Summary
בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר סינון הקרינה המיקרוסקופ מבוסס על שתילים ארבידופסיס ומתאר כיצד למפות מוטציות רצסיבי אשר משנים את חלוקת subcellular של סמן מסוים ניאון מתויג במסלול הפרשה. ארבידופסיס הוא מודל ביולוגי רב עוצמה למחקרים גנטיים בגלל גודל הגנום שלו, זמן דור, ושימור של המנגנונים המולקולריים בין הממלכות. מערך genotyping כגישה למפות מוטציה חלופה לשיטה המסורתית המבוססת על סמנים מולקולריים יש יתרון משום שהוא הוא יחסית מהיר יותר עשוי לאפשר מיפוי של מוטציות מספר פרק זמן קצר מאוד. שיטה זו מאפשרת זיהוי של חלבונים אשר יכולים להשפיע על שלמות אברון כל בצמחים. הנה, לדוגמה, אנו מציעים מסך לגנים מפת חשובים שלמות של reticulum endoplasmic (ER). הגישה שלנו, לעומת זאת, ניתן להרחיב בקלות אברונים תאים אחרים צמחים(לדוגמה לראות 1,2), ובכך מייצג צעד חשוב לקראת הבנת הבסיס המולקולרי השולט מבנים subcellular אחרים.
Protocol
1. EMS טיפול
זרעים thaliana ארבידופסיס הם mutagenized משתמש כמו sulfonate mutagen אתיל מתאן סוכן (EMS) 3,4, אשר מעוררת את ה-C-ל-T משתנה הגנום וכתוצאה מכך C / G ל T / A מוטציות 5-7.
- שוקל 0.8 גרם זרעי ארבידופסיס (~~~HEAD=NNS 40,000 זרעים) הנושאים את הסמן ניאון אברון (באופן ספציפי, במחקר זה ssGFPHDEL (רצף ה-GFP-HDEL האות tetrapeptide) שימש כסמן ER).
- להעביר את הזרעים צינור פלקון 50 מ"ל, ואז מוסיפים 25 מ"ל מים מזוקקים.
- להוסיף 0.2% (V / V) sulfonate אתיל מתאן.
- דגירה של 16 שעות על nutating המיקסר במהירות נמוכה.
- לשאוב את הנוזלים וזורקים אותו לתוך בקבוק המכיל 1.0 M NaOH להשבית EMS.
- הוסף 25 מ"ל מים לצינור פלקון המכיל את הזרעים, קרוב, ללא מרחב זה 5 פעמים לשטוף את הזרעים; לחכות עד שכל הזרעים יכולים להגיע, אז לשאוב מים וזורקים לתוך M 1.0 Na OH הבקבוק.
- חזור על השלב כביסה עד 10 פעמים.
- לאחר שטיפה של דבר, שוב להשעות את הזרעים בכמות מינימלית של מים.
- המשך עיקור זרע הוספת 25 מ"ל של אקונומיקה 10%, לנער במרץ ל -30 זה. בואו זרעים להתיישב למטה, ואז לשפוך את אקונומיקה ולשטוף עם 25 מ"ל של מים סטריליים. יוצקים מעל מים סטריליים ולהוסיף 25 מ"ל אתנול 70%. ללחוץ על צינורות של 30. בואו זרעים להתיישב למטה. יוצקים את אתנול ולשטוף עם 25 מ"ל של מים סטריליים. חזור פעמיים לשטוף עם מים סטריליים, ואז לשפוך זרעים על צלחת פטרי פלסטיק המכיל 3 נייר פילטר MM ולתת יבש מתחת למכסה המנוע. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
- צלחת את הזרעים על ½ MS phytagel (ריכוז חצי בינוני Murashige ו Skoog), 150 מ"מ צלחת פטרי (~~~HEAD=NNS 250-300 הזרעים צלחת).
- לגדול זרעים M1 על צלחת 2 שבועות, ולאחר מכן השתלת לתוך האדמה.
- איסוף זרעים מצמחים מסוג M2 M1 בודדים ליצור קווים M2 (1000 שורות עצמאיים).
בחלק זה אנו מתארים את התצפית של שתילים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או כמתואר לעיל 8.
- שישים זרעים של כל קו M2 גדלים במשך 7 עד 10 ימים פלסטיק צלחות פטרי, ½ MS phytagel, על אותה צלחת גדלים גם 5 שתילי-EMS מטופלים (שליטה).
- חמש עד עשר cotyledons מורכבים עם הצד abaxial לכיוון העדשה (40X) בשקופית המיקרוסקופ המצורף coverslip.
- כל טבורית הוא ציין, בין קליפת המוח באזור המדיאלי, תחת הקרינה להפצה בכל subcellular שונה של הסמן אברון.
- צמחים חיוביים מושתלים לתוך האדמה וזרעי שלהם נאספים הוקרן שוב כדי לאשר את פנוטיפ מוטנטי בדור M3.
- הסרת מזהמים מוטציות רקע דרך backcrossing לפחות שלוש פעמים כדי הגנום wild-type לשתף ואוליntaining את הסמן הרצוי אברון ניאון.
- מצמח האם, בעזרת מספריים עדינים או מלקחיים להסיר siliques בוגרים, פרחים פתוחים.
- הסר את בלוטות כי הם קטנים מדי מן meristem.
- הכנס את קצה זוג אחד מלקחיים בין עלי הכותרת ואת עלי גביע לפתוח 1 ניצן הפרח ולהסיר את כל המאבקים.
- באמצעות זוג מלקחיים לקחת פרח בוגרת פתוח מצמח האב לשפשף את המאבקים על הסטיגמה של הצמח מסורס.
3. מיפוי
סעיף זה מתאר למעשה כיצד למפות מוטציה רצסיבית באמצעות פרוטוקול שונה מ Borevitz 9 שהוא מהיר יותר אם לעומת שיטות מיפוי מסורתיות 10,11. גישה זו להשתמש צפיפות גבוהה מערכי oligonucleotide את היכולת לזהות מספר רב של פולימורפיזמים תכונה אחת (SFPs) ב assay אחת 12. שימוש ATH1 ארבידופסיס Affymetrix מערך GeneChip ניתןלנתח כ 24,000 גנים. מאגר של F 2 אנשים המציגים את המוטציה משווים למאגר של wild-type f 2 צמחים שנאספו בקרב האוכלוסייה לבודד אותה. לאחר מכן, מוטציה ימופו באזור שבו בריכת מוטציה בו מועשרת עבור אללים מוטנטים גנוטיפ ולכן באותו אזור הבריכה wild-type תגרום מועשר עבור wild-type אללים הוריות 13.
- הדנ"א הגנומי (3 מיקרוגרם) מופק הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) באמצעות DNeasy Qiagen ערכת מיני הצומח מוגש על הגנום Illumina Analyzer II (II GA) 14 סידור.
- הומוזיגוטים מוטציה קולומביה (M3) הוא חצה עם לנדסברג erecta ליצור מיפוי האוכלוסייה.
- המיפוי מבוצע על 70 עד 100 אנשים F2 מראה פנוטיפ סוטה ואת אותו מספר של צמחים F2 פנוטיפ עם wild-type.
- איסוף מצמח כל דיסק עלה (0.60 מ"מ) באמצעות אגרוף חור.הדיסק עלה יש לאסוף מן העלים באותו גיל כדי להיות בטוח יש כמויות דומות של DNA. דוגמאות ניתן לעבד להפקת הגנומי בנפרד או בקבוצות. במקרה זה, ניתן לאסוף דגימות 5-10 עבור כל צינור Eppendorf כך שבסופו של דבר יהיה לך פחות צינורות eppendorf שממנו הדנ"א הגנומי יש צורך לעקור.
- ליף MasterPure הצמח DNA טיהור Kit (Epicentre) משמש כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי. ה-DNA הגנומי להשיג מדגם זה היא לכמת עם nanodrop.
- אותה כמות של הדנ"א הגנומי מכל מדגם לאחר מכן, ביחד עד לסך של 300 ננוגרם (~ 30 μL) של DNAs צמחים, מוסיפים 60 μL פתרון primers 2.5x אקראית [125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 מ"מ MgCl2, 25 מ"מ 2-mercaptoethanol, 750 מיקרוגרם / primers oligodeoxyribonucleotide מ"ל (octamers אקראיים)] (Bioprime בערכה) ו 42 מים μL (μL הסופי נפח 132).
- לפגל DNAs ב> 95 ° C במשך 5 דקות עד 10.
- מגניב על הקרח.
- זה denatuאדום DNA להוסיף 15 μL תערובת dNTPs 10X עם ביוטין dCTP [1 mM ביוטין-14-dCTP, 1 mM dCTP, 2 מ"מ dATP, 2 מ"מ dGTP, 2 מ"מ dTTP ב 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime הערכה), ולהשלים עם פולימראז 3 Klenow μL (ערכת Bioprime).
- דגירה לילה של 25 ° C.
- למחרת, להוסיף 15 μL 3 מ 'ו 400 NaOAc μL EtOH 100% קר, ומערבבים.
- דגירה ב -80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן להסתובב ב XG 20,500 במשך 15 דקות, להסיר supernatant, ולשטוף עם EtOH μL 500 75% קר.
- מסובבים XG 20,500 עבור 10 דקות.
- דנ"א כדורי יבש ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו resuspend במים 100 μL.
- השתמש 5 μL לבדוק התפוקה והאיכות על ג'ל (איור 2).
- שלח 95 μL של תיוג תגובה עבור פראי סוג של מוטציה GeneChip הכלאה ATH1 ארבידופסיס הגנום המערך.
- מערכים את נסרקים ואת. CEL קבצים שהתקבלו מנותחות באמצעות תוכנת R ( http://www.r-project.oRG /).
- התקנת תוכנה R, ולאחר מכן פתח את התוכנית ולהדביק את המחרוזת הבאה:
המקור (" http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
לאחר מכן לחצו על מקש החזרה, זה להתקין את החבילות Bioconductor סטנדרטיים ( http://www.bioconductor.org ). - בתיקייה חדשה על שולחן העבודה, להוריד מאתר האינטרנט הבא ( http://www.naturalvariation.org/methods ) את הקבצים:
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
ColLerCEL.zip הקובץ יש פרקה את הקבצים המתקבלים להדביק את התיקיה החדשה. - שנה שם את הנתונים שהתקבלו בניסוי GeneChip שלך wildtype.CEL ו mutant.CEL.
- עכשיו להעתיק נתונים GeneChip שלך (wildtype.CEL וmutant.CEL) לתוך התיקיה שלך.
- פתח ר ', א) עבור Mac: לחץ על "שונות", ולאחר מכן לחץ על "מדריך שינוי עבודה." ב) עבור ה-PC: לחץ על "קובץ" ואז "מדריך שינוי"
- א) עבור Mac: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים. לחץ על "סביבת עבודה", "סביבת עבודה קובץ טען" ובחר ath1V5.RData, ב) עבור ה-PC: בחר את התיקייה המכילה את הקבצים הנ"ל, לחץ על "קובץ" ואז "טען סביבת עבודה" ובחר ath1V5.RData.
- ReadCEL.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר '
- SFP.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר '
- Map.R פתח באמצעות Notepad ולהעתיק את כל הטקסט ר '
- בחלון מסוף תראה את ההודעה הבאה:
כרומוזום X מגביל Mb YZ
גנים החיפוש תאיר ולהדביק בקישור הזה
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& בסוף = Z - העתק והדבק את הקישור בדפדפן האינטרנט שלך. יופיע חלון ולבקש לפתוח או לשמור את הקובץ, עליך לבחור לשמור. בחר שם הקובץ ולצרף את הסיומת ". Xls," ולאחר מכן לחץ על שמור.
- פתח את הקובץ ". Xls" שבו אתה יכול למצוא את הקואורדינטות של מוטציה שלך (התוצאה מוצגת באופן גרפי באיור 3).
- בתחום ממופה ב Illumina התאספו קורא הגנום המוטנטי לזהות ספציפיים מעברים צוות האמבולנס 4 בין פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודד. להשלים את פנוטיפ מוטנטי של הגן עם השינוי בסוג בר (ים) באמצעות הליכים רגילים 15.
4. נציג תוצאות
איור 1 מציג את הגישה המשמש זיהוי מוטציה של מסלול הפרשה באמצעות הקרנת מיקרוסקופיה confocal. תרשים 2 מציג הכנה טיפוסי של ה-DNA הגנומי שכותרתו עבור מערך ההכלאה. ב 3 דמות, תוצאה אופיינית צפוי לאחר ניתוח נתונים המתקבלים מערך ארבידופסיס GeneChip הגנום ATH1 מוצג.
באיור 1. הצמחים הטרנסגניים ארבידופסיס המבטאים ssGFPHDEL (ER סמן) (1) עובדו כדי לייצר זרעים מספיק עבור EMS טיפול (2). זרעים שטופלו EMS נזרעו אז כדי לייצר צמחים M1 (3). כל צמח M1 מייצג קו שונה זרע נאספו בנפרד כל אחד מהם. זרע M2 היו מצופה על מצע MS ½ (4) ו הוקרן מכן על ידי מיקרוסקופ confocal (5) על פגמים מורפולוגיה ER. במהלך ההקרנה מצאנו צמחים שימור מורפולוגיה wild-type ER (6), צמחים המראים פגומים פנוטיפים ER (7). צמחים אלו גדלו להשיג את הדור M3 ו לאשר את הפנוטיפ (8). הדנ"א הגנומי מצמח M3 שימש Solexa Illumina רצף (א). אותו צמחשימש גם צלבים עם הימלר-WT לקבל מיפוי האוכלוסייה F2 (ב).
2. איור Bioprime אקראיים תיוג תגובות (5 μL של μL 100) הועמסו על 1% agarose ג'ל. ליין היא מתוך מאגר של צמחי הבר מסוג F2, וליין B היא מתוך מאגר של צמחים מוטנטים F2. (דה מרקר הוא 1 Kb DNA הסולם-N3232, החל חוד).
איור 3. דמות מייצגת דוגמה מיפוי של מוטציה Col-0 ארבידופסיס באמצעות GeneChip ATH1 הגנום הכלאה המערך. מוטציה בדוגמה זו ממוקמת על תחום כרומוזום 1, על ידי קווים אנכיים. הסורגים האופקיים מייצגים את סף לצורך זיהוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן תיארנו ההקרנה confocal מיקרוסקופיה מבוססת על זיהוי של מוטציות endomembrane. גישה זו ניתן להרחיב בקלות אברונים אחרים של התא עבורו סמנים ספציפיים חלבון פלואורסצנטי הזמינים. המסך מבוסס על זיהוי של מוטנטים המציגים התפלגות חריגה של סמן פלואורסצנטי בין אם אברון היעד או אברונים שאינם אמורים להכיל את הסמן. בהתאמה, מוטציות אלה מייצגים אוכלוסיות בו גם את היכולת של אברון כדי subcompartimentalize סמן נפגעת או מוטציות שלא ניתן כראוי translocate את הסמן בין האברונים. במהלך ההקרנה שמנו לב כמה מוטציות הראה פנוטיפ בשלבי פיתוח מוקדמים כבר ב -7 ימים לאחר הנביטה, אך אחרים הראו את הפנוטיפ רק בשלב מאוחר יותר של התפתחות. אמנם זה עשוי להיות קשור ממספר סיבות, כולל ביטוי פיתוח תלות של מוטציהאלל (ים), זה מצביע על כך הצמחים יש לבחון בשלבי צמיחה שונים (לפחות 7 עד 14 ימים) כדי להבטיח מוטנטים מעניינים פוטנציאל לא מבוטלים.
הגישה המתוארת פרוטוקול זה מאפשר לנו למפות את הגן בזמן קצר יחסית לעומת שיטת המיפוי הקלאסי. למעשה, איסוף מספר מספיק של אנשים באוכלוסייה F2 משמש מערך GeneChip דורש זמן כמות קטנה יחסית לעומת צמחים F2 נדרש הליך עדין מיפוי קלאסית. עם זאת, ישנם צעדים קריטיים כי יש לשים לב. מבחר דוגמאות האוכלוסייה F2 מראה או לא מראה פנוטיפ צריך להתבצע בזהירות, שכן תוספת של מספר קטן של צמחים ואפילו עם פנוטיפ הלא נכון בטעות יכול להציג את השגיאות על התוצאה הסופית. זה קשור בעיקר לעובדה כי אוכלוסיית F2 משמש מיפוי גס הוא קטן מאוד. מסיבה זו, בחירת צמחים eitעליה להראות או לא להראות את הפנוטיפ יש לנהל בכל פעם באותו יום לאחר הנביטה. הסיבה לכך היא, כפי שהזכרנו לעיל, את המראה של הפנוטיפ עשוי להיות קשור לצמיחה. נקודה חשובה נוספת שיש לקחת בחשבון הוא לבחון בזהירות postalignment יצירת הקובץ הבא, אשר מופק על ידי תוכניות שנותנים לנו מידע חשוב כמו אחוז קורא המכיל גרסה. הערך התיאורטי הצפוי גרסה הטרוזיגוטיים היא בסביבות 50%, משמעות הדבר היא כי 50% רצפי את יכיל גרסה ואילו עבור גרסה הומוזיגוטים, הוא בסביבות 100%. למרבה הצער המצב לאחר postalignment יכול להיות רחוק מן הערך התיאורטי, למעשה אחוז קורא המכיל גרסה של הטרוזיגוטיים יכול לנוע בין 20% ל 80 תוך 60-100% עבור 16 הומוזיגוטים. לכן, כדי לא לפספס את פולימורפיזמים מפתח נוקלאוטיד יחיד (SNP), חשוב לא לבטל מוטנטים עם אחוז פחות מ 100% מחדשמודעות עבור גרסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מכירים תמיכה על ידי למדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences החטיבה, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, משרד המדע, משרד האנרגיה של ארה"ב (מספר הפרס DE-FG02-91ER20021) ואת הקרן הלאומית למדע (MCB 0948584) (FB). אנו אסירי תודה על קרן בירד גב לעריכה את כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
