Summary
세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.
Abstract
이 프로토콜은 Arabidopsis 모종의 형광 현미경 기반 검사를 설명하고 분비 경로에서 특정 태그를 형광 마커의 subcellular 분포를 변경 열성 돌연변를 매핑하는 방법에 대해 설명합니다. Arabidopsis 때문에 자사의 게놈 크기의 유전자 연구를위한 강력한 생물 학적 모델이며, 생성 시간, 그리고 왕국 간의 분자 메커니즘의 보존. 분자 마커를 기반으로 전통적인 방법과 대안에 변이를 매핑하는 방식으로 genotyping 배열은 비교적 빠른 있기 때문에 유리하고 아주 짧은 기간에 여러 돌연변이의 매핑을 허용할 수 있습니다. 이 방법은 식물의 어떤 organelle의 무결성에 영향을 미칠 수있는 단백질의 식별이 가능합니다. 여기 예로, 우리는 endoplasmic reticulum (ER)의 무결성을위한 중요한지도 유전자에 대한 화면을 제안합니다. 우리의 접근법은 그러나, 쉽게 다른 식물 세포 organelles로 연장하실 수 있습니다(예를 들어 1,2 참조), 따라서 다른 subcellular 구조를 지배하는 분자 기초를 이해 향한 중요한 단계를 나타냅니다.
Protocol
1. EMS 치료
Arabidopsis thaliana의 씨앗은 T / 돌연변이 5-7로 C / G 그 결과 게놈 C - 투 - T 변화로 유도 mutagen 에이전트 에틸 메탄 산염 (EMS) 3,4로 사용 mutagenized됩니다.
- organelle 형광 마커를 (특히, 본 연구에서는 ssGFPHDEL는 (신호 시퀀스-GFP-HDEL tetrapeptide) ER 마커로 사용되었습니다) 운반 0.8 g Arabidopsis 종자를 (~ 40,000 씨앗) 무게.
- 50 ML 팔콘 튜브의 씨앗을 전송 후 25 ML 증류수를 추가합니다.
- 0.2 % (V / V) 에틸 메탄 산염을 추가합니다.
- 낮은 속도로 믹서를 nutating 16 번 시간 동안 알을 품다.
- 액체를 대기음 및 1.0 M NaOH는 EMS를 inactivate이 포함된 플라스크에 그 파일을 삭제.
- 가까이, 씨앗을 포함 팔콘 튜브 25 ML 물을 추가하고 5 번 반전을 씨앗을 씻어, 모든 씨앗이 정착 때까지 기다려 다음, 1.0 M 나에 물을 대기음 및 폐기 플라스크, 오하이오.
- 최대 10 배까지 세정 단계를 반복합니다.
- 최종 세척 후에 물을 최소한의 금액에 씨앗을 다시 일시 중지합니다.
- 10 % 표백제의 25 ML 추가 종자 살균을 진행, 30 s에 대한 노골적인 악수. 다음 표백제를 부어 및 멸균 물의 25 ML와 린스, 씨앗 하단으로 정착합시다. 멸균 물을 붓고 25 ML 70 % 에탄올을 추가합니다. 30의 위해 튜브를 흔들어. 씨앗이 하단으로 정착합시다. 에탄올을 붓고 멸균 물의 25 ML와 린스. 다음 3 MM 여과지를 포함하는 플라스틱 배양 접시에 씨앗을 붓다, 그리고 후드를 건조하게 두 번 멸균 물로 세탁을 반복합니다. 2 일간 4 ° C에서 저장.
- ½ MS phytagel (Murashige와 Skoog 매체의 절반 농도), 150 mm 페트리 접시 (접시 ~ 250-300 씨앗)에서 플레이트 씨앗.
- 2 주 동안 접시에 M1 씨앗을 재배 후 토양에 이식.
- M2 라인 (1000 독립 라인) 생성 개별 M1에서 M2 식물 종자를 수집합니다.
이 섹션에서 우리는 앞서 8 설명된대로 공촛점 또는 형광 현미경과 모종의 관찰에 대해 설명합니다.
- 각 M2 라인에서 육십 종자는 플라스틱 배양 접시에 7-10일, ½ MS phytagel 위해 재배되며, 동일한 접시에도 (제어) EMS-경과 다섯 모종을 재배하고 있습니다.
- 5 ~ 10 cotyledons는 현미경 슬라이드에 렌즈 (40X) 방면 abaxial 측면으로 탑재하고 coverslip과 함께 동봉합니다.
- 각 떡잎은 organelle 마커의 변경된 subcellular 분포에 대한 형광 아래 피질에서 중간 영역에, 관찰됩니다.
- 긍정적인 식물은 토양에 이식하고 씨를를 모으고 M3 세대에서 돌연변이 표현형 확인을 위해 다시 검사합니다.
- 아마도 공동 야생 형 유전자에 backcrossing 통해 배경 변이 오염 것은 적어도 세 번 제거원하는 organelle 형광 마커를 ntaining.
- 어머니는 공장에서 미세 가위 또는 집게를 사용하면 성숙 siliques을 제거하고, 개방 꽃.
- 분열 조직에서 너무 작은 봉오리를 제거합니다.
- 꽃잎이 한 꽃의 꽃봉오리를 열고 모든 anthers을 제거하는 sepals 사이 포셉 중 한 쌍의 팁을 넣습니다.
- 포셉 한 켤레를 사용하면 아버지는 공장에서 열린 성숙한 꽃을 가지고 emasculated 식물의 오명에서 anthers를 문지 르세요.
3. 매핑
이 섹션에서는 전통적인 매핑 방법 10,11 비교한다면 빠른 Borevitz 9 일부터 수정된 프로토콜을 사용하여 열성 돌연변를 매핑하는 근본적 방법을 설명합니다. 이 접근법은 하나의 분석 12 다양한 단일 기능 polymorphisms (SFPs)을 감지하는 능력과 고밀도 oligonucleotide 어레이를 사용합니다. Affymetrix의 Arabidopsis ATH1의 GeneChip 배열을 사용하면 가능합니다약 24,000의 유전자를 분석합니다. 변이를 보여주는 F 2 개인 수영장은 같은 segregating 인구 내에서 수집된 야생 - 타입 F 2 식물의 수영장과 비교됩니다. 그런 다음 돌연변이 돌연변이 수영장은 돌연변이 유전자형의 대립 유전자에 대한 풍부하고있는 지역에 매핑되며 결과적으로 같은 지역에서 야생 형 풀은 야생 형 부모 대립 유전자 13 풍부 해집니다.
- 게놈 DNA (3 μg)은 Qiagen DNeasy 공장 미니 키트를 사용하여 homozygous 돌연변 컬럼비아 (M3)에서 추출되며 Illumina 게놈 분석기 II (GA II) 14 시퀀싱을 위해 제출합니다.
- homozygous 돌연변 컬럼비아 (M3)은 매핑 인구를 생성하는 Landsberg erecta으로 건너됩니다.
- 매핑은 탈선 표현형 및 야생 형 표현형와 F2를 식물의 같은 숫자를 보여주는 70 최대 100 F2를 개인에 수행됩니다.
- 홀 펀치를 사용하여 잎 디스크 각 공장 (0.60 ㎜)에서 수집합니다.잎 디스크의 DNA와 유사한 금액을 가지고해야하는 같은 시대의 잎사귀로부터 수집되어야한다. 샘플은 게놈 추출 별도로 또는 그룹에 대해 처리할 수 있습니다. 이 경우, 그것은 결국 당신은 게놈 DNA를 추출되어야한다있는 적은 eppendorf 튜브가되도록 각 Eppendorf 튜브에 대해 5-10 샘플을 수집할 수 있습니다.
- MasterPure 식물 잎의 DNA 정제 키트 (Epicentre)은 게놈 DNA를 추출하는 데 사용됩니다. 각 시료로부터 얻은 게놈 DNA가 nanodrop로 계량합니다.
- 각 샘플의 게놈 DNA의 동일한 수량 그러면 식물 DNAs 300 NG (~ 30 μL)의 합계를 함께 넣어되며 60 μL 2.5X 무작위 primers 솔루션을 추가 [125 MM 트리스-HCL (산도 6.8), 12.5 MM MgCl2, 25 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올은 750 μg / ML oligodeoxyribonucleotide의 primers (무작위 octamers] Bioprime 키트) 42 μL 물 (최종 부피 132 μL).
- 변성의> 95시 DNAs ° C에서 5-10 분.
- 얼음 쿨.
- 각 denatu으로붉은 DNA는 비오틴 dCTP [1 MM 비오틴-14-dCTP, 1 ㎜ dCTP, 2 MM dATP, 2 개의 MM dGTP, 10 MM 트리스-HCL 2 밀리미터 dTTP (산도 7.5), 1 ㎜ Na2EDTA]와 15 μL 10X dNTPs 믹스를 추가 (Bioprime 키트), 3 μL의 Klenow 효소 (Bioprime 키트)를 완료합니다.
- 25 ° C.에 하룻밤 사이에 품어
- 믹스, 그 다음날, 15 μL 3 M NaOAc 400 μL 차가운 백퍼센트 EtOH를 추가합니다.
- 1 시간 -80 ° C에서 부화 후 15 분에 해당하는 20,500 XG에 스핀, 뜨는 제거, 500 μL 감기의 75 % EtOH로 씻는다.
- 10 분 동안 20,500 XG에 봐.
- 100 μL 물에 10 분 및 resuspend위한 37 ° C에서 건조 DNA의 알약.
- 겔 (그림 2)에서 수확량과 품질을 확인하는 5 μL를 사용합니다.
- 를위한 야생 유형 및 돌연변이 GeneChip의 Arabidopsis ATH1의 게놈 배열 하이브 리다이 제이션에 대한 반응을 레이블링의 95 μL를 보냅니다.
- R 소프트웨어 (사용하는 배열을 스캔하고 취득. CEL 파일을 분석하고 http://www.r-project.o을RG /).
- R이 소프트웨어를 설치 후 프로그램을 열고 다음과 같은 문자열을 붙여 넣습니다 :
소스 ( " http://bioconductor.org/biocLite.R ")
biocLite ()
그런 다음 리턴 키 이것이 표준 Bioconductor 패키지 (설치 누르십 http://www.bioconductor.org ). - 바탕 화면에 새 폴더에서 다음 웹사이트 (에서 다운로드 http://www.naturalvariation.org/methods ) 파일 :
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
파일 ColLerCEL.zip은 풀었 및 결과 파일은 새 폴더에 붙여넣어야합니다. - wildtype.CEL 및 mutant.CEL에 GeneChip 실험에서 얻은 데이터를 바꿉니다.
- 귀하의 GeneChip 데이터를 지금 복사 (wildtype.CEL과해당 폴더로 mutant.CEL).
- 오픈 R, Mac 용)을 누른 다음 "기타"그리고 "변경 작업 디렉토리"를 클릭하십시오. b)는 PC 용 : 클릭 "파일"다음 "변경 디렉토리"
- Mac 용) :이 파일이 포함된 폴더를 선택합니다. "작업 영역", "로드 작업 영역 파일을 클릭하십시오 :"다음 "파일,로드 작업 공간"을 "PC를 선택 ath1V5.RData, B)을 위의 파일이 들어있는 폴더를 선택하고"및 ath1V5.RData를 선택합니다.
- 오픈 readCEL.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사
- 오픈 SFP.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사
- 오픈 Map.R는 메모장을 사용하고 R.에 대한 전체 텍스트를 복사
- 콘솔 창에서는 다음과 같은 메시지가 나타납니다 :
염색체 X는 MB yz을 제한
테어의 검색 유전자는이 링크를 붙여 넣습니다
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y& 끝 = Z - 인터넷 브라우저에 링크를 복사하여 붙여 넣습니다. 창이 표시하고 파일을 열거나 저장 물을 것이다, 당신은 저장을 선택합니다. 파일 이름을 선택하고 확장자를 첨부. "XLS는"다음 저장을 누릅니다.
- 파일을 열고 당신의 돌연변이에 대한 좌표를 (결과가 그래픽으로 그림 3에 표시됩니다) 찾을 수 있습니다. "XLS".
- 조립 Illumina의 매핑된 영역에서 돌연변이 게놈의 읽습 단일 염기 polymorphisms 중 특정 EMS 전환 할 4 식별합니다. 표준 절차 15을 사용하여 야생 형 유전자 (들)과 변형에 의해 돌연변이 표현형을 보완.
4. 대표 결과
그림 1은 공촛점 현미경 검사를 사용하여 분비 경로의 돌연변이의 식별에 사용되는 방식을 보여줍니다. 그림 2는 배열 하이브 리다이 제이션을위한 분류 게놈 DNA의 일반 준비를 보여줍니다. 그림 3, GeneChip의 Arabidopsis ATH1의 게놈 배열에서 얻은 데이터가 제공됩니다 분석하여 예상 전형 결과에서.
ssGFPHDEL (ER 마커) (1) 표현 그림 1. Arabidopsis 형질 전환 식물은 EMS 치료 (2) 충분한 씨앗을 생산하기 위해 재배되었다. EMS로 치료 씨앗 후 M1 식물 (3)을 생성 sown되었다. 각 M1 식물은 다른 라인을 대표하고 씨앗이 각각 별도로 수집되었다. M2 씨앗이 ½ MS 기판 (4)에 도금 후 공촛점 현미경 (5)에 의해 응급실의 형태학의 결함에 대한 상영되었다. 심사하는 동안 우리는 야생 형 응급실의 형태 (6) 및 결함 응급실 phenotypes (7)를 표시 식물을 보존하는 식물을 발견. 이 공장이 M3 세대를 얻기 위해 그리고 표현형 (8)를 확인하기 위해 성장했다. M3 공장에서 게놈 DNA가 Solexa Illumina 시퀀싱 ()에 사용되었다. 같은 공장또한 F2 매핑 인구 (B)을 구하는 데 Ler-wt있는 십자가를 위해 사용되었다.
그림 2. Bioprime 무작위 분류 반응 (100 μL의 5 μL)는 아가로 오스 겔 1 %로드되었습니다. 레인은 야생 형 F2 식물 풀에서이며, 차선 B는 돌연변 F2 식물의 풀에서입니다. (마커 코에서 1 KB DNA를 사다리-N3232입니다.)
그림 3. 그림 GeneChip의 Arabidopsis ATH1 게놈 배열 하이브 리다이 제이션을 사용하여 열-0 변이의 매핑의 예를 나타냅니다. 이 예제에서 변이는 수직 막대기에 의해 염색체 1, 구분된에 있습니다. 가로 막대는 검출을위한 임계값을 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기 endomembrane의 돌연변이의 식별을 위해 공촛점 현미경 기반 검사를 설명했다. 이 접근법은 쉽게 특정 형광 단백질 마커를 사용할 수있는 세포의 다른 organelles로 연장하실 수 있습니다. 화면이 대상 organelle이나 마커를 포함해야하지 않는 organelles로 중 형광 마커의 탈선 분포를 보여 돌연변이의 신분에 따라 달라집니다. 각각 이러한 돌연변 마커를 subcompartimentalize하기 organelle의 능력 중 하나가 손상되는 인구 않거나 제대로 organelles 중에서 마커를 이동시키다 수없는 돌연변이를 나타냅니다. 심사 기간 동안 우리는 어떤 뮤턴트 이르면 칠일 발아 후 빠르면 개발 단계 표현형을 보여주 것으로 파악되지만, 다른 단지 개발 이후 단계에 표현형을 보여주었다. 이것은 변이된 개발 종속적인 표현을 포함한 여러 가지 이유로 연결할 수 있지만allele (들),이 식물은 잠재적으로 흥미있는 돌연변이 삭제되지 않도록 보장하기 위해 (적어도 7~14일) 다른 성장 단계에서 검토되어야한다고 제안합니다.
이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 우리가 전통적인 매핑 방법에 비해 비교적 짧은 시간에 유전자를 매핑할 수 있습니다. 사실, GeneChip 배열에 사용 F2 인구의 개인의 충분한 번호를 수집하는 것은 고전적인 미세 매핑 절차에 필요한 F2를 식물에 비해 상대적으로 작은 양의 시간을 필요로합니다. 그러나 관찰해야 중요한 단계가 있습니다. F2 인구 표본 게재 여부 표현형를 보여주는 선정은 최종 결과에 오류를 소개할 수있는 실수로 잘못된 표현형과 식물 심지어 소수의 추가 때문에, 신중하게 진행되어야한다. 이것은 주로 거친 매핑에 사용되는 F2 인구가 매우 작다는 사실에 링크되어 있습니다. 이러한 이유로, 그 식물의 선택 eit그녀는 표시하거나 표현형는 발아 후 당일에 매번 실시해야 표시되지 않습니다. 우리가 위에서 언급한대로, 표현형의 모양이 발전에 연결될 수 있기 때문입니다. 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 우리에게 변종을 포함하는 읽기의 비율과 같은 중요한 정보를 제공하는 프로그램에 의해 생성되는 차세대 데이터 postalignment, 자세히 봐 것입니다. heterozygous 변형에 대한 기대 이론적인 값이 50 % 가량,이 homozygous 변종에 대해 100 % 경있는 동안 시퀀스의 50 %가 변종을 포함하는 것을 의미합니다. 불행히도 postalignment 이후 상황은, 이론 값에서 멀리 될 수 있습니다 실제로 heterozygous에 대한 변종을 포함 읽습의 비율은 20~80% homozygous 16 100 60부터 한동안 %에서 다를 수 있습니다. 따라서 순서대로 키를 단일 염기 polymorphisms (SNP)를 놓치지 않도록, 그것은 다시 미만 100 %의 비율로 돌연변이를 삭제하지 않는 것이 중요변형에 대한 광고.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실, 에너지의 미국과 (보너스 번호 DE-FG02-91ER20021) 및 국립 과학 재단 (MCB 0,948,584) (FB)의 사무실에 의해 지원을 인정합니다. 우리는 원고를 편집 미스 카렌 버드에 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , Forthcoming (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
