分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

Summary

フォワード遺伝学はどのように分子レベルで解明するための強力な方法です

Abstract

広く、偏性細胞内、原虫寄生虫トキソプラズマ原虫は、免疫不全患者に日和見疾患を引き起こす先天性感染症に先天性欠損症を引き起こす。 1：溶菌複製サイクルは3つの段階によって特徴づけられる。核宿主細胞の積極的な侵攻2。宿主細胞内で複製、3。宿主細胞からのアクティブな出口。出口のメカニズムは、ますますまだ不十分分子レベルで理解されている、ユニークで高度に調節されたプロセスとして、高く評価されています。出口の根底にあるシグナル伝達経路は、経路^1-5のさまざまな側面に作用する薬剤の使用によって特徴づけられている。このように、出口のいくつかの独立したトリガーはすべての細胞内Ca ^{2 +、}また、宿主細胞の浸潤^6-8重要である信号のリリースに収束するが同定されている。この洞察は、識別子につながった候補遺伝子アプローチを通知出口⁹に関与するカルシウム依存性プロテインキナーゼ（CDPK）のような植物のfication。さらに、理解の出口における最近のいくつかのブレークスルーが（化学）遺伝的アプローチを^10-12を使用して行われています。 トキソプラズマの増加遺伝アクセシビリティと薬理学の豊富な情報を結合するために我々は最近、宿主細胞の出口¹³の欠陥を持つ寄生虫変異体の濃縮を可能にする画面を設立しました。 N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）またはエチルメタンスルホネート（EMS）を使用して、化学的突然変異誘発はトキソプラズマ生物学^11,14,15の研究に何十年も使用されているが、ごく最近の基礎となる突然変異の遺伝子マッピングを持つ表現型は、ルーチン¹⁶になる^-18。さらに、温度​​感受性変異体を生成することにより、本質的なプロセスは、解剖することができ、基礎となる遺伝子が直接識別されます。これらの変異体は、許容温度（35℃）下で野生型として動作するが、pに失敗する問題の突然変異の結果として、制限温度（40℃）でroliferate。ここでは、温度に敏感な出力表現型¹³に突然変異体を単離するための新たな表現型のスクリーニング方法を示しています。出力画面の課題は、宿主細胞に寄生虫の再侵攻、高速かつ一般的な粘りによって複雑にされた非egressed寄生虫からegressed分離することである。以前に確立された出力画面は、細胞外寄生体¹¹から細胞を分離するビオチン化手順の面倒なシリーズに基づいていた。また、このメソッドは、弱い表現型の結果、条件付き変異体を生成しませんでした。ここで説明する方法は、宿主細胞¹⁹に付着する寄生虫を防ぐことが糖鎖のライバル、デキストラン硫酸（DS）を含めることによって寄生虫をegressingの強い愛着を克服しています。また、細胞外寄生体は、特に細胞内寄生体を残しピロリジンジチオカルバメート（PDTC）でオフに殺される²⁰無傷。したがって、具体的に誘発される出口の欠陥で寄生虫の変異体を単離するための新たな表現型の画面で、遺伝学の力は完全に宿主細胞の出口の根底にある分子メカニズムを解明するために展開することができます。

Protocol

概要

プロトコルは、最初の寄生虫の70％の殺害（プロトコル1）につながる変異原の投与量を定義するために提供されています。次の手順は、突然変異寄生虫プール（プロトコル2、図2）から誘導される出口の変異体を豊かにするために提供されます。これは、濃縮されたプールで出口の変異体の発生率をテストするためのプロトコルが続いている、または個々の変異体（プロトコル3）の出口表現型を検証する。最後に、プロトコルは希釈（プロトコル4）を制限することにより、豊かな集団から、単一の寄生虫のクローンを生成するために提供されています。

1。変異原性の滴定

非常に変異原性化合物や液体を扱うような二重手袋のような特別な注意を、使用しています。適切な処分のために別々に廃液を収集します。

1. 新たに溶解しタキゾイトの1 mlのヒト包皮線維芽細胞（HFF）細胞をコンフルエントT25組織培養フラスコに接種し、37℃で18から25時間の成長度、C 5％未満ED1培地中のCO _2（D-MEM 1パーセントの熱不活性化ウシ胎児血清を補充し、0.2 mM L-グルタミン、50 U / mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25μg/ mlのアムホテリシンB 。）ルースらを参照してください。 HFF細胞や寄生虫²¹の一般的な成長とメディアのために。
2. 10分10 mlの0.1％ウシ胎仔血清培地（D-MEMで希釈ED1 1:10）と（ここでの"37℃のインキュベーター"と呼ばれる）を5％CO ₂下で加湿37℃インキュベーターに残して培地を交換してください。
3. 0、12.5、25、50、または100μlのENU（DMSOで1 Mストック）またはフラスコ当たりのEMS（DMSO中の1Mストックを）（変異原性ワーキング希釈は、それぞれ1.25、2.5、5、および10 mM、となります）を追加します。各フラスコに100μlにDMSOを追加します。 37℃インキュベーター内で4時間インキュベートする。
4. 10ミリリットルの冷PBS（4°Cでプレ冷却）で単分子膜を洗浄することにより、室温で10秒間、3回洗浄します。
5. 5mlのPBSを追加し、ラバーポリスマン（セルSCRと緩い単分子層をこすりアパーチャ）、物理的に線維芽細胞（針を露出しないように頑丈なハサミで針の外側シャフトをオフにクリップ）から寄生虫を除去するために26.5 G針をこすり細胞を渡すと、フィルタは3.0μmポリカーボネートフィルターである。複数の針通路は、宿主細胞から寄生虫を放出の効率が向上します。
6. 血球計算板を用いた寄生虫濃度をカウントします。寄生虫は、カウントする前にhemocytomer中で5分間定着しましょう​​。
7. ED1の3ミリリットル当たり10,000寄生虫（10ミリリットル33333寄生虫が必要とされるため）に寄生虫を希釈する。
8. 希釈した寄生虫（10,000寄生虫を含む）3 mlで6ウェルプレートに1ウェルに接種。シリアルだけでなく、最初の300μlのを転送することにより、2.7ミリリットルED1を含むHFF細胞を6ウェルプレートにコンフルエントで3ウェルで10倍に寄生虫を希釈する。 7日間、37℃インキュベーター内で邪魔されずにプレートにしておきます。
9. 、培地を吸引3ミ​​リリットル/ウェルの100％エタノールで15分間固定し、染色15分間3ミリリットル/ウェルクリスタルバイオレット溶液（500ミリリットル、1％シュウ酸アンモニウムと混合した125ミリリットルのエタノール12.5グラムクリスタルバイオレット）で、3ミリリットル/ウェルのPBS（1分）と空気乾燥ですすいでください。室温でのすべての。
10. プラークをカウントし、変異原性物質の濃度が露出した寄生虫の30％の生存率を達成するために必要な選択（70％が投薬量を殺害：図1を参照）。 70％の用量殺害は歴史的に¹⁴使用され、（ファレル、マルス、Gubbels ら 、原稿提出）ゲノムあたり100未満の点突然変異を誘発されています。

2。出口変異体の濃縮（図2）

1. 70％の死滅を誘導する変異原物質の投与量を使用して上記のように突然変異誘発を行います。宿主細胞の新しいフラスコ内の1つの通過のための突然変異誘発人口は育つ。
2. 10ミリリットルED1の変異人口〜120,000たて溶解し、寄生虫を持つT25、HFFコンフルエント組織培養フラスコに感染します。 5％CO下で35℃インキュベーターで2時間インキュベートします。2と加湿（ "35°Cインキュベーター"と呼ばれるここに至ってから）。
3. 培地を吸引し、10 mlの冷PBSで10秒間リンスし、25 mg / mlのデキストラン硫酸^（DS）13を添加した10ミリリットルED1培地を追加します。 5％CO _2、加湿（ "40℃のインキュベーター"と呼ばれるここに至ってから）の下で40℃インキュベーターで26時間インキュベートする。
4. 出力増強の作業溶液を調製します。 25 mg / mlのDSを添加した10ミリリットルHBSScを含む15mlファルコンチューブに働く濃度で選択した出力インデューサーを希釈します。 37°Cの水浴中で30分間プレ暖かい希釈。使用濃度については、表1を参照してください。
5. 寄生虫感染フラスコから培地を吸引除去し、予め温めておいた出力誘導ソリューションを追加します。表1に示した回、37℃のインキュベーター内でインキュベートします。
6. 培地を吸引し、10 mlの冷PBSで10秒間リンスした後（PDTC 25 mg / mlのDSおよび50μMピロリジンジチオカルバミン酸を添加した10ミリリットルED1を追加します。広告PBS中の100mM PDTCストックのd5μl）を^13。 35°Cのインキュベーター内で5時間インキュベートします。
7. 培地を吸引し、10 mlのPBS（室温）で一回10秒リンスし、10ミリリットルED1培地を追加します。毎日の振盪フラスコ：寄生虫は単分子層を破壊するまで、35℃インキュベーターに戻しフラスコを置きます。この回復は約7日かかります。

3。出口アッセイにより変異体の表現型の検証

濃縮画面を実行し、HFF細胞の1つの通過のために濃縮された集団を成長させた後、表現型は、出力アッセイ^11,13によって確認する必要があります。このアッセイはまた、プロトコル4の後に単一クローンを検証するために使用されるべきである。

1. カバーガラス（ウェル当たり1ミリリットルED1培地）上に成長させたコンフルエントHFF細胞を含む24ウェルプレートにも当たり20,000寄生虫を接種する。 24時間、40℃のインキュベーターに移し、35℃のインキュベーターで8時間インキュベートします。
2. 1ミリリットル/ウェルのPBS（1で洗浄室温で0秒）。 1 mlの出口誘導剤（のみのネガティブコントロールDMSOを含む）、プリ温め、HBSScで希釈し、表1に記載の回インキュベートする。
3. 培地を吸引除去し、1ml /分、室温で15分間、100％メタノールで固定します。
4. 自家蛍光タンパク質を発現する親の寄生虫が突然変異誘発のために使用された場合は、＃3.5 ^13に進み^ます 。非蛍光タンパク質を発現する寄生虫が親回線として使用された場合、室温¹¹で1分間染色をDiff-Quickで固定カバースリップを染色。
5. 室温で24ウェルプレートには1ml /ウェルのPBSで5分間洗浄します。
6. 蛍光タンパク質を発現する寄生虫の場合：迅速のddH ₂ O（浸漬）にカバースリップをすすぎ、蛍光シグナルを保護するためにgelmount下のスライドにマウントします。をDiff-Quick染色された寄生虫のために、100％エタノールで10秒間洗浄し、スライド上にマウントする前に空気乾燥させます。
7. と（蛍光）顕微鏡を用いて40-60倍の目的は、液胞の割合は（図4を参照）内滞在胞対egressedカウントされます。

4。限界希釈法により出口変異体のクローンを作成する

プロトコル3を使用して、濃縮出口変異体集団の表現型の検証後、ポリクローナル人口は、単一の寄生虫のクローンを得るためにクローン化する必要があります。

1. 血球に寄生虫の人口をカウントし、ED1培地中のmlあたり500寄生虫の濃度に希釈する。
2. HFF細胞のコンフルエントな単層を含む384ウェルプレートでは、マルチチャンネルピペットを用いて40μl/ウェルED1の培地で培地を交換してください。図5に示すように、4つのポリクローナル集団は、次のようにプレートごとにクローン化することができます。ピペットを40μl/ウェル、ウェルC3-C12、ウェルに変異2 C13-C22、井戸H3-H12に変異体3、および変異体に希釈した変異体の1井戸H13-H22に4（井戸のエンドボリュームは80μlのです）。ゾルは、マルチチャンネルピペット、ピペットを用いてution上下に5回繰り返した後、開始行の下の行（行のCからDまたは行Hに私に）40μlを転送します。行G（変異体1および2）または行N（変異体3と4）を介してこれらの2倍連続希釈を続行します。最後の行から余分40μlを破棄します。プレートを乱すことなく、7〜10日のために35°Cのインキュベーター内でインキュベートします。
3. 単分子層の "穴"として表示され、単一のプラークの存在のための10-20X、客観的に倒立顕微鏡上に井戸を確認してください。
4. シングルプラークを有する変異体当たり4ウェルを選び、HFF細胞を用いた組織培養フラスココンフルエントに寄生虫を転送し、ED1培地で満たした。 35°Cのインキュベーター内で寄生虫を育つ。外の寄生虫を分散させるために毎日フラスコを振る。これは一般的に7日間かかります。

5。代表的な結果

長期間にわたって保存した場合、変異原ENUとEMSが安定していません。したがって、変異原性のパワーをテストする株式市場は、再現性のある結果を得ることが重要です。 ENUとEMSの両方のための典型的な滴定結果と殺害曲線を図1に示されています。しかし、適切な用量が使用されていることを確かめるために、すべての突然変異誘発実験のためにプラークアッセイを行うことをお勧めします。突然変異寄生虫集団の多様性を維持するためには、できるだけ早く出口変異画面を続行することが重要です。通常、新しいフラスコに寄生虫の一節は、生き残った寄生虫は、画面を進めて行く前に回復させるために実行されます。それは、これを行うと、変異体の分裂をもたらすことに留意する必要があります。したがって、それは全体の手順を完了した後、隔離された複数のクローンの変異体は全く同じ遺伝子型が含まれていることを除外することはできません。その表現型（例えば、差動出力インデューサーの感度）がない限り、それは、突然変異ごとに単一の出力変異体を分離することをお勧めされているのと同じ変異を複数回分離を避けるために互いに非常に異なって。一方、所望の表現型と変異体の分離ではないすべてのスクリーンが表示されます。特に、Ca ^{2 +非}イオノフォアA23187耐性表現型はまれですし、単一出力の変異体を単離するために、複数の突然変異誘発実験と画面を必要とします。したがって、それは並列で5-10変異誘発、画面の実験を行うことをお勧めします。

画面の濃縮パワーが異なる比率で野生型原虫で知られている出口変異体を混合することによってテストされています。これらのミックスは、画面に供した、濃縮集団における突然変異の表現型の発生率を評価した。細胞質YFPを発現する野生型細胞質RFPを発現している寄生虫や変異体ラインを使用して、発生率はすぐに¹³フローサイトメトリー（図3）によって確立される可能性があります。結果は、変異体の表現型は、定期的に万野生p型ごとに1つの出力変異寄生虫で起動することによって80％の純度に濃縮することができることを示しているarasites ^13。しかし、出口変異体時：野生型寄生虫の起動率が1:100,000寄生虫であり、孤立した個体群はわずか1〜2％（1:100）出口変異体である。したがって、画面の濃縮パワーは1000倍です。画面は、通常、70％が生存している120,000寄生虫の接種で始まるので、通常は濃縮2つのラウンドを実行します。隔離された寄生虫は濃縮ラウンドの間に栽培されています。野生型寄生虫：1:1,000,000出口変異体で始まる場合でも、この手順は、100％変異体集団につながります。

表現型を検証し、特徴付けるために出口アッセイは、個々の液胞の分化を可能にする宿主細胞の感染多重度を必要とします。個々の寄生虫が周りに散らばっているように、出力の割合が高いとの条件を分析するとき、これは特に重要です。 egressed集団が十分に分離されていない場合は、図4に示すように、それが割合を過小評価するのは簡単です出口のいずれかの液胞のように2つegressed胞を計数することによって。出口と侵略が関連するプロセスであり、いくつかの温度感受性の表現型は、より低い温度で穏やかな表現型を示すので、すべての変異体は、同様の侵入効率があります。このような変異体は、したがって、その出力の表現型を正確に評価するために十分に高い液胞の密度を得るためにいくつかの倍の投与量で接種しなければなりません。さらに、いくつかの出口誘導を効率的に4寄生虫以下を含む小胞の出口を刺激しない。このように、それが出口アッセイを開始するときに液胞が8寄生虫以上を含むことが重要です。私たちの研究室では、画面の変異体は、他の出力増強に対する特定の出力増強に絶縁されている。それらの交差反応性をプロファイリングすることにより変異体は、異なるクラスにまとめることができます。最後にではなく、すべての出力変異体は温度に敏感になります。特定の変異体ではintracellulaのリリース前にステップをトリガ出力誘導で分離されたRのCa ^{2 +}非温度感受性の表現型になりやすいです。これは、細胞内Ca ^{2 +}の放出の信号が収束する前に、出口につながる可能性が並列経路によるものである。

図1。化学変異原物質の投与量滴定。 A.プラークアッセイは、様々なEMS濃度と同様に示されたあたりの寄生虫の様々な番号を使用して、6ウェルプレートで実行されます。白い斑点は、HFF単層に形成された寄生虫のプラークです。寄生虫のA、B、Cの生存曲線は、EMS（B）とENU（C）の様々な用量に暴露する。生存率はプラークアッセイにより評価した。 70％の殺害を誘発する用量は、突然変異誘発実験のために選択されています。 3つの独立した実験の平均値は+ / - 標準偏差が表示されます。

らから採用された^13。

図3。出口変異体の表現型の典型的な濃縮。様々な比率（x軸）で野生型原虫に混合出力変異体の充実の結果は。画面の後に育った人口の出口変異体の表現型の割合がy軸にプロットされており、フローサイトメトリーにより評価した（出口変異原虫は細胞質YFPを発現し、野生型原虫はCYを表明toplasmic RFP）。 3つの独立した実験の結果は、赤、青、緑のデータ点で表されます。 Eidell らから採用された^13。

図4。出口アッセイの典型的な結果。矢印は4月8日、寄生虫を含む4つの異なる無傷液胞をマークします。Bは 。矢印は、4つの独立したegressed胞を反映した散乱寄生虫の4つのグループにマークを付けます。出口は、ネガティブコントロールとしてA23187（B）またはDMSO（）によって誘導された。寄生虫は細胞質YFP ^22を表現^{しています} 。

図5。クローン寄生虫線の希釈。四ポリクローナル集団は（赤、青、黄、緑）シリアルHFF細胞との融合性単384ウェルプレート中で希釈されています。行Cと私はよく当たり10寄生虫を受信し、それぞれの行HとNまで、（40μL+ 40μl）を2倍に希釈する。グレーの色合いは、ウェルあたりの寄生虫数の減少を示しています。通常は、単一のクローンが行DFとJLに記載されています。

化合物	株式	ワーキング濃度	T25（10ml）をするために必要な液	インキュベーション時間（分）
DTT	DMSO中の1 M	5mMの	50	15
エタノール	190プルーフ	5パーセント	500	30
A23187	DMSO中の2 mMの	1μM	5	5
nigericin *	DMSO中の2 mMの	10μM	50	30

* nigericinは豊かでは使用できません。寄生虫のようなMENT画面がnigericin刺激を存続はありません。だけ出口変異の検証にnigericinを使用しています。

手順で使用する表1。出口誘導。 25 mg / mlの画面のDS、または変異検証（出口アッセイ）のためのDSを含む10ml HBBScで希釈します。 Sigma-Aldrich社からのすべての化合物が挙げられる。

Discussion

記述されているプロトコルは、出口の欠陥とはトキソプラズマの変異体を単離するための効率的な方法を提供する。デュアル侵略の表現^13を持っているそのうちのいくつかは我々が正常に、出力経路の様々なステップに沿って変異体を単離した。侵略の潜在的な影響は、差動抗体染色^23,24によって非侵略寄生虫から侵入区別いわゆる赤緑のアッセイを用いて決定することができる。侵略と出力の両方のアッセイのためには、寄生虫^13,22の細胞質内に自家蛍光タンパク質マーカーを発現するのに便利かもしれません。寄生虫が誘発されている場合は、既にこれは後に免疫による追加の表現型の特性と干渉する可能性蛍光タンパク質を発現する。これは、その分離した後に変異体に蛍光マーカーを追加することは常に可能です。記載されているように、単純な、非蛍光性の代替は、出力用をDiff-Quick染色です。

t "は>歴史的に、変異原ENUは、 トキソプラズマ遺伝学¹⁴に印加されていますが、ENUは、優先的に我々はトキソプラズマで検証塩基対²⁵でターゲット（ファレル、マルス、Gubbels ら 、原稿提出）。の周波数以来、 / Tは非コーディング配列以外のアミノ酸をコードする配列に低くなり、ENUにより誘発される突然変異の大部分は、非コード配列になります。しかし、EMSは通常、すなわちコーディング配列、GCの塩基対の優先順位を持っています。大半の温度感受性変異はENUを介してEMSを使用する理由であるコドンを変える変異に由来する。

シグナル伝達経路の様々な側面をトリガ出口誘導の様々な表1に記載されていますが、出力に必要なプロセスに基づいて行動することが知られている他の薬剤があります。例えば、カフェインの両方に必要とされる、細胞外寄生体で短系の分泌を誘導することが示されている出力および浸潤^7,26,27。しかし、カフェインはおそらく、感染した宿主細胞からの出力をトリガするために使用することはできませんので、カフェイン液胞コンパートメント内に存在する寄生虫に向かって宿主細胞を介して効率的に拡散しない。同様に、1出力トリガは、アブシジン酸の蓄積であるが、アブシジン酸は、宿主細胞²⁸内に拡散しないので、この経路の変異体をスクリーニングすることは不可能である。と、表1に示すように、K +-イオノフォアnigericinは、効率的な出口誘導^5、しかし、寄生虫はnigericin刺激に耐えられないんです。したがって、この化合物はまた、画面には適していません。イオノフォア変異体の代替、より精巧なスクリーニング法では、イオノフォア誘発出力の遅延を持つ多くの変異体はイオノフォア^11〜長期外暴露を生き残ることが報告されている。しかし、誘導出口をイオノフォアに耐性ない出口変異体は表現型を作り、この画面で分離されなかった弱い。それは他の出口誘導に長時間暴露への耐性を有する変異体を得ることができるかどうか現時点では不明である。

出口につながることができますいくつかの平行な経路があるように表示されますので、質問は1つが（実験的）感染症の中で最も関連するであろうこれまでのように発生します。それは、感染した細胞上の免疫系の攻撃は、出口²⁹の主要なトリガーであることが表示されます。変異体の画面でそのようなトリガを使用することが可能です。例えば、CD8 T細胞は、Fas媒介とパーフォリン媒介経路^30の両方を介して出口を刺激することができます。したがって、出力画面の宿主細胞としてヒトT細胞を発現するFasLのを使用して、出口は、この経路の変異体を豊かにするために抗Fas抗体とのインキュベーションによってトリガすることができます。

遺伝的に出口の表現型の基礎となる変異をマッピングするには、2つの異なるアプローチがトキソプラズマでご利用いただけます。遺伝的モデル生物とは異なり、すべての交差点でelic分離は、寄生虫の性周期にのみ猫の腸内でトリガすることができますので、オプションではありません。別に非現実的で、このプロセスの効率が悪いから、ラボで育った寄生虫株は非常に迅速に猫に感染する能力を失う。この問題を回避するための効率的な野生型のコスミドライブラリーの相補性アプローチは、細胞分裂変異体¹⁸の90％を補完され、開発されました。さらに、我々は最近、ゲノムに誘導されるすべての変異を識別するためのプロトコルを再配列の完全なゲノムを設立（ファレル、マルス、Gubbels ら 、原稿は、提出された）。一般的に我々は、化学的に誘発される変異体の20から70の一塩基多型を識別します。これら二つのアプローチの間に我々はこれまでに特徴付けられるすべての化学的に誘発された変異体の原因となる変異を識別することができました。

一緒に、説明画面は、前方の遺伝的解剖を可能にする多彩なツールを提供しています出口経路。我々は、これは薬理学的データに基づいて存在することが知られているシグナル伝達経路のいくつかのコンポーネントを識別します期待しますが、そのためには良い候補遺伝子は、 トキソプラズマのゲノムで同定されなかった。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ENU	Sigma-Aldrich	N3385	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	1 M Stock in DMSO, store at -20 °C
Dextran Sulfate	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	100 mM Stock in PBS
Diff Quick	EMD Chemicals	65044-93
Filter holder	Cole-Parmer	540100
3 μm polycarbonate filter	Whatman Schleicher Schuell	110612
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
CO2 incubators	Various manufacturers		Humidified, 5% CO2, at 35, 37 and 40 °C
Fluorescence microscope	Various manufacturers		Ideally inverted, wide-field with 63x or 100x oil objective
HBSSc (according to Black et al.11):
98.0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone catalog number SH30588) 100 μl 1M MgCl2 (100 mM end) 100 μl 1M CaCl2 (100 mM end) 2.0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) 84 mg NaHCO3 (10 mM end)