Summary
細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。
Abstract
このプロトコルは、 シロイヌナズナ実生の蛍光顕微鏡ベースのスクリーニングを説明し、分泌経路内の特定のタグ付き蛍光マーカーの細胞内分布を変化させる劣性変異をマッピングする方法について説明します。 シロイヌナズナたため、そのゲノムサイズの遺伝学的研究のための強力な生物学的なモデルであり、世代時間、王国間の分子機構の保全。分子マーカーに基づいて、従来の方法に代わるもので突然変異をマッピングするためのアプローチとして、ジェノタイピングアレイは、比較的高速であるため有利であると本当に短い時間枠のいくつかの変異体のマッピングを可能にすることができる。この方法は、植物のどのオルガネラの整合性に影響を与えることができるタンパク質の同定を可能にします。ここでは、一例として、我々は小胞体（ER）の整合性のための重要なマップの遺伝子に画面を提案する。我々のアプローチは、しかし、簡単に他の植物の細胞小器官に拡張することができます（例えば、1,2を参照）ため、他の細胞内構造を支配する分子基盤を理解する重要な一歩を表しています。
Protocol
1。 EMSトリートメント
シロイヌナズナの種子は、T /変異が5月7日にC / Gの結果ゲノムのC-to-T変化に誘導される変異剤エチルメタンスルホン酸（EMS）3,4、として使用して変異しています。
- 細胞小器官蛍光マーカー（具体的には、本研究ではssGFPHDEL（シグナル配列-GFP-HDELテトラペプチド）は、ERのマーカーとして使用されている）を運ぶ0.8グラムシロイヌナズナ種子（〜40,000シーズ）を量る。
- 50 mlのファルコンチューブに種子を譲渡し、25ミリリットルの蒸留水を追加します。
- 0.2％（v / v）のエチルメタンスルホン酸塩を追加します。
- 低速でミキサーをnutatingで16時間インキュベートします。
- 液体を吸引除去し、EMSを不活性化するために1.0 M NaOHを含むフラスコにそれを破棄します。
- 近くに、種子を含むファルコンチューブに25mlの水を追加し、5回反転の種子を洗浄するために、すべての種子が定着するまで待機し、その後1.0 Mナトリウムに水を吸引して捨てるフラスコOH。
- 最大10回まで洗浄工程を繰り返します。
- 最後の洗浄後、水の最小量の種子を再懸濁する。
- 10％の漂白剤の25 mLを加え、シード滅菌に進み、30秒間激しく振る。種子が底に沈殿させ、その後、漂白剤を捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水を捨て、25mlの70％エタノールを追加します。 30秒間チューブを振る。種子が底に沈殿しましょう。エタノールを捨て、滅菌水25 mLで洗浄してください。滅菌水で2回洗浄を繰り返し、その後3 MMろ紙を含むプラスチック製のペトリ皿に種を注ぎ、ボンネットの下に乾燥させます。 2日間4℃で保管してください。
- ½MS phytagel（MurashigeおよびSkoog培地の半分の濃度）、150 mmのペトリ皿（プレート〜250から300種）のプレートの種子を。
- 土壌に移植し、2週間プレート上にM1の種子を栽培しています。
- M2線（1000独立した行）を生成するために、個々のM1植物からM2の種子を収集します。
このセクションでは、以前の8の説明に従って、共焦点または蛍光顕微鏡で苗の観察を説明します。
- 各M2ラインから起算して六十種は、プラスチック製のペトリ皿に7〜10日間栽培されている½MS phytagel、同じプレートでも（コントロール）EMS-未処理の5本の苗木を栽培されています。
- 5〜10子葉は、顕微鏡スライド上にレンズ（40X）に向かって背軸側でマウントし、カバーガラスで囲まれています。
- それぞれの子葉は、オルガネラのマーカーのいずれかに変更された細胞内分布の蛍光の下で、皮質から内側領域に観察される。
- 陽性植物は、土壌に移植され、その種子はM3世代における変異体の表現型を確認するために再度収集し、スクリーニングされる。
- 野生型ゲノムに少なくとも3回は、おそらく共同戻し交配を通して汚染のバックグラウンドの変異を削除します。希望するオルガネラの蛍光マーカーをntaining。
- 母植物から、細かいハサミや鉗子を使用すると、成熟したsiliquesを削除して、開いた花。
- 分裂組織から小さすぎるつぼみを削除します。
- 1花芽を開き、すべての葯を削除するには、花弁とがく片の間に鉗子の一組の先端を挿入します。
- 鉗子のいずれかのペアを使用すると、父親の工場から開いている成熟した花を取ると去勢植物の柱頭に葯をこする。
3。マッピング
このセクションでは、伝統的なマッピング方法10,11と比較する場合に高速ですBorevitz 9時から変更されたプロトコルを使用して、劣性突然変異をマッピングする方法を本質的に説明しています。このアプローチは、単一のアッセイ12に多数の単一の機能多型（SFPを）検出する能力と高密度のオリゴヌクレオチド配列を使用します。アフィメトリクスシロイヌナズナATH1のGeneChipのアレイを使用することも可能です約24,000の遺伝子を分析します。変異を示すF 2個体のプールは、同じ分離集団内で収集された野生型のF 2植物のプールと比較されます。その後、変異は変異体プールが変異遺伝子の対立遺伝子が濃縮されている領域にマッピングされ、その結果、同じ地域に野生型プールは、野生型の親の対立遺伝子13の豊かなことになります。
- ゲノムDNA（3μg）をQiagen社DNeasy植物ミニキットを使用して、ホモ接合変異体コロンビア（M3）から抽出され、イルミナGenome AnalyzerのII（GA II）14シークエンシングのために提出されています。
- ホモ接合変異体コロンビア（M3）は、マッピング集団を生成するためランツベルクエレクタと交配されています。
- マッピングは、異常な表現型と野生型の表現型とF2植物の同じ数を示す70、最大100 F2個体で実行されます。
- 各工場から穴パンチを使用してリーフディスク（0.60 mm）を収集します。ザリーフディスクは、DNAの類似した量を持っていることを確認するため、同じ年齢の葉から収集する必要があります。サンプルは、個別に、またはグループ内のゲノム抽出のために処理することができます。この場合、それは最終的にはゲノムDNAを抽出する必要があり、そこからより少ないエッペンドルフチューブを持つようにそれぞれのエッペンドルフチューブに5〜10サンプルを収集することが可能です。
- MasterPure植物の葉のDNA精製キット（EPICENTRE）は、ゲノムDNAを抽出するために使用されています。各試料から得られたゲノムDNAは、光度計で定量されています。
- 各サンプルからのゲノムDNAの同量は、植物のDNAを300 ngの（〜30μL）の合計に一緒に入れて、60μL2.5Xランダムプライマー溶液を加え、[125 mMのトリス-HCl（pH6.8）を、12.5mMののMgCl 2、25mMの2 - メルカプトエタノール、750μg/ mlのオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ランダム八量体）]（Bioprimeキット）と42μLの水（最終容量132μL）。
- 5から10分> 95°Cで変性はDNAが。
- 氷の上で涼しい。
- 各denatuへ赤のDNAは、[1 mMのビオチン-14-dCTPを、1mMのdCTPを、2mMのdATPを、2mMのdGTPを、10mMトリス-HCl（pH7.5）で2 mMのdTTPを、1mMのNa2EDTA]ビオチンdCTPで15μL10XのdNTPミックスを追加する（Bioprimeキット）、3μLクレノウポリメラーゼ（Bioprimeキット）で完了します。
- 25℃で一晩インキュベートする
- ミックス、次の日に、15μlの3 M NaOAc、400μL冷100％エタノールを追加します。
- 1時間-80℃でインキュベートし、その後15分間20500×gで回転、上清を除去し、500μLの冷75％EtOHで洗浄する。
- 10分間、20500×gで遠心する。
- 100μLの水で10分間再懸濁し、37℃で乾燥したDNAペレット。
- ゲル（ 図2）収量と品質を確認するために5μLを使用しています。
- のために、野生型と変異型のGeneChip ATH1シロイヌナズナゲノムアレイハイブリダイゼーション反応をラベリングの95μLを送信します。
- Rソフトウェア（使用してアレイがスキャンされ、得られた。CELファイルが解析されhttp://www.r-project.oをRG /）。
- Rのソフトウェアをインストールし、プログラムを開き、次の文字列を貼り付けます。
ソース（ " http://bioconductor.org/biocLite.R "）
biocLite（）
その後、リターンキーを押して、これは標準BioConductorのパッケージ（インストールされますhttp://www.bioconductor.org ）。 - デスクトップ上の新しいフォルダには、次のWebサイト（からダウンロードhttp://www.naturalvariation.org/methods ）ファイル：
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
ファイルColLerCEL.zipが解凍され、結果のファイルは新しいフォルダに貼り付ける必要があります。 - wildtype.CELとmutant.CELにあなたのGeneChipの実験から得られたデータの名前を変更します。
- あなたのGeneChipのデータ（wildtype.CELは 、今コピーします。あなたのフォルダにmutant.CEL）。
- クリックして "その他"とクリックします。オープンR、Mac用） "作業ディレクトリを変更します。"クリックして "ファイル"から "チェンジディレクトリ"：B）PC用
- Macの場合）：ファイルを含むフォルダを選択します。 "ワークスペース"、 "ロード·ワークスペース·ファイルをクリックします。、ファイルを" PC用を選択しath1V5.RData、b）に上記のファイルを含むフォルダを選択し、クリックして""それから"ロードワーク"とath1V5.RDataを選択します 。
- メモ帳を使用してreadCEL.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする
- メモ帳を使用してSFP.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする
- メモ帳を使用してMap.Rを開いて、Rにテキスト全体をコピーする
- コンソールウィンドウに次のメッセージが表示されます。
X染色体は、MB YZを制限する
このリンクを貼り付けTAIRで検索遺伝子
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y＆最後= Z - インターネットブラウザにリンクをコピーして貼り付けます。ウィンドウが表示され、ファイルを開くか保存するかを尋ねてきます。あなたは、保存を選択する必要があります。ファイル名を選択し、[保存]をクリックし、 "。XLS"拡張子を添付してください。
- ファイルを開き、あなたの変異体の座標を（結果はグラフィカルに、図3に表される）を見つけることができます。 "XLS"。
- 組み立てイルミナにマップされた領域内の単一塩基多型のうち、特定のEMSの遷移4を識別する変異体ゲノムの読み取り。標準的な手順15を使用して、野生型遺伝子（s）で形質転換して変異体の表現型を補完します。
4。代表的な結果
図1は、共焦点顕微鏡のスクリーニングを使用して、分泌経路の変異体の同定に使用されるアプローチを示しています。 図2は、アレイハイブリダイゼーションのために標識されたゲノムDNAの典型的な準備を示しています。。 図3に、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノム配列から得られたデータを分析した後、予想される典型的な結果が提示されます。
図1。ssGFPHDEL（ERマーカー）（1）を発現するシロイヌナズナ形質転換植物は、EMS処理（2）のための十分な種子を生産するために培養した。 EMSで処理した種子は、その後M1植物（3）を生成するために播種した。各M1プラントは別の行を表しており、種子は、それらの各々から別々に収集した。 M2種子は½MS基板（4）上に播種し、共焦点顕微鏡（5）でER形態の欠陥についてスクリーニングした。スクリーニング時に我々は、野生型ERの形態（6）不良ER表現型（7）を示す植物を保存すること植物を発見した。これらの植物は、M3世代を取得し、表現型（8）を確認するために、成長させた。 M3の植物からのゲノムDNAは、Solexaイルミナシーケンス（）を使用した。同じ植物また、F2マッピング集団（b）を得るためにLER-WTとの交雑のために使用されていました。
図2。Bioprimeランダムラベリング反応（100μL、5μL）をアガロースゲル1％ロードされていました。レーンは、野生型F2植物のプールからのものであり、レーンBは変異体F2植物のプールからのものです。 （マーカーはNEBから、1 kbのDNAラダー-N3232）です。
図3図は、GeneChipのシロイヌナズナATH1ゲノムアレイハイブリダイゼーションを使用して、COL-0突然変異のマッピングの例を表しています。この例では変異は染色体1、縦棒で区切られて位置しています。横棒は、検出のしきい値を表しています。
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Discussion
ここでは、内膜変異体の同定のための共焦点顕微鏡ベースのスクリーニングを説明しました。このアプローチは、簡単に特定の蛍光タンパク質マーカーが用意されているセルの他の器官に拡張することができます。画面は、ターゲット細胞小器官で、またはマーカーを含むことが想定されていない細胞小器官のいずれかに蛍光マーカーの異常分布を示す変異体の同定に基づいています。それぞれ、これらの変異体は正常細胞小器官の間でマーカーを転位することができませんマーカーをsubcompartimentalizeする細胞小器官の機能のいずれかが侵害されている集団や突然変異体を表しています。しかし、その他は開発の後期段階での表現型を示した。スクリーニングの間に我々はいくつかの変異体は発芽7日後には早くも開発の初期段階で表現型を示したことに気づいた。これは、変異の開発に依存した表現を含むいくつかの理由、にリンクされているかもしれませんが対立遺伝子（s）は、これは植物が潜在的に興味深い突然変異体が破棄されていないことを保証するために（少なくとも7〜14日）は、異なる成長段階で検討すべきであることを示唆している。
このプロトコルで記述されたアプローチは、私たちは、古典的なマッピング方法に比べて比較的短い時間で遺伝子をマッピングすることができます。実際には、GeneChipのアレイに使用するF2集団の個体の十分な数を集めることは古典的なファインマッピングの手順に必要なF2植物に比べて比較的少量の時間を必要とします。しかし、観察すべき重要なステップがあります。 F2集団のサンプルを示すかどうかの表現型を示すの選択は、最終的な結果に誤差が生じることが誤って間違った表現型を有する植物の小さな数に加えているので、慎重に行うべきである。これは主にラフマッピングに使用されるF2集団は非常に小さいという事実にリンクされています。この理由は、その植物の選択は、EIT彼女は、表示または表現型が発芽した後、同じ日に毎回行われるべきでは表示されません。我々は上述したように、表現型の外観が成長にリンクすることができ、ためである。考慮すべき別の重要な点は私達にバリアントを含む読み込みのパーセンテージのような重要な情報を提供するプログラムによって生成された次世代データpostalignment、注意深く見ることです。ヘテロ接合体変異に期待される理論値は50％前後で、これはホモ接合体変異のために、100％年ごろである間の配列の50％がバリアントが含まれていることを意味します。残念なことにpostalignment後の状況は、理論値から遠く離れてすることができます実際にはの割合は、ヘテロ接合のためにバリアントを含む読み取るホモ接合体16の60から100パーセントから間20から80パーセントから変えることができます。そのため、重要な一塩基多型（SNP）を欠場するのではなく、それが再100％未満の割合で変異体を破棄しないようにすることが重要であるバリアントの広告。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
我々は化学科学、地球科学とバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学、科学局、米国エネルギー省（受賞番号DE-FG02-91ER20021）と国立科学財団（MCB 0948584）（FB）の事務局のサポートを認める。私たちは、原稿を編集するためのMSカレン鳥に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
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