videre, ved å generere temperaturfølsomme mutanter, kan viktige prosesser bli dissekert og de underliggende genene direkte identifisert. Disse mutantene oppfører seg som vill-type under ettergivende temperatur (35 ° C), men mislykkes i å proliferate ved den restriktive temperatur (40 ° C) som følge av mutasjon i spørsmålet. Her har vi illustrere en ny fenotypisk screening metode for å isolere mutanter med en temperatur-sensitiv egress fenotype ^13. Utfordringen for utgående skjermer er å skille egressed fra ikke-egressed parasitter, som kompliseres av rask re-invasjon og generell Stickiness av parasittene til vertsceller. En tidligere etablert egress skjerm var basert på en tungvint serie biotinylation skritt for å skille intracellulær fra ekstracellulære parasitter ^11. Denne metoden heller ikke generere betingede mutanter resulterer i svake fenotyper. Metoden beskrevet her overvinner den sterke tilknytning til egressing parasitter ved å inkludere en glykan konkurrent, dekstransulfat (DS), som hindrer parasitter fra stikker til vertscellen ^19. Videre er ekstracellulære parasitter spesifikt drept av ved pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), som etterlater intracellulære parasitteruskadd ^20. Derfor, med en ny fenotypisk skjermen for å spesifikt isolere parasitten mutanter med defekter i indusert egress, kan kraften av genetikk nå bli fullt utviklet for å avdekke molekylære mekanismene bak vertscellen egress.

Protocol

Oversikt

Protokoller er forutsatt å først definere dosering av mutagen fører til en 70% drap av parasitter (protokoll 1). Den neste prosedyre for å berike de induserte utgående mutantene fra en mutagenized parasitt basseng (protokoll 2, figur 2). Dette etterfølges av en protokoll for å teste forekomst av utgående mutanter i anriket bassenget, eller å validere egress fenotypen i enkelte mutanter (protokoll 3). Endelig er en protokoll gis for å generere enkle parasitten kloner fra beriket populasjoner ved å begrense fortynning (protokoll 4).

1. Titrering av mutagen

Bruk spesiell forsiktighet, for eksempel doble hansker, når du arbeider med svært mutagene forbindelser og væsker. Samle flytende avfall separat for riktig avhending.

1. Inokuler T25 vevskulturstudier kolber konfluent med menneskelige foreskin fibroblast (HFF) celler med 1 ml av nybakte lyserte tachyzoites og vokse 18-25 timer ved 37 °; C under 5% CO ₂ i Ed1 middels (D-MEM supplert med 1% varme-inaktiverte føtal bovin serum, 0,2 mm L-glutamin, 50 U / ml penicillin, 50 mikrogram / ​​ml streptomycin, og 0,25 mikrogram / ​​ml amfotericin B ). Se Roos et al. for generell vekst og media av HFF celler og parasitter ^21.
2. Erstatt medium med 10 ml 0,1% Fetal bovin Serum medium (fortynnet Ed1 01:10 i D-MEM) og la i fuktet 37 ° C inkubator under 5% CO ₂ (kalt "37 ° C inkubator" herfra på) for 10 min .
3. Legg 0, 12,5, 25, 50, eller 100 mL ENU (1 M Stock i DMSO) eller EMS (1 M Stock i DMSO) per kolbe (mutagen arbeider fortynninger vil være 1,25, 2,5, 5 og 10 mm, henholdsvis). Legg DMSO til 100 mL for hver kolbe. Inkuber i 4 timer i en 37 ° C inkubator.
4. Vask tre ganger på 10 sekunder ved romtemperatur ved å skylle monolayer med 10 ml kald PBS (pre-avkjølt ved 4 ° C).
5. Tilsett 5 ml PBS, skrape monolayer løs med en gummi politimann (celle scraper), passere skrapt cellene gjennom en 26,5 G nål for å fysisk fjerne parasitten fra fibroblaster (CLIP av akselen utenfor nålen med tunge saks for å ikke utsette nålen), og filter med 3,0 mikrometer polykarbonat filter. Flere nål passasjer vil effektivisere slippe parasitter fra vertscellen.
6. Tell parasitten konsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer. La parasittene bosette i 5 min i hemocytomer før telling.
7. Fortynn parasitter til 10.000 parasitter per 3 ml i Ed1 (for 10 ml 33,333 parasitter er nødvendig).
8. Inokuler en brønn i en 6 brønn plate med 3 ml av den fortynnede parasitter (som inneholder 10.000 parasitter). Serielt tynnes parasittene 10 ganger over 3 brønner i en seks-brønns plate konfluent med HFF celler som inneholder 2,7 ml Ed1 ved å overføre 300 mL ut av den første brønnen. La platene uforstyrret i 37 ° C inkubator i 7 dager.
9. Sug medium, fikse 15 min med 3 ml / vel 100% etanol, beismed 3 ml / brønn krystallfiolett løsning (12,5 g krystallfiolett i 125 ml etanol blandet med 500 ml 1% ammonium oksalat) for 15 min, skyll med 3 ml / brønn PBS (1 minutt) og la dem lufttørke. Alle ved romtemperatur.
10. Tell plakk og velg konsentrasjon av mutagen nødvendig for å oppnå overlevelse på 30% av de eksponerte parasitter (70% drepte dosering: se figur 1). En dose på 70% drap har blitt brukt historisk ¹⁴ og indusert mindre enn 100 punktmutasjoner per genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript innsendt).

2. Anrikning av utgående mutanter (figur 2)

1. Utfør mutagenese som beskrevet ovenfor ved hjelp av en mutagen dosering indusere 70% drap. Grow opp mutagenized befolkningen for en passering i en ny flaske av vertsceller.
2. Infisere en T25, HFF konfluent vevskultur kolbe med 120.000 nybakte lyserte parasitter fra en mutagenized befolkning i 10 ml Ed1. Inkuber i 2 timer i en 35 ° C inkubator under 5% CO2 og fuktet (heretter kalt "35 ° C inkubator").
3. Aspirer medium og skyll 10 sekunder med 10 ml kald PBS og deretter legge 10 ml Ed1 medium supplert med 25 mg / ml dekstransulfat (DS) ^13. Inkuber i 26 timer i en 40 ° C inkubator under 5% CO ₂ og fuktet (heretter kalt "40 ° C inkubator").
4. Forbered arbeider løsning av utgående enhancers. Fortynn det egress induser av valget på arbeidsplassen konsentrasjonen i en 15 ml Falcon rør som inneholder 10 ml HBSSc supplert med 25 mg / ml DS. Pre-varme de fortynninger for 30 min i en 37 ° C waterbath. Se tabell 1 for arbeider konsentrasjoner.
5. Sug medium fra parasitt-infiserte kolber og legg forvarmes egress induser løsning. Inkuber i 37 ° C inkubator for tiden angitt i tabell 1.
6. Aspirer medium og skyll 10 sekunder med 10 ml kald PBS og deretter legge 10 ml Ed1 supplert med 25 mg / ml DS og 50 mM pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC: add 5 mL av 100 mm PDTC Stock i PBS) ^13. Inkuber 5 timer i en 35 ° C inkubator.
7. Aspirer medium og skyll 10 sekunder en gang med 10 ml PBS (romtemperatur) og deretter legge til 10 ml Ed1 medium. Sett kolber tilbake i 35 ° C inkubator til parasitter ødelegge monolayer: Rist kolbene daglig. Denne gjenopprettingsprosessen tar rundt 7 dager.

3. Validering av mutante fenotyper ved utgående analyser

Etter å ha utført den berikelse skjermen og vokser opp beriket befolkningen for en passering i HFF celler, fenotyper må bekreftes av en egress analyse ^11,13. Denne analysen bør også brukes til å validere enkelte kloner etter protokoll 4.

1. Inokuler 20.000 parasitter per brønn i en 24-brønns plate inneholder konfluent HFF celler dyrket på Dekkglass (1 ml Ed1 medium per brønn). Inkuber 8 timer i en 35 ° C inkubator deretter overføre til en 40 ° C inkubator i 24 timer.
2. Vask med 1 ml / brønn PBS (10 sekunder ved romtemperatur). Tilsett 1 ml utgående indusere (inkluderer en DMSO bare negativ kontroll), forvarmet og fortynnes i HBSSc og inkuber for tiden er beskrevet i Tabell 1.
3. Aspirer medium og fikse med 1 ml / vel 100% metanol i 15 min ved romtemperatur.
4. Hvis foreldre parasitter som uttrykker en autofluorescent protein ble brukt for mutagenese, går du til trinn # 3.5 ^13. Hvis ikke-fluorescerende protein uttrykker parasitter ble brukt som forelder linje, flekker de faste Dekkglass med Diff-Quick flekk i 1 min ved romtemperatur ^11.
5. Vask 5 min med 1 ml / brønn PBS i 24-brønnen plate ved romtemperatur.
6. For fluorescerende protein uttrykker parasitter: fort skylle dekkglass i DDH ₂ O (dipping) og montere på lysbilder under gelmount å beskytte fluorescens signal. For diff-Quick beiset parasitter, vask 10 sekunder i 100% etanol og la lufttørke før montering på lysbildet.
7. Bruke en (fluorescens) mikroskop med en40-60x objektiv telle hvor mange prosent av vakuoler egressed versus vakuoler som oppholdt intracellulær (se figur 4).

4. Klon utgående mutanter ved å begrense fortynning

Etter validering av fenotype av anriket egress mutant befolkning bruker protokoll 3, må polyklonal befolkningen som skal klones å få single parasitt kloner.

1. Telle parasitt befolkningen i en hemocytometer og fortynn til en konsentrasjon av 500 parasitter per ml i Ed1 medium.
2. I et 384-brønns plate som inneholder en konfluent monolayer av HFF celler, erstatte medium med 40 mL / brønn Ed1 medium ved hjelp av en multi-kanal pipette. Som vist i figur 5, kan fire polyklonale populasjoner klones per plate som følger: pipettér 40 mL / godt av fortynnet mutant 1 inn brønner C3-C12, 2 mutant inn brønner C13-C22, 3 mutant inn brønner H3-H12, og mutant 4 inn brønner H13-H22 (end volum i brønner er nå 80 mL). Ved hjelp av en multi-kanal pipetter, pipettér solution opp og ned 5 ganger, deretter overføre 40 mL til raden nedenfor startstreken rad (fra rad C til D eller rad H til I). Fortsett disse to-fold seriefortynning gjennom rad G (mutanter 1 og 2) eller rad N (mutanter 3 og 4). Kast ekstra 40 mL fra siste rad. Inkuber i en 35 ° C inkubator i 7-10 dager uten å forstyrre plate.
3. Sjekk brønnene på en invertert mikroskop med en 10-20x mål for tilstedeværelse av enkle plaketter, synlig som 'hull' i monolayer.
4. Plukk 4 brønner per mutant med en enkelt plakett og overføre parasitter til en vev kultur kolbe konfluent med HFF celler og fylt med Ed1 medium. Grow parasitter opp i en 35 ° C inkubator, riste flaskene daglig for å spre de ekstracellulære parasitter. Dette tar vanligvis 7 dager.

5. Representative Resultater

Den mutagener ENU og EMS er ikke stabil når den lagres over lang tid. Derfor teste mutagen maktbestandene er kritisk for å oppnå reproduserbare resultater. Typiske titrering resultater og drap kurver for både ENU og EMS er vist i figur 1. Imidlertid er det anbefalt å utføre plakk-analyser for hver mutagenese eksperiment for å konstatere at riktig dosering ble brukt. For å opprettholde mangfoldet i mutagenized parasitten befolkningen, er det viktig å fortsette med egress mutant skjermen så raskt som mulig. Vanligvis blir en passasje av parasittene inn i en ny kolbe utført for å la de overlevende parasitter gjenopprette før du går videre med skjermen. Det bør være oppmerksom på at du gjør dette vil resultere i delingen av mutanter. Derfor kan det ikke utelukkes at flere klonal mutanter isolert etter å ha fullført hele prosedyren inneholder nøyaktig samme genotype. For å unngå å isolere de samme muterte flere ganger, anbefales det å isolere bare én utgang mutant per mutagenese, hvis ikke deres fenotyper (f.eks differensiallikninger utgående induser følsomhet) erveldig forskjellig fra hverandre. På den annen side, ikke hver skjerm resulterer i isolasjon av mutanter med ønsket fenotype. Spesielt Ca ^{2 +-ionophore} A23187 resistent fenotype er sjeldne og krever flere mutagenese eksperimenter og skjermer for å isolere en enkelt egress mutant. Derfor anbefales det å utføre 5-10 mutagenese og skjermen eksperimenter i parallell.

Berikelse kraft av skjermen ble testet ved å blande en kjent egress mutant med vill-type parasitter på ulike forholdstall. Disse blandingene ble utsatt for skjermen og forekomsten av mutant fenotype i anriket befolkningen ble vurdert. Ved å bruke vill type parasitter uttrykke cytoplasmisk RFP og en mutant linje uttrykker cytoplasmisk YFP forekomst kunne fort bli etablert ved flowcytometri (figur 3) ^13. Resultatene viser at mutante fenotyper kan rutinemessig anriket til 80% renhet ved å starte med en egress mutert parasitt per 10 000 vill-type parasites ^13. Men når egress mutant: vill-type parasitt start forholdet er 1:100,000 parasitter, er den isolerte befolkningen bare 1-2% (1:100) utgående mutanter. Derfor berikelse kraft av skjermen er 1000 ganger. Siden skjermen begynner med inokulasjon på 120.000 parasitter, hvorav typisk 70% er levedyktig, vi vanligvis utfører to runder med berikelse. De isolerte parasitter er vokst opp mellom berikelse rundene. Denne prosedyren fører til en 100% mutant befolkningen selv når du starter med 1:1,000,000 utgående mutante: vill type parasitter.

Den egress analysen for å validere og karakterisere fenotyper krever et mangfold av vertscelle infeksjon som tillater differensiering av enkelte vakuoler. Dette er spesielt viktig når du skal analysere forholdene med høy prosent av egress som de enkelte parasitter er spredt rundt. Som vist i figur 4, hvis egressed populasjoner ikke er godt atskilt det er lett å undervurdere den prosentviseav egress ved å telle to egressed vakuoler som en vakuole. Siden egress og invasjonen er relaterte prosesser, og noen temperaturfølsomme fenotyper vise en mild fenotype ved lavere temperatur, vil ikke alle mutanter har lignende invasjon effektivitet. Slike mutanter må derfor inokulert på flere ganger høyere doser for å oppnå en høy nok vakuole tetthet for en nøyaktig vurdering av deres egress fenotype. I tillegg vil enkelte utgående indusere ikke effektivt stimulere egress av vakuoler som inneholder fire parasitter eller mindre. Som sådan er det viktig at vakuoler inneholder åtte parasitter eller mer når du starter egress analysen. I vår lab vi skjermen mutanter isolert med en bestemt egress enhancer mot andre utgående enhancers. Ved å profilere sin kryssreaktivitet mutantene kan grupperes i ulike klasser. Endelig, vil ikke alle utgående mutanter være temperaturfølsom. I spesielle mutanter isolert med utgående indusere utløser skritt før utgivelsen av intracellular Ca ^{2 +} er tilbøyelige til ikke-temperaturfølsomme fenotyper. Dette skyldes de parallelle veier som kan føre til egress før signalet konvergerer på utgivelsen av intracellulær Ca ^{2 +.}

Figur 1. Kjemisk mutagen dosering titrering. A. plakk analysene ble utført i en seks-brønns plate ved hjelp av ulike EMS konsentrasjoner og ulike antall parasitter per brønn som angitt. De hvite flekkene er parasitter plakk dannes i HFF monolayer. B, C. overlevelseskurvene av parasitter ved eksponering for ulike doser av EMS (B) og ENU (C). Overlevelse ble vurdert av plakk analyser. En dose inducing 70% drap velges for mutagenese eksperimenter. Gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter + / - standardavvik er vist.

et al. ^13.

Figur 3. Typisk anrikning av utgående mutante fenotyper. Berikelse resultatene av en egress mutant blandet inn i vill type parasitter på ulike forholdstall (x-aksen). Andelen utgående mutante fenotyper i befolkningen vokst opp etter at skjermen er plottes på y-aksen, og ble vurdert av flowcytometri (utgående mutante parasitter uttrykt cytoplasmisk YFP, uttrykte vill type parasitter cytoplasmic RFP). Resultater fra tre uavhengige eksperimenter er representert med røde, blå og grønn datapunkter. Vedtatt fra Eidell et al. ^13.

Figur 4. Typiske resultater av en egress analysen. A. Piler markerer fire ulike intakte vakuoler som inneholder 4-8 parasitter. B. Piler markere fire grupper av spredte parasitter som gjenspeiler fire uavhengige egressed vakuoler. Egress ble indusert av A23187 (B) eller DMSO som en negativ kontroll (A). Parasitter uttrykke cytoplasmisk YFP ^22.

Figur 5. Serial fortynning for klonal parasitten linjer. Fire polyklonale populasjoner (rød, blå, gul, grønn) er serielt fortynnet i en enkelt 384-brønnen plate konfluent med HFF celler. Row C, og jeg får 10 parasitter per brønn oger to-fold utvannet (40 mL + 40 mL) inntil rader H og N, henholdsvis. Skyggen av grå indikerer avtagende antall parasitter per brønn. Vanligvis er enkle kloner funnet i rader DF og JL.

Compound	Lager	Arbeide konsentrasjon	mL nødvendig for T25 (10 ml)	Inkubasjonstiden (min)
DTT	1 M i DMSO	5 mm	50	15
etanol	190 Proof	5%	500	30
A23187	2 mm i DMSO	1 mM	5	5
nigericin *	2 mm i DMSO	10 mm	50	30

* Nigericin kan ikke brukes i berikeutvikling skjerm som parasittene ikke overlever nigericin stimulering; bare bruke nigericin i valideringen av utgående mutanter.

Tabell 1. Egress induktorer brukes i prosedyrer. Fortynnes i 10 ml HBBSc inneholder 25 mg / ml DS for skjermen, eller ingen DS for mutant validering (egress assay). Alle forbindelser fra Sigma-Aldrich.

Discussion

Den beskrives protokollen gir en effektiv metode for å isolere Toxoplasma mutanter med en egress defekt. Vi har lyktes i å isolere mutanter langs ulike stegene i egress vei, hvorav noen har en dobbel invasjon fenotype ^13. Potensielle effekter på invasjon kan bestemmes ved hjelp av såkalt rød-grønn-analysen, som skiller invaderte fra ikke-invaderte parasitter ved differensial antistoff farging ^23,24. For både invasjonen og egress analysene kan det være praktisk å uttrykke en autofluorescent protein markør i cytoplasma av parasittene ^13,22. Men hvis parasittene blir mutagenized allerede uttrykke et fluorescerende protein dette kan forstyrre ytterligere fenotypisk karakterisering av immunfluorescens senere. Det er alltid mulig å legge et fluoriserende fargestoff en mutant etter sin isolasjon. Som beskrevet, er en enkel, ikke-fluorescerende alternativ Diff-Quick farging for passasje.

t "> Historisk har mutagen ENU blitt anvendt til Toxoplasma genetikk ^14. Men ENU fortrinnsvis rettet mot AT basepar ^25, som vi validerte i Toxoplasma (Farrell, Marth, Gubbels et al., innsendt manuskript). Siden hyppigheten av A / T er lavere i aminosyre kodende sekvens enn ikke-kodende sekvens, vil flertallet av mutasjoner indusert av ENU være i ikke-kodende sekvens. imidlertid EMS vanligvis har en preferanse for GC basepar, dvs. koding sekvenser. Det store flertallet av temperaturfølsomme mutasjoner opphav i kodon-skiftende mutasjoner, som er en grunn til å bruke EMS enn ENU.

Selv om en rekke utgående indusere utløsende ulike aspekter av signalveien er beskrevet i Tabell 1, det er andre legemidler som er kjent for å opptre på prosessene som kreves for passasje. For eksempel har koffein vist å indusere microneme sekresjon i ekstracellulære parasitter, som er nødvendig for bådeegress og invasjon ^7,26,27. Imidlertid kan koffein ikke brukes til å utløse egress fra infiserte vertsceller, sannsynligvis fordi koffein ikke effektivt diffus gjennom vertscellen mot parasitter som bor i en vacuolar kupé. Tilsvarende er en egress trigger akkumulering av Abscisic syre, men det er umulig å screene for mutanter i denne veien siden Abscisic syre ikke diffundere inn i vertscellen ^28. Og som angitt i tabell 1, er K +-ionophore nigericin en effektiv egress induser ^5, derimot, trenger parasitter ikke overleve nigericin stimulering. Derfor denne forbindelsen er heller ikke egnet for skjermen. I en alternativ, mer forseggjort screening prosedyre for ionophore mutanter ble det rapportert at mange mutanter med en forsinkelse i ionophore indusert egress overleve langvarig ekstracellulære eksponering for ionophore ^11. Det ble imidlertid ikke utgående mutanter resistente mot ionophore indusert egress isolert i dette skjermbildet, noe som gjør fenotypersvakere. Det er i dag uklart om mutanter med resistens mot langvarig eksponering for andre utgående indusere kan skaffes.

Siden det synes å være flere parallelle veier som kan føre til egress, oppstår spørsmålet om hvilken ville være den mest relevante i en (eksperimentelt) infeksjon. Det ser ut til at immunsystemet angriper på den infiserte cellen er den viktigste utløse av egress ^29. Det er mulig å bruke slike triggere i mutant-skjermen. For eksempel kan CD8 T-celler stimulere egress gjennom både en Fas-mediert og en perforin-mediert veien ^30. Derfor, ved hjelp av en FasL uttrykker humane T-celler som en vertscelle i egress skjermen, kan egress utløses ved inkubasjon med en anti-Fas antistoffer til å berike for mutanter i denne veien.

Slik genetisk kartlegge mutasjoner som ligger bak utgående fenotyper, to ulike tilnærminger finnes i Toxoplasma. I motsetning til genetiske modellorganismer, alleelic segregering av krysset er ikke et alternativ ettersom den seksuelle syklus av parasitten kan bare utløses i tarmen til katten. Bortsett fra den upraktisk og dårlig effektivitet av denne prosessen, parasitten stammer dyrket i laboratoriet svært raskt miste evnen til å infisere katter. For å omgå dette problemet en effektiv villtype cosmid bibliotek complementation tilnærming har blitt utviklet, som kompletterte 90% av celledeling mutanter ^18. I tillegg har vi nylig etablert komplette genomet resequencing protokoller for å identifisere alle mutasjoner indusert i genomet (Farrell, Marth, Gubbels et al., Innsendt manuskript). Vanligvis identifiserer vi 20-70 single nukleotid polymorfismer i kjemisk indusert mutanter. Mellom disse to tilnærmingene har vi vært i stand til å identifisere utløsende mutasjon i alle kjemisk indusert mutanter karakteriserte til dags dato.

Til sammen gir den beskrevne skjermen et allsidig verktøy som lar fremover genetisk disseksjon avde utgående veier. Vi forventer at dette vil identifisere flere komponenter i signalveien kjent for å eksistere basert på farmakologiske data, men som det ikke god kandidat gener kunne identifiseres i Toxoplasma genomet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective
HBSSc (according to Black et al.11):
98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588) 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end) 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end) 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) 84 mg NaHCO3 (10 mM end)