Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity

Published: April 13, 2012 doi: 10.3791/3809

Summary

En grundlæggende søgen i cellebiologi er at definere de mekanismer, der ligger til grund for identiteten af ​​de organeller, der gør eukaryote celler. Her har vi foreslår en metode til at identificere de gener der er ansvarlige for den morfologiske og funktionelle integritet af planteceller organeller med fluorescensmikroskopi og næste generation sekventering værktøjer.

Abstract

Denne protokol beskrives et fluorescensmikroskop-baseret screening af Arabidopsis kimplanter og beskriver hvordan man omsætter recessive mutationer, der ændrer den subcellulære fordeling af en specifik mærket fluorescerende markør i den sekretoriske reaktionsvej. Arabidopsis er en kraftig biologisk model for genetiske undersøgelser på grund af dets genom størrelse, generationstid, og bevarelse af molekylære mekanismer blandt kongeriger. Matrixen genotype som en fremgangsmåde til at kortlægge mutation i alternativ til den traditionelle metode er baseret på molekylære markører er fordelagtig, fordi det er relativt hurtigere og tillade kortlægning af adskillige mutanter i en meget kort tid. Denne fremgangsmåde tillader identifikation af proteiner, der kan påvirke integriteten af ​​organel i planter. Her som et eksempel, foreslår vi en skærm til at mappe gener er vigtige for integriteten af ​​det endoplasmatiske reticulum (ER). Vores fremgangsmåde kan imidlertid let udvides til andre vegetabilske celleorganeller(Se for eksempel 1,2), og repræsenterer således et vigtigt skridt mod at forstå det molekylære grundlag for andre subcellulære strukturer.

Protocol

1. EMS Behandling

Arabidopsis thaliana frø mutageniseres ved som mutagen middel ethylmethansulfonat (EMS) 3,4, som inducerer i genomet C-til-T-ændringer resulterer i C / G til T / A mutationer 5-7.

  1. Afvej 0,8 g Arabidopsis frø (ca. 40.000 frø) bærer organel fluorescerende markør (specifikt i denne undersøgelse ssGFPHDEL (signalsekvens-GFP-HDEL tetrapeptid) er blevet anvendt som en ER markør).
  2. Overføre frø i et 50 ml Falcon-rør, hvorefter der tilsættes 25 ml destilleret vand.
  3. Tilsæt 0,2% (v / v) ethylmethansulfonat.
  4. Inkuber i 16 timer på nutating blander ved lav hastighed.
  5. Suge væske og skille den i en kolbe indeholdende 1,0 M NaOH for at inaktivere EMS.
  6. Tilsæt 25 ml vand til Falcon rør, der indeholder frø, tæt, og invertsukker 5 gange for at vaske frøene; vente, indtil alle frøene har slået sig ned, og derefter suge vand og kassér i 1,0 M Na OH kolbe.
  7. Gentage vasketrinet op til 10 gange.
  8. Efter den sidste vask-re suspendere frøene i en minimal mængde vand.
  9. Fortsæt til frø sterilisering tilsætning af 25 ml 10% blegemiddel, rystes kraftigt i 30 sekunder. Lad frø afregne til bunden, så hæld blegemiddel og skylles med 25 ml sterilt vand. Hæld sterilt vand og tilsættes 25 ml 70% ethanol. Rysterør i 30 sek. Lad frø afregne til bunden. Hæld ethanol og skylles med 25 ml sterilt vand. Gentages to gange vask med sterilt vand, derefter hældes frø på en plast Petri-skål indeholdende 3 mM filterpapir og lad det tørre under hætten. Opbevares ved 4 ° C i 2 dage.
  10. Plate frøene på ½ MS phytagel (halv koncentration af Murashige og Skoog medium), 150-mm petriskål (ca. 250-300 frø til plade).
  11. Grow M1 frø på plade i 2 uger, og derefter transplantere i jorden.
  12. Saml M2 frø fra de enkelte M1 planter til at generere M2 linjer (1000 uafhængige rederier).
ove_title "> 2. Konfokal Screening af M2 og M3 Populations

I dette afsnit beskriver vi observation af frøplanter med en konfokal eller fluorescensmikroskop som beskrevet tidligere 8.

  1. Tres frø fra hver M2 linie dyrkes i 7 til 10 dage på plast-petriskåle, ½ MS phytagel, på den samme plade dyrkes også 5 kimplanter EMS-ubehandlet (kontrol).
  2. Fem til ti kimbladene er monteret med abaxial side mod linsen (40X) på et objektglas og indesluttet med et dækglas.
  3. Hver cotyledon iagttages fra den korticale til midterområdet under fluorescens for en ændret subcellulære fordeling af organel markør.
  4. Positive planter udplantes i jord og deres frø opsamles og screenes igen for at bekræfte mutant fænotype i M3 generation.
  5. Fjerne kontaminerende baggrunds mutationer ved tilbagekrydsning mindst tre gange til en vildtype-genomet eventuelt containing ønskede organel fluorescerende markør.
    1. Fra moderplanten, fjerne med fine saks eller pincet modne siliques, og åbne blomster.
    2. Fjerne knopper, som er for små fra meristem.
    3. Sæt spidsen af ​​en tang mellem kronblade og bægerblade at åbne en blomsterknop og fjerne alle støvknapper.
    4. Brug en tang tage en åben moden blomst fra faderen planten og gnid stoevknappernes om den stigmatisering af kastreret anlægget.

3. Kortlægning

Dette afsnit beskriver hovedsageligt, hvordan du tilknytter en recessiv mutation ved hjælp af en modificeret protokol fra Borevitz 9, som er hurtigere, hvis forhold til traditionelle kortlægningsmetoder 10,11. Denne fremgangsmåde anvender høj densitet oligonukleotid arrays med evnen til at detektere adskillige enkelt funktion polymorfismer (SFP'er) i et enkelt assay 12. Ved hjælp af Affymetrix Arabidopsis ATH1 GeneChip arrayet er muligt atanalysere omkring 24.000 gener. En pulje af F 2 individer viser mutation i sammenligning med en pulje af vildtype-F-2 anlæg indsamles i samme segregerende population. Derefter vil mutationen kortlægges i området, hvor den mutante puljen beriget for mutante genotype alleler og dermed i den samme region af vildtype-poolen vil resultere beriget med vild-type forælder alleler 13.

  1. Genomisk DNA (3 ug) ekstraheres fra den homozygote mutant Columbia (M3) under anvendelse af en Qiagen DNeasy Plant Mini Kit og sendes til Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sekventering.
  2. Den homozygote mutant Columbia (M3) krydses med Landsberg erecta til at generere en kortlægning befolkning.
  3. Kortlægning udføres på 70 op til 100 F2 individer viser afvigende fænotype og det samme antal af F2-planterne med en vildtype-fænotype.
  4. Indsaml fra hver plante et blad skive (0,60 mm) med en hulning. Denbladskivemetoden skal indsamles fra blade af samme alder at være sikker på at have de samme mængder af DNA. De prøver kan behandles for genomisk ekstraktion separat eller i grupper. I dette tilfælde er det muligt at indsamle 5-10 prøver for hver Eppendorf rør, så i sidste ende vil du have færre eppendorfrør, hvorfra genomisk DNA er at blive udtrukket.
  5. MasterPure Plant Leaf DNA Purification Kit (Epicentre) anvendes til at ekstrahere det genomiske DNA. Det genomiske DNA opnået fra hver prøve kvantificeres med en nanodrop.
  6. Den samme mængde af genomisk DNA fra hver prøve sættes derefter sammen til en i alt 300 ng (~ 30 uL) af planteceller DNA'er, tilsættes 60 uL 2,5 x tilfældige primere opløsning [125 mM Tris-HCI (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-mercaptoethanol, 750 ug / ml oligodeoxyribonucleotid primere (tilfældige octamerer)] (Bioprime kit), og 42 uL vand (slutvolumen 132 uL).
  7. Denaturere DNA ved> 95 ° C i 5 til 10 min.
  8. Cool på is.
  9. Hver denaturød DNA tilsættes 15 uL 10X dNTP mix med Biotin dCTP [1 mM biotin-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dTTP i 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), og komplet med 3 uL Klenow polymerase (Bioprime kit).
  10. Inkuber natten over ved 25 ° C.
  11. Den følgende dag, tilsaettes 15 uL 3 M NaOAc og 400 pi kold 100% EtOH; mix.
  12. Inkuber ved -80 ° C i 1 time, og derefter roterer ved 20.500 xg i 15 minutter, fjern supernatanten og vask med 500 uL kold 75% EtOH.
  13. Centrifugering ved 20.500 x g i 10 min.
  14. Tørre DNA pellets ved 37 ° C i 10 minutter og resuspender i 100 pi vand.
  15. Anvend 5 uL til at kontrollere udbytte og kvalitet på en gel (figur 2).
  16. Sende 95 pi mærkning reaktion for vildtype-og mutant for GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array hybridisering.
  17. De arrays scannes og. CEL opnåede filer analyseres ved hjælp af R-software ( http://www.r-project.org /).
  18. Installer R software, og derefter åbne programmet og indsæt følgende streng:
    kilde (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
    biocLite ()

    Tryk derefter på retur-tasten, dette vil installere standard biologisk leder pakkerne ( http://www.bioconductor.org ).
  19. I en ny mappe på skrivebordet, kan du downloade fra følgende websted ( http://www.naturalvariation.org/methods ) filerne:
    readcel.R
    SFP.R
    Map.R
    ath1V5.RData
    ColLerCEL.zip
    Filen ColLerCEL.zip skal pakkes ud, og de ​​resulterende filer indsat i din nye mappe.
  20. Omdøb data fra din GeneChip eksperimentet i wildtype.CEL og mutant.CEL.
  21. Kopier nu dine GeneChip data (wildtype.CEL ogmutant.CEL) ind i din mappe.
  22. Open R, a) til Mac: Klik på "Diverse", og klik derefter på "Skift arbejde mappe." b) til PC: Klik på "File" og derefter "Skift mappe"
  23. a) for Mac: Vælg den mappe, der indeholder filerne. Klik på "Workspace", "Load arbejdsplads fil" og vælg ath1V5.RData, b) for PC: Vælg den mappe, der indeholder filerne ovenfor, klik på "Filer", derefter "Load arbejdsplads" og vælg ath1V5.RData.
  24. Open readCEL.R bruger Notepad og kopiere hele teksten til R.
  25. Open SFP.R bruger Notepad og kopiere hele teksten til R.
  26. Open Map.R bruger Notepad og kopiere hele teksten til R.
  27. I Console vinduet vil du se følgende besked:
    Kromosom X begrænser Mb yz
    Søg gener på tair indsæt dette link
    3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& Ende = z
  28. Kopier og indsæt linket i din internet browser. Et vindue vil dukke op og bede om at åbne eller gemme filen, skal du vælge Gem. Vælg et filnavn og vedhæft udvidelsen ". Xls", og klik derefter på Gem.
  29. Åbn filen ". Xls", hvor du kan finde koordinaterne for din mutant (resultatet grafisk i figur 3).
  30. Inden for det kortlagte område i den samlede Illumina læser af det muterede genom identificere specifikke EMS overgange 4 blandt de enkelte nukleotid polymorfier. Supplere mutant fænotype ved transformation med vildtype-genet (r) under anvendelse af standardprocedurer 15.

4. Repræsentative resultater

Figur 1 viser den strategi, der anvendes til identifikation af en mutant af den sekretoriske reaktionsvej ved anvendelse af konfokal mikroskopi screening. Figur 2 viser en typisk fremstilling af mærket genomisk DNA for arrayet hybridisering. I figur 3, et typisk resultat ventes efter analyse af de data fra GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array præsenteres.

Figur 1
Figur 1. Arabidopsis transgene planter, der udtrykker ssGFPHDEL (ER markør) (1) blev dyrket for at producere nok frø til EMS behandling (2). Frø behandlet med EMS blev derefter sået at generere M1 planter (3). Hver M1 anlæg repræsenterer en anden linje og frø blev indsamlet separat fra hver af dem. M2 frø blev udpladet på ½ MS substrat (4) og derefter screenet for defekter i ER morfologi ved konfokal mikroskopi (5). Under screeningen fandt vi planter, konserveret vildtype-ER morfologi (6) og planter, der viser defekte ER fænotyper (7). Disse planter blev dyrket til opnåelse af M3 generation og at bekræfte fænotype (8). Genomisk DNA fra M3 plante blev anvendt til Solexa Illumina sekventering (a). Den samme planteDer blev også anvendt til krydsninger med Ler-wt til opnåelse af F2 mapping population (b).

Figur 2
Figur 2. Bioprime tilfældige mærkningsreaktioner (5 pi 100 uL) blev fyldt på agarosegel 1%. Bane A er fra en pulje af vildtype-F2-planter, og bane B er fra en pulje af mutante F2-planter. (Marker er 1 Kb DNA-stige-N3232, fra NEB).

Figur 3
Figur 3. Figuren er et eksempel på kortlægning af Col-0 mutation hjælp GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array hybridisering. Mutationen i dette eksempel er placeret på kromosom 1, afgrænset af vertikale stænger. De vandrette streger repræsenterer de tærskler for detektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives en konfokal mikroskopi-baseret screening til identifikation af endomembrane mutanter. Denne fremgangsmåde kan let udvides til andre organeller i cellen, for hvilke specifikke fluorescerende protein markører er tilgængelige. Skærmen er baseret på identifikation af mutanter, der viser en afvigende fordeling af fluorescerende markør, enten i målet organel eller organeller, der ikke formodes at indeholde markør. Henholdsvis disse mutanter repræsenterer populationer, hvor enten evne organel til subcompartimentalize markøren er kompromitteret eller mutanter, der ikke korrekt translokere markør blandt organeller. Under screening vi bemærket, at nogle mutanter udviste en fænotype i tidlige udviklingstrin så tidligt som 7 dage efter spiring, men andre viste fænotype alene i et senere trin i udviklingen. Medens dette kan være knyttet til en række årsager, herunder udvikling-afhængig ekspression af det muteredeallel (er), antyder dette, at planterne skal undersøges på forskellige vækststadier (mindst 7 til 14 dage) for at sikre, at potentielt interessante mutanter ikke kasseres.

Den fremgangsmåde, der er beskrevet i denne protokol tillader os at kortlægge et gen i en relativt kort tid sammenlignet med den klassiske kortlægningsmetode. Faktisk kræver opsamling et tilstrækkeligt antal individer i populationen F2 anvendes til GeneChip Array en relativt lille mængde tid i forhold til F2-planter, der kræves for den klassiske fine kortlægningsproceduren. Men der er kritiske trin, der skal observeres. Udvælgelse af F2 udsnit af befolkningen, som viser, eller som ikke udviser fænotypen skal udføres omhyggeligt, da tilsætning af selv en lille antal af planter med den forkerte fænotype ved en fejltagelse kan indføre fejl i det endelige resultat. Dette er hovedsagelig forbundet med det faktum, at F2 population, der anvendes til den grove mapping er meget lille. Af denne grund, EIT udvælgelse af planter,hende vise eller ikke vise fænotype bør udføres hver gang på samme dag efter spiring. Dette er fordi, som vi har nævnt ovenfor, kan forekomsten af ​​fænotypen forbindes til vækst. Et andet vigtigt punkt at overveje, er at se nøje på den næste generation data postalignment, der genereres af programmer, der giver os vigtig information som procentdel af læser indeholder variant. Den teoretiske værdi forventet for en heterozygot variant er omkring 50%, dette betyder, at 50% af sekvenserne vil indeholde varianten mens en homozygot variant, er ca 100%. Uheldigvis situationen efter en postalignment kan være langt fra den teoretiske værdi, nemlig andelen af læser indeholdende variant for heterozygote kan variere fra 20 til 80%, mens fra 60 til 100% for homozygot 16. Derfor, for ikke at gå glip centrale enkeltnucleotid-polymorfier (SNP), er det vigtigt at ikke at skille mutanter med mindre end 100% i procent af reannoncer for variant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender støtte fra Chemical Sciences, Geosciences og Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (tildeling antal DE-FG02-91ER20021) og National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Vi er taknemmelige for Karen Bird til redigering af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethylmethane sulfonate Sigma-Aldrich M0880
NaOH JT Baker 3722-05
Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins Phyto technolog laboratorie M404
Phytagel Sigma-Aldrich P8169-1Kg
RNeasy mini kit Qiagen 74104
Master pure plant leaf DNA purification kit Epicentre Biotechnologies MPP92100
Bioprime DNA labeling system Invitrogen 18094-011
Alcohol 200 proof Decon Laboratories 2716
NaOAc JT Baker
Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array Affymetrix 900385
Falcon tubes 50 mL Corning 430290
Eppendorf tubes 1.5 mL
Filter paper 90mm Whatman, GE Healthcare 1001090
Analytical Balance Mettler Toledo n.a
Nutating (wave) shaker Heidolph n.a
Centrifuge Eppendorf n.a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
  2. Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
  3. Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
  4. Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
  5. Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
  6. Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
  7. Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
  8. Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
  9. Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
  10. Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
  11. Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
  12. Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
  13. Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
  14. Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
  15. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
  16. Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).

Tags

Genetik EMS mutagenese Udskillelsen kortlægning konfokal screening
Fluorescens-mikroskopi Screening og næste generation sekventering: Nyttige værktøjer til identifikation af gener involveret i organel Integrity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stefano, G., Renna, L., Brandizzi,More

Stefano, G., Renna, L., Brandizzi, F. Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity. J. Vis. Exp. (62), e3809, doi:10.3791/3809 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter