遗传筛选隔离弓形虫宿主细胞的出口突变

Summary

正向遗传学是一个功能强大的方法来解开如何在分子水平

Abstract

广泛，专性细胞内，原生动物寄生虫弓形虫会导致免疫能力受损的患者投机性疾病和先天性感染后会导致出生缺陷。裂解复制周期的特点是通过三个阶段：1。主动入侵的核宿主细胞; 2。宿主细胞内复制; 3。从宿主细胞中活跃的出口。出口机制正在越来越多地被作为一个独特的，高度调节的过程，它是在分子水平上仍然缺乏了解表示赞赏。特点通过使用药物制剂作用于不同方面的途径^1-5已基本出口的信号通路。正因为如此，出口的几个独立的触发已经确定，都收敛于细胞内^钙释放的，也是一个信号，即^6-8宿主细胞的入侵的关键。这种洞察力通知的候选基因的方法而导致的识别fication植物如钙依赖的蛋白激酶（CDPK）涉及出口^9。此外，最近的几次突破，了解出口已用遗传方法（化学^）10-12。结合起来，增加弓形虫遗传无障碍丰富的药理信息，我们最近成立了一个屏幕，允许寄生虫与宿主细胞出口¹³缺陷突变富集。虽然几十年来一直使用N-乙基-N-亚硝基脲（ENU的）或甲磺酸乙酯（EMS）的化学诱变的弓形虫生物学^11,14,15的研究在使用，只是最近有相关基因突变的遗传图谱表型成为常规^{16 -18。}此外，由温度敏感突变体的产生，基本过程可以解剖和底层的基因直接确定。这些突变体表现为野生型宽容的温度（35℃）下，但未能为p在严格的温度（40℃）roliferate作为一个问题的突变的结果。在这里，我们说明了一个新的表型筛选法，隔离温度 ​​敏感的出口型^13的突变体。出口屏幕所面临的挑战是分开非egressed寄生虫，这是由快速重新入侵和宿主细胞寄生虫一般粘性复杂egressed的。根据先前建立的出口屏幕上的生物素化的步骤繁琐的一系列分开^11个外寄生虫内。这种方法还没有产生条件突变，导致弱表型。这里介绍的方法，克服了强烈的依恋，寄生虫，包括糖的竞争对手，硫酸葡聚糖（DS），防止寄生虫宿主细胞坚持¹⁹ egressing。此外，外寄生虫特别是杀害了吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC），叶细胞内寄生虫无恙^20。因此，一个新的表型屏幕，专门隔离寄生虫引起的出口缺陷突变，遗传学的力量现在可以得到充分部署，以揭示宿主细胞出口的分子机制。

Protocol

概观

协议规定首先定义导致的寄生虫杀死70％的议定书（1）诱变剂量。下道工序提供丰富从诱变寄生虫池（协议2，图2）的诱导出口突变的。其次是协议测试中富集池出口突变的发生，或在个别突变体的出口型验证议定书（3）。最后，协议生成丰富的人口，由单一的寄生虫克隆有限稀释（协议）。

1。滴定法诱变

使用双层手套，如要特别小心，工作时，与高致突变性化合物和液体。单独收集液体废物进行妥善处置。

1. 接种的T25组织培养瓶与人包皮成纤维细胞（HFF石英晶）1毫升新鲜裂解弓形虫的细胞融合和增长18-25小时，在37°，C低于5％的CO ₂ ED1培养基（1％热灭活胎牛血清，0.2毫米L-谷氨酰胺，50 U / mL青霉素，50μg/ mL链霉素，0.25微克/毫升两性霉素B的D-的MEM补充）。鲁斯等 。一般生长和卵泡液细胞和寄生虫²¹媒体。
2. 更换介质与10毫升0.1％小牛血清培养基（稀ED1中的D-MEM 1:10）和10分钟离开下_，5％CO2培养箱37℃培养箱（称为“37℃孵化器”，从这里开始） 。
3. 每烧瓶中添加0，12.5，25，50，或100μLENU的（1米股票在DMSO）或EMS（1米股票在DMSO）（诱变工作稀释度为1.25，2.5，5，10毫米，分别）。加入二甲基亚砜100μL每个烧瓶。孵育在37℃孵化器为4小时。
4. 在室温为10秒10毫升冷PBS（4℃预冷）冲洗单层洗三次。
5. 加入5毫升PBS，刮去松散橡胶警察（SCR细胞的单层光圈），26.5Ğ针，通过刮下细胞，成纤维细胞（重型剪刀剪掉的不公开针针轴外）物理删除寄生虫，和聚碳酸酯过滤3.0微米的过滤器。多针通道将增加寄生虫从宿主细胞释放的效率。
6. 计算寄生虫浓度使用血球计数。让寄生虫计数前为在hemocytomer 5分钟定居。
7. 10000寄生在每3毫升（10毫升33,333寄生虫）储层平面分布稀寄生虫。
8. 在6孔板接种3毫升稀释寄生虫（含10,000寄生虫）。连续稀释寄生虫与卵泡液含2.7毫升ED1细胞转移的第一井300μL6孔板合流，3口井的10倍以上。离开板7天，在37℃培养箱原状。
9. 抽吸介质，修复15分钟3毫升/ 100％的乙醇，染色3毫升/结晶紫溶液（12.5克结晶紫在125毫升，500毫升1％草酸铵混合乙醇）为15分钟，以清水冲洗3毫升/ PBS（1分钟）和空气干燥。所有在室温下。
10. 计算斑块和选择诱变剂的浓度实现中暴露出来的寄生虫（70％杀用量：参见图1）30％的存活率。用量的70％杀害历史上已被用于¹⁴和诱导小于100％的基因组点突变（法雷尔，马斯中，Gubbels 等 。，手稿提交）。

2。出口突变富集（图2）

1. 执行诱变以上使用诱变剂剂量诱导70％杀。长大了一种通过在宿主细胞的新瓶的诱变人口。
2. 1的T25，卵泡液合流组织培养瓶感染诱变人口从12万新鲜裂解寄生虫ED1 10毫升的。 5％CO2下孵育2小时在35℃培养箱2和加湿（关于此称为“35℃孵化器”）。
3. 吸中期和10毫升冷PBS冲洗10秒钟，然后加10毫升ED1中期辅以25毫克/毫升硫酸葡聚糖^{（DS）13。} 26小时在40℃培养箱孵育下5％的CO ₂和加湿（关于此称为“40℃孵化器”）。
4. 准备出口促进工作的解决方案。稀释在15毫升猎鹰含有10毫升HBSSc辅以25毫克/毫升的DS管工作浓度的选择出口诱导。预温的稀释液在37℃水浴30分钟。工作浓度，请参阅表1。
5. 寄生虫感染瓶吸介质和添加预热的出口诱导的解决方案。表1所示的时间在37℃培养箱孵育。
6. 吸中期和10秒10毫升冷PBS冲洗，然后加入10毫升ED1补充25毫克/毫升DS和50μM二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC的：广告D 5μL100毫米，PDTC在PBS联合^）13。孵育5个小时，在35℃培养箱。
7. 抽吸介质和冲洗10秒一次10毫升PBS（室温），然后加10毫升ED1中期。放入35℃培养箱瓶，直到寄生虫破坏单层摇瓶，每天。这种恢复大约需要7天。

3。突变表型的出口检测验证

后执行富集屏幕和长大的卵泡液细胞通过丰富的人口，需要通过出口检测^11,13确认表型。 4协议验证后，此法也可用于单个克隆。

1. 接种到含有合流盖玻片（ED1 1毫升每口井的媒介）的卵泡液细胞生长板24孔，每孔20000寄生虫。在35℃培养箱孵育8小时，然后转移到40℃孵化24小时。
2. 1毫升/以及PBS（1洗在室温下0秒）。加入1毫升的出口诱导（包括二甲基亚砜只有阴性对照），前预热和HBSSc稀释和表1中所描述的时间孵育。
3. 抽吸介质，并修复与1毫升/ 100％甲醇在室温下15分钟。
4. 如果父寄生虫表达萤光蛋白的突变，继续步骤＃3.5 ^13。如果母行使用非荧光蛋白表达的寄生虫，染色区分快速染色1分钟在室温¹¹固定盖玻片。
5. 1毫升/以及PBS洗5分钟，在室温24孔板。
6. 对于荧光蛋白表达的寄生虫：快速冲洗盖玻片在DDH _{2 O的} （浸渍），安装和下gelmount幻灯片保护的荧光信号。变化快速染色寄生虫，在100％乙醇洗10秒，让幻灯片上安装之前，空气干燥。
7. 用一个显微镜（荧光）40-60X的目标计算空泡率与住内（见图4）液泡egressed。

4。通过有限稀释克隆出口突变

经过验证的表型富集出口突变使用协议3的人口，的多克隆人口需要被克隆，获得单一的寄生虫克隆。

1. 寄生虫人口计算在血球稀释至每毫升500寄生虫的在ED1中等浓度。
2. 在384包含的卵泡液细胞融合单层板，取代40μL/ ED1使用多通道移液管的介质的介质。如图5所示，四个多克隆种群可以被克隆，每盘如下：吸取40μL/ 1摊薄突变，突变2 C13-C22，成井成井H3-H12 3，突变，突变成井的C3-C12 4成井H13-H22（井年底量是现在的80微升）。使用多通道的吸管，吸管溶胶ution下降了5倍，然后转乘40μl到下面的起始行的行（从C行D或排H到I）。 G排（突变1和2）或排氮（突变体3和4）继续通过这些2倍系列稀释。丢弃从最后一排的额外40μL。在35℃培养箱孵育7-10天，而不会干扰板。
3. 为10-20X单斑的存在客观的，可见'洞'在单层，倒置显微镜检查井。
4. 挑选4个突变井用一个单一的牌匾，并转移到寄生虫卵泡液细胞组织培养瓶合流和ED1介质填充。在35℃孵化成长的寄生虫，摇动烧瓶每天驱散外寄生虫。这通常需要7天。

5。代表结果

诱变剂ENU和EMS不长时间储存​​时稳定。因此，测试诱变股票是关键，以获得可重复性的结果。典型的滴定结果和杀害ENU和EMS的曲线如图1所示。不过，建议执行斑块检测每诱变实验，以确定适当的剂量使用。为了保持在诱变寄生虫人口的多样性，它是重要的出口突变屏幕尽快进行。通常情况下，通过寄生虫进入一个新的瓶是让幸存的寄生虫恢复与屏幕前。应该牢记，这样做会导致突变体的划分。因此，它不能被排除在外，整个过程完成后分离的多个无性系突变体含有完全相同的基因型。为了避免孤立相同的突变，建议多次，每诱变只是一个孤立的单一出口突变，除非他们的表型（如差出口诱导敏感性）从彼此非常不同。另一方面，并​​不是每一个屏幕所需的表型突变体的分离结果。尤其是罕见的Ca ^{2 +}载体A23187耐药表型需要多个突变实验和屏幕孤立单一的出口突变。因此，建议5-10诱变和屏幕实验并行执行。

屏幕的富集能力进行了测试，已知的出口突变体与野生型在不同比例的寄生虫混合。这些混合物受到到屏幕上的突变体富集的人口的发病率进行了评估。利用野生型的寄生虫，表达细胞质利福平的和一个突变线，表达细胞质YFP的发生率可以迅速建立流式细胞仪（图^3）13。结果表明，可以经常丰富，突变表型，纯度80％，由每10,000野生型P 1出口突变寄生虫开始arasites ^13。然而，当出口的突变：野生型的寄生虫开始比例为1:100,000的寄生虫，是孤立的人口只有1-2％（1:100）出口突变。因此，丰富的画面功率是1000倍。由于屏幕开始接种120,000寄生虫通常为70％，这是可行的，我们通常会进行两轮富集。孤立寄生虫长大之间富集轮。此过程会导致100％的突变人口，即使1:1,000,000出口突变：野生型的寄生虫。

出口检测，验证和表征的表型需要一个宿主细胞的感染，使个别空泡分化的多样性。分析与高比例的出口时，作为个人寄生虫散落的条件，这一点尤为重要。如图4所示，如果egressed人口没有得到很好的分离，很容易低估的百分比计数一泡两egressed空泡出口。由于出口和入侵相关的流程，和一些温度敏感的表型显示在较低温度下的温和型的，并非所有的突变也有类似的入侵效率。这样的突变，因此必须在数倍高剂量接种，以获得足够高的液泡密度为准确评估其出口型。此外，一些出口诱导剂并不能有效地刺激出口的空泡包含四个或更少的寄生虫。正因为如此，它是重要的，空泡包含8寄生虫或以上时，开始出口检测。在我们的实验室分离与特定的出口增强的屏幕突变对其他出口促进。通过分析其交叉反应的突变体可以分为不同类别。最后，并非所有的出口突变将是对温度敏感。在特定突变引发步骤释放intracellula之前出口诱导分​​离^{RC-2 +}是容易发生非温度敏感的表型。这是由于并行的途径，可以导致外出前的信号，对细胞内^钙离子的释放收敛。

图1。化学诱变剂的剂量滴定。 A.斑块检测6以及使用各种EMS浓度和不同数量的寄生虫，每口井显示板。白斑是寄生虫斑块形成卵泡液单层，B，C.经曝光（EMS）和ENU（三）不同剂量的寄生虫的存活曲线。评估斑块检测生存。选择诱变实验剂量诱导70％杀。三个独立实验的平均值+ / - 标准差显示。

等 ^13。

图3。典型的富集出口的突变表型。混合成不同比例（X轴）的野生型寄生虫出口突变富集的结果。人口成长后，屏幕上的出口突变表型的比例是绘制在y轴，并通过流式细胞仪（出口突变寄生虫表示细胞质YFP的评估，野生型的寄生虫表示CYtoplasmic RFP）的。三个独立的实验结果是代表红色，蓝色和绿色的数据点。通过从Eidell 等 ^13。

图4。典型的出口检测结果。 。箭头标出四种不同的含4-8寄生虫完整空泡，B。箭头标出四组反映四个独立egressed空泡分散寄生虫。出口诱导钙离子载体A23187（B）或二甲基亚砜作为阴性对照组（A）。寄生虫表达细胞质YFP的^22。

图5。连续稀释克隆寄生虫线 （红，蓝，黄，绿四）多克隆种群连续稀释在一个单一的384板与卵泡液细胞融合。 C行，我收到每10寄生虫2倍稀释，直到行的H和N分别为（40μL+ 40μL）。灰色阴影显示，每口井的寄生虫数量减少。通常情况下，单个克隆发现DF和JL行。

复合	股票	工作浓度	需要μL的T25（10毫升）	孵化时间（分钟）
数码地面电视	在DMSO 1米	5毫米	50	15
乙醇	190证明	5％	500	30
钙离子载体A23187	2毫米在DMSO	1 mM	5	5
尼日利亚菌素*	2毫米在DMSO	10μM的	50	30

*不能用在了丰富的尼日利亚菌素作为寄生虫屏幕不生存尼日利亚菌素刺激;只使用在尼日利亚菌素出口突变验证。

见表1。出口手续诱导。稀释在10毫升HBBSc含有25毫克/毫升DS屏幕，或突变验证（出口法）没有DS。 Sigma-Aldrich公司的所有化合物。

Discussion

所描述的协议提供了一个有效的方法来分离弓形虫突变与出口缺陷。我们已经成功地分离出突变沿各个步骤的出口途径，其中一些具有双重侵袭型^13。使用所谓的红绿法，区别于非侵入寄生虫入侵差抗体染色^23,24，可以决定对入侵的潜在影响。对于入侵和出口检测，它可以方便表示，在寄生虫^13,22细胞质萤光蛋白标记。但是，如果寄生虫诱变已经表达了荧光蛋白，这可能会干扰额外的免疫表型特征稍后。它始终是可能的，其隔离后添加了荧光标记的突变体。如上所述，一个简单的，非荧光替代出口的快速变化，染色。

T“从历史上看，在诱变剂ENU表示已应用于¹⁴ 弓形虫遗传学。然而，ENU的优先目标的AT碱基对^25，这是我们弓形虫验证（马斯·法雷尔，Gubbels 等 。，手稿提交）。由于A的频率/ T是比非编码序列编码的氨基酸序列，由ENU的诱发突变的大多数将在非编码序列。然而，EMS通常有偏爱GC碱基对，即编码序列的绝大部分。温度敏感突变起源于改变密码子的突变，这是一个原因，ENU的超过使用EMS。

虽然出口诱导触发的信号通路的不同方面的各种表1中所述，有已知的出口所需的进程上采取行动的其他药物制剂。例如，咖啡因已被证明诱导微线外寄生虫的分泌，这都需要出口和入侵^7,26,27。然而，咖啡因不能被用来从被感染的宿主细胞触发的出口，可能是因为咖啡因通过向居住在液泡室寄生虫的宿主细胞不能有效地弥漫。同样，一个出口触发脱落酸的积累，但它是不可能在这个通路的突变屏幕因为脱落酸不扩散到宿主细胞的^28。如表1所示，K +载体尼日利亚菌素是一个有效的出口诱导^5，然而，寄生虫不生存尼日利亚菌素刺激。因此，这种化合物也并不适合屏幕。在另一种选择，更精心为载体突变体的筛选程序，它被报道，许多突 ​​变与载体诱导的出口延迟生存长期外暴露载体^11。然而，在此屏幕中分离抗突变载体诱导出口没有出口，使表型较弱。据介绍，目前还不清楚是否可以得到长时间暴露在其他出口诱导与抗突变。

由于出现几个平行的途径，可导致以出口，由此产生的问题，其中之一将是最（实验）感染有关。看来，在受感染的细胞免疫系统的攻击是²⁹出口的主要触发。这是可能使用这种突变屏幕触发器。例如，CD8 + T细胞可以刺激出口既通过Fas介导的和穿孔介导的通路^30。因此，通过使用FasL的表达人类T细胞作为宿主细胞在出口屏幕，出口可以用抗Fas抗体触发，以丰富此途径中的突变体孵化。

转基因映射出口表型相关的基因突变，两种不同的方法弓形虫 。不同的遗传模式生物，所有美国英语学会由道口的隔离是不是因为寄生虫性周期只能在猫的肠道引发的选项。除了从这个过程中，不切实际和效率低下，在实验室中生长的寄生虫株很快失去了感染猫的能力。要绕过这个问题的一个有效的野生型粘粒库互补的办法已经制定，补充90％的细胞分裂突变^18。此外，我们最近建立了完整的基因组测序，以确定基因组中的致突变（法雷尔，马斯中，Gubbels 等 。的协议，手稿提交）。通常情况下，我们确定20-70在化学诱导突变的单核苷酸多态性。这两种方法之间，我们已经能够确定的日期为特征的所有化学诱导突变的致病突变。

两者合计，所描述的画面提供了一个多功能的工具，将允许向前遗传解剖出口途径。我们希望这将识别信号通路的存在，根据药理数据的几个组成部分，但没有很好的候选基因可以在弓形虫基因组确定。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective
HBSSc (according to Black et al.11):
98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588) 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end) 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end) 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) 84 mg NaHCO3 (10 mM end)